醫(yī)療器械無菌檢查

1醫(yī)療器械-無菌檢查

江蘇省醫(yī)療器械檢驗所

2主要內(nèi)容無菌定義及無菌檢查定義無菌檢驗依據(jù)試驗主要設(shè)備實驗環(huán)境條件及人員要求培養(yǎng)基種類及配制要求培養(yǎng)基適用性檢查試驗菌種及菌液制備無菌檢查方法驗證供試品無菌檢查及結(jié)果判斷

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無菌定義:無活微生物的狀態(tài)。無菌檢查定義：無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。（1）無菌定義4

（2）無菌檢驗依據(jù)本規(guī)范選用于《中國藥典》2010年版二部附錄XIH無菌檢查法。GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法，第二部分：生物試驗方法中規(guī)定的無菌試驗方法。5（3）試驗主要設(shè)備超凈工作臺細菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱立式高壓蒸汽滅菌器臺式高壓蒸汽滅菌器顯微鏡生物安全柜電熱恒溫干燥箱集菌儀6

試驗儀器（1）-超凈工作臺7

試驗設(shè)備（2）--隔水式恒溫培養(yǎng)箱8

試驗設(shè)備（3）----霉菌培養(yǎng)箱9試驗設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器10試驗設(shè)備（5）--臺式蒸汽滅菌器11試驗設(shè)備備（6）--顯微鏡鏡12試驗設(shè)備備（7）-生物安全全柜13試驗設(shè)備備（8）Equinox全自動無無菌檢驗驗系統(tǒng)14（4）實驗環(huán)環(huán)境條件件要求：：無菌檢查查應在環(huán)環(huán)境潔凈凈度10000級下的局局部潔凈凈度100級的單向向流空氣氣區(qū)域內(nèi)內(nèi)或隔離離系統(tǒng)中中進行，，其全過過程必須須嚴格遵遵守無菌菌操作，，防止微微生物污污染。單單向流空空氣區(qū)、、工作臺臺面及環(huán)環(huán)境應定定期按《醫(yī)藥工業(yè)業(yè)潔凈室室(區(qū))懸浮粒子子、浮游游菌和沉沉降菌的的測試方方法》的現(xiàn)行國國家標準準進行潔潔凈度驗驗證。隔隔離系統(tǒng)統(tǒng)按相關(guān)關(guān)的要求求進行驗驗證，其其內(nèi)部環(huán)環(huán)境的潔潔凈度須須符合無無菌檢查查的要求求。15（4）實驗人員員要求：：菌檢人員員必須具具備微生生物專業(yè)業(yè)知識，，并經(jīng)過無菌菌技術(shù)培培訓。16（5）培養(yǎng)基基種類及要要求硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基改良馬丁丁培養(yǎng)基基2012年12月1717（5）培養(yǎng)基基種類及要要求無菌檢查查：硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基2012年12月1818（5）培養(yǎng)基基種類及要要求無菌檢查查：改改良馬丁丁培養(yǎng)基基：19（5）培養(yǎng)基基種類及要要求保存時間間：制備好的的培養(yǎng)基基應保存存在：2℃～25℃、、避光非密閉容容器中：：一般在在三周內(nèi)內(nèi)使用密閉容器器中：一一般可在在一年內(nèi)內(nèi)使用20（5）培養(yǎng)基基種類及要要求一般采用用商品脫脫水培養(yǎng)養(yǎng)基，臨用時按按照使用用說明書書進行配配制，配配制時須須迅速，，以免吸吸潮影響響稱量的的準確性性，同時時需注意意滅菌后后培養(yǎng)基基的pH值應符合規(guī)規(guī)定，否否則必須須校正后后滅菌使使用。新鮮配制制的培養(yǎng)養(yǎng)基，應應符合《中國藥典典》規(guī)定的配配方，對對培養(yǎng)基基進行挑挑選。21（5）培養(yǎng)基基種類及要要求硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)基：屬于流體體培養(yǎng)基基，即在在液體培培養(yǎng)基中中加入0.05%～0.07%的瓊脂，增加了了培養(yǎng)基基的粘度度，降低低培養(yǎng)基基中的含含氧量，，使培養(yǎng)養(yǎng)基在一一段時間間內(nèi)保持持厭氧的的條件，，有利于于厭氧菌菌的生長長。硫乙乙醇酸鹽鹽培養(yǎng)基基分裝在在適宜的的容器中中，其粉粉紅色的的氧化層適合需氣氣菌的生生長，在在供試品品接種前前，培養(yǎng)養(yǎng)基的氧氧化層的的顏色不不得超過過培養(yǎng)基基深度的的1／5，調(diào)PH值滅菌后后為7.1±±0.2，分裝，，滅菌。。硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)管置：：30～35℃培養(yǎng)14天。22（5）培養(yǎng)基基種類及要要求改良馬丁丁培養(yǎng)基基：取培養(yǎng)基基成分混混合，微微溫溶解解，調(diào)節(jié)節(jié)PH值約為6.8，煮沸，，搖勻，，調(diào)PH值滅菌后后為6.4±±0.2，分裝，，滅菌。。改良馬丁丁培養(yǎng)基基：置23～28℃培養(yǎng)14天。23（5）培養(yǎng)基基種類及要要求培養(yǎng)基裝裝量：對于采用用直接接接種法檢檢查的液體樣品，培培養(yǎng)基的的裝量與與供試品品裝量相相關(guān)，應應根據(jù)供供試品接接種量確確定培養(yǎng)養(yǎng)基的裝裝量，使使供試品品接種體體積不大大于培養(yǎng)養(yǎng)基的10%。對于采用用直接接接種法檢檢查的固體樣品，培培養(yǎng)基的的裝量均均為100ml；一次性性醫(yī)用材材料及醫(yī)醫(yī)療器具具，若醫(yī)醫(yī)療器具具體積過過大，培培養(yǎng)基的的裝量可可2000ml以上，已已將其完完全浸沒沒為準。。對于采用用薄膜過濾濾法檢查的樣樣品，封封閉式薄薄膜濾器器的培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量為100ml。24（6）培養(yǎng)基適適用性檢檢查新購的培培養(yǎng)基或或自配的的新鮮培培養(yǎng)基要要求：無菌性檢檢查：每批培養(yǎng)養(yǎng)基隨機機取不少少于5支（瓶）），培養(yǎng)養(yǎng)14天，應無無菌生長長。靈敏度檢檢查：其質(zhì)量均均應符合合靈敏度檢檢查要求求。用于培培養(yǎng)基靈靈敏度檢檢查的菌菌種如下下：菌種種的傳代代的次數(shù)數(shù)不得超超過5代（從菌種種保存中中心獲得得的冷凍凍干燥菌菌種為0代）。25（6）培養(yǎng)基適適用性檢檢查菌種：試試驗用菌菌株及菌菌液制備備：金黃色葡葡萄球菌菌[CMCC(B)26003銅綠色假假單胞菌菌[CMCC(B)10104]大腸埃希希菌[CMCC(B)44102]枯草桿菌菌[CMCC(B)63501]生孢梭梭菌[CMCC(B)64941]白色念念珠菌菌[CMCC(F)98001]黑曲霉霉[CMCC(F)98003]菌種的的要求求：不得超超過5代。采采用適適宜的的方法法保存存；并并以保保證試試驗菌菌株的的生物物學特特性。。26（6）培養(yǎng)基基適用用性檢檢查菌液制制備一般當當日使使用。。取金黃色葡萄萄球菌菌、銅綠假單胞胞菌、、枯草芽孢桿桿菌，，少許許接種種至營營養(yǎng)肉肉湯基基中，，生孢梭菌的的新鮮鮮培養(yǎng)養(yǎng)物少少許接接種至至硫乙乙醇酸酸鹽流流體培培養(yǎng)基基中，，30～35℃℃培養(yǎng)18～24h；白色念珠菌菌的新新鮮培培養(yǎng)物物接種種改良良馬丁丁培養(yǎng)養(yǎng)基中中，23～28℃℃培養(yǎng)24～48h，上述述培養(yǎng)養(yǎng)物用用0.9%無菌氯氯化鈉鈉溶液液制成成含菌菌量小小于100cfu/ml菌懸液液；黑曲霉菌菌斜面面的新新鮮培培養(yǎng)物物接種種至改改良馬馬丁瓊瓊脂斜斜面培培養(yǎng)基基上，，23～28℃℃培養(yǎng)5～7天，使使大量量的孢孢子成成熟。。加入入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山山梨酯酯80的0.9%無菌氯氯化鈉鈉溶液液，將將孢子子洗脫脫。然然后用用適宜宜的方方法吸吸出孢孢子懸懸液至至無菌菌試管管中，，用含含0.05%（ml/ml）聚山山梨酯酯80的0.9%無菌氯氯化鈉鈉溶液液制成成小于于100cfu/ml的孢子子懸液液。（（見表表）27（6）培養(yǎng)基基適用用性檢檢查《中國藥藥典》2010年無菌菌檢查查驗證證試驗驗中使使用7株菌見見下表表菌種接種培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度℃培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯或者普通斜面30～35

18～24h銅綠假單孢菌

枯草芽孢桿菌大腸埃希菌（無）生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基白色念珠菌改良馬丁或者普通斜面23～28

24～48h黑曲霉改良馬丁斜面23～285～7d28（6）培養(yǎng)基基適用用性檢檢查培養(yǎng)基基接種種金黃色色葡萄萄球菌菌2支銅綠假假單胞胞菌2支硫乙醇醇酸鹽鹽流體體培養(yǎng)養(yǎng)基枯枯草草芽孢孢桿菌菌2支生孢梭梭菌2支9支培培養(yǎng)基基裝量量12ml，空白對對照1支。分別接接種小小于100cfu/ml金葡、、銅綠綠、枯枯草、、生孢孢各2管管，另1支不接接種做做空白白對照照，培養(yǎng)3天，逐逐日觀觀察結(jié)結(jié)果。。29（5）培養(yǎng)基基適用用性檢檢查培養(yǎng)基基接種種白色念念株菌菌2支改良馬馬丁培培養(yǎng)黑曲霉霉2支（5支培養(yǎng)養(yǎng)基裝裝量9ml，其中中1支做空空白對對照））分別接接種小小于100cfu/ml白色、、黑曲曲各兩兩支，另1支不接接種做做空白白對照照。培養(yǎng)5天，逐逐日觀觀察結(jié)結(jié)果。。30（6）培養(yǎng)基基適用用性檢檢查結(jié)果判判斷空白對對照管管應無無菌生生長，，若加加菌的的培養(yǎng)養(yǎng)管均均生長長良好好，判判該培培養(yǎng)基基的靈靈敏度度檢查查符合合規(guī)定定。31（7）試驗驗(驗證)菌種及菌液液制備菌種：試驗驗用菌株及及菌液制備備：金黃色葡萄萄球菌[CMCC(B)26003大腸埃希菌菌[CMCC(B)44102]枯草桿菌[CMCC(B)63501]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]32（6）試驗菌種種及菌液制制備10倍梯度度稀釋選擇適宜的的3個稀釋釋級別要求＜100cfu/ml33（7）無菌檢查查方法驗證證驗證準備條條件：稀釋液、沖沖洗液及其其制備方法法0.1％蛋白胨水水溶液pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖沖液制備的菌液液，應當日日使用。34（7）無菌檢查查方法驗證證目的:證明所采用用的方法適適合于該供供試品的無無菌檢查確認供試品品在該實驗驗條件下無無抑菌活性性或其抑菌菌活性可以以忽略不計計。確保在實際際檢驗條件件下，該供供試品的無無菌檢查法法的準確性性、有效性性和重現(xiàn)性性。驗證證時，按“供試品的無無菌檢查”的規(guī)定及下下列要求進進行操作。。對每一試試驗菌應逐逐一進行驗驗證。35（7）無菌檢查查方法驗證證菌種及菌液液制備：：除大腸埃希希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色色葡萄球菌菌、枯草芽孢桿桿菌、生孢梭菌、、白色念珠菌菌、黑曲霉霉同培養(yǎng)基基靈敏度檢檢查。大腸腸埃希菌的的菌液制備備同金黃色色葡萄球菌菌。方法驗證試試驗與靈敏敏度檢驗所所有菌種區(qū)區(qū)別：大腸埃希菌菌代替銅綠假單胞胞菌。36（7）無菌檢查查方法驗證證菌液制備：：金黃色葡萄萄球菌（大大腸埃希菌菌、枯草芽芽孢桿菌)接種營養(yǎng)肉肉湯（或營營養(yǎng)瓊脂培培養(yǎng)基）生孢梭菌接接種硫乙醇醇酸鹽流體體培養(yǎng)基30～35℃培養(yǎng)18～24小時；白色念珠菌菌接種改良良馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基（或改改良馬丁瓊瓊脂培養(yǎng)基基）23～28℃培養(yǎng)24～48小時上述培養(yǎng)物物用0.9％無菌氯化化鈉溶液制制成每1ml含菌數(shù)小于于l00cfu(菌落形成單單位)的菌懸液。。黑曲霉接種種改良馬丁丁瓊脂斜面面培養(yǎng)基上上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9％無菌氯化化鈉溶液，，將孢子洗洗吸出孢孢子懸液(用管口帶有有薄的無菌菌棉花或紗紗布能過濾濾菌絲的無無菌毛細吸吸管)至無菌試管管內(nèi)用0.9％無菌氯化化鈉溶液制制成每lml含孢子數(shù)小小于l00cfu的孢子懸液液。37（7）無菌檢查查方法驗證證薄膜過濾法法將規(guī)定量的的供試品按按薄膜過濾濾法過濾，，沖洗，在在最后一次次的沖洗液液中加入試試驗菌（小小于100cfu），過濾。。取出濾膜膜接種至相相應的培養(yǎng)養(yǎng)基中，或或?qū)⑴囵B(yǎng)基基加至濾筒筒內(nèi)。另取取一濾桶，，不過濾供供試品，其其它操作同同上，作為為對照.將含培養(yǎng)基基的容器按按規(guī)定溫度度培養(yǎng)3～5天。各試試驗菌及相相應的培養(yǎng)養(yǎng)基逐一進進行驗證。。（如下圖示示）38（7）無菌檢查查方法驗證證薄膜過濾法法規(guī)定量的供供試品過濾硫乙醇酸鹽鹽流體培養(yǎng)養(yǎng)基濾膜接種改良馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基沖洗▲每種菌均作1管不含供試品品管作為對照照加入試驗菌過濾39（7）無菌檢查方方法驗證直接接種法取符合直接接接種法培養(yǎng)基基用量要求的的硫乙醇酸鹽鹽流體培養(yǎng)基基8管，分別接人人小于l00cfu的金黃色葡萄萄球菌、銅綠綠假單胞菌、、枯草芽孢桿桿菌、生孢梭梭菌各2管；取符合直直接接種法培培養(yǎng)基用量要要求的改良馬馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入入小于l00cfu的白色念珠菌菌、黑曲霉各各2管。其中1管接人規(guī)定量量的供試品，，另1管作為對照，，按規(guī)定的溫溫度培養(yǎng)3～5天。（如下表表）40（7）無菌檢查方方法驗證-直接接種法方法驗證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液，濃度小100cfu/mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)3天。大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)5天。黑曲霉41（7）無菌檢查方方法驗證結(jié)果判斷與對照管比較較，如含供試試品各容器中中的試驗菌均均生長良好，，則供試品的的該檢驗量在在該檢驗條件件下無抑菌作作用或其抑菌菌作用可以忽忽略不計，照照此檢查法和和檢驗條件進進行供試品的的無菌檢查。。如含供試品品的任一容器器中微生物生生長微弱、緩緩慢或不生長長，則供試品品的該檢驗量量在該檢驗條條件下有抑菌菌作用。可采采用：1)增加沖洗量，，或增加培養(yǎng)養(yǎng)基的用量；；2)使用中和劑或或滅活劑、更更換濾膜品種種等方法，消消除供試品的的抑菌作用，，并重新進行行方法驗證。。42（8）供試品無菌菌檢查在100級超凈臺內(nèi)，，應在酒精燈燈火焰周圍，，以無菌操作作法將規(guī)定量量的供試品分分別接種至含含硫乙醇酸鹽鹽流體培養(yǎng)基基（不少于15ml/管）和改良馬馬丁培養(yǎng)基（（不少于10ml/管）的容器中中。注意事項：嚴格遵守無菌菌技術(shù)操作，，切勿人為造造成污染；試驗器具溫度度不可過高以以免將可能存存在的菌燙死死。43（8）供試品無菌菌檢查供試品包裝須須完好無損，，尤其是只有有一層包裝的的樣品。供試品若有兩兩層（或兩層層以上）包裝裝的，進入無無菌檢驗室需需將外包裝在在傳遞窗（或或緩沖間）拆拆除后，傳入入實驗室。開啟潔凈區(qū)紫紫外燈和空氣氣過濾裝置并并其工作1小時以上。操作人員準備備：帶口罩、、帽子、穿專專用無菌服、、鞋進入無菌菌室。每次試驗中所所用物品必須須計劃好，并并有備用44（8）供試品無菌菌檢查無菌檢查法包包括：薄膜過濾法和和直接接種法法。只要供試品性性狀允許，應應采用薄膜過過濾法。進行行供試品無菌菌檢查時，所所采用的檢驗驗方法和檢驗驗條件應與驗驗證的方法相相同。45（8）供試品無菌菌檢查細菌檢測管：：硫乙醇酸鹽流流體培養(yǎng)基+供試品真菌檢測管：：改良馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基+供試品陽性對照管：：對應陽性菌+對應培養(yǎng)基+供試品陰性對照管：：應取相應的溶溶劑和稀釋液液或沖洗液+培養(yǎng)基46（8）供試品無菌菌檢查檢驗數(shù)量：是指一次試驗驗所用供試品品最小包裝容容器的數(shù)量。。一般情況下，，供試品無菌菌檢查若采用用薄膜過濾法，應增加最小小檢驗數(shù)量的的1/2作陽性對照用用；若采用直直接接種法，，應增加供試試品無菌檢查查時每個培養(yǎng)養(yǎng)基容器接種種的樣品量做做陽性對照用用。47（8）供試品無菌菌檢查檢驗量：是指一次試驗驗所用的供試試品總量（g或ml）。采用直接接種種法時：若每支（瓶））供試品的裝裝量按規(guī)定足足夠接種兩份份培養(yǎng)基，則則應分別接種種硫乙醇酸鹽鹽流體培養(yǎng)基基和改良馬丁丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾濾法時：檢驗量應不少少于直接接種種法的供試品品總接種量，，只要供試品品特性允許，，應將所有容容器內(nèi)的全部部內(nèi)容物過濾濾。48（8）供試品無菌菌檢查直接接種法：：每個容器中培培養(yǎng)基的用量量應符合接種種的供試品體體積不得大于于培養(yǎng)基體積積的10％，同時硫乙乙醇酸鹽流體體培養(yǎng)基每管管裝量不少于于15ml，改良馬丁培培養(yǎng)基每管裝裝量不少于10ml。培培養(yǎng)養(yǎng)基基的的用用量量和和高高度度同同方方法法驗驗證證試試驗驗；；每每種種培培養(yǎng)養(yǎng)基基接接種種的的管管數(shù)數(shù)同同供供試試品品的的檢檢驗驗數(shù)數(shù)量量。。4949（8）供供試試品品無無菌菌檢檢查查陰性性對對照照：：供試試品品無無菌菌檢檢查查時時，，應應取取相相應應溶溶劑劑和和稀稀釋釋液液同同法法操操作作，，作作為為陰陰性性對對照照。。陰陰性性對對照照不不得得有有菌菌生生長長。。陰性性對對照照：：目的的是是驗驗證證相相應應溶溶劑劑和和稀稀釋釋液液本本身身是是否否存存在在污污染染，，防防止止假假陽陽性性。。5050（8）供供試試品品無無菌菌檢檢查查陽性性對對照照：應根根據(jù)據(jù)供供試試品品特特性性選選擇擇陽陽性性對對照照菌菌；；無無抑抑菌菌作作用用供供試試品品以以金金黃黃色色葡葡萄萄球球菌菌為為陽陽性性對對照照菌菌。。陽陽性性對對照照試試驗驗的的菌菌液液制制備備同同方方法法驗驗證證試試驗驗，，加加菌菌量量小小于于100cfu/ml，供供試試品品用用量量同同供供試試品品無無菌菌檢檢查查每每份份接接種種量量相相同同。。陽陽性性對對照照管管培培養(yǎng)養(yǎng)48~72小時時應應生生長長良良好好。。陽性性對對照照：：目的的是是驗驗證證試試驗驗結(jié)結(jié)果果可可靠靠性性，，防防止止假假陰陰性性。。5151（8）供供試試品品無無菌菌檢檢查查薄膜膜過過濾濾法法：：2010年版版《中國國藥藥典典》規(guī)定定:只要要供供試試品品性性狀狀允允許許，，應應采采用用薄薄膜膜過過濾濾法法。。供供試試品品無無菌菌檢檢查查所所采采用用的的檢檢查查方方法法和和檢檢驗驗條條件件應應與與驗驗證證的的方方法法相相同同。。在蠕蠕動動泵泵的的作作用用下下，，被被測測產(chǎn)產(chǎn)品品通通過過裝裝有有帶帶空空氣氣過過濾濾器器的的針針頭頭及及無無菌菌管管路路直直接接從從樣樣品品容容器器中中進進入入濾濾筒筒中中，，免免去去了了通通常常膜膜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移過過程程中中易易產(chǎn)產(chǎn)生生的的污污染染。。無菌菌檢檢查查法法中中薄薄膜膜過過濾濾法法所所用用的的濾濾膜膜孔孔徑徑應應不不大大于于0.45μm，直徑約約為50mm。5252（8）供試品品無菌檢檢查水溶液供供試品取規(guī)定量量的供試試液，直直接過濾濾，或混混合至適適量稀釋釋液的無無菌容器器內(nèi)，混混勻，立立即過濾濾。供試液經(jīng)經(jīng)薄膜過過濾后，，若需要要用沖洗洗液沖洗洗濾膜，，每張濾濾膜每次次沖洗量量為100ml，總沖洗洗量不得得超過1000mL，以免濾濾膜上微微生物受受損傷。。沖洗后分分別將100mL硫乙醇酸酸鹽流