總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程

總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程資料僅供參考文件編號：2022年4月總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、儀器試劑Trizol試劑三氯甲烷（4℃預(yù)冷）異丙醇（4℃預(yù)冷）75%乙醇（DEPC處理水配置）（4℃預(yù)冷）DEPC處理水/RNasefreewater（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）無酶EP管200μL無酶PCR管冷凍離心機NanoDrop2000反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaraRR036A）二、實驗須知1.選擇人員走動較少的實驗臺或超凈臺（無須打開風(fēng)機）操作。2.操作及觀摩人員必須佩戴干凈的一次性手套及口罩。3.盡可能在冰盤上操作。3.取EP管時需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完EP管后，袋子及時封好。4.Trizol含劇毒，若濺到皮膚上，請立即用清水沖洗；若濺到眼內(nèi)，立即大量清水沖洗，并送醫(yī)就診。三、樣品處理1.組織樣品將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解。注1：樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。注2：組織樣品收取后應(yīng)立即處理或液氮冷凍并-80攝氏度保藏。胰腺組織樣品因其各種酶含量極其豐富，應(yīng)尤為注意，研磨過程中注意保持樣品低溫狀態(tài)。2.貼壁細(xì)胞樣品棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，根據(jù)下表加入適量Trizol溶液，吹打混勻，并吸至無酶EP管中，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。培養(yǎng)皿Trizol體積皿（6孔板）1mL6cm皿3mL10cm皿10mL注：加入Trizol溶液后，可將培養(yǎng)皿放入-80℃冰箱，20min后取出化開，通過凍融增加細(xì)胞裂解效果。3.懸浮細(xì)胞500g×5min離心收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，約5-10×106細(xì)胞加入1mLTrizol溶液，吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。注：某些酵母或細(xì)菌細(xì)胞須超聲裂解。4.注意事項1）樣品裂解液可室溫存放數(shù)小時，-80℃可至少存放一月。2）若樣品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物質(zhì)，如脂肪、肌肉或塊莖植物等樣品，可增加一步離心操作，具體步驟如下：eq\o\ac(○,1)12000g、4℃離心10min，胞外基質(zhì)、多糖、高分子量DNA將會形成顆粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂樣品會在上清液上方形成一層脂肪層。eq\o\ac(○,2) 移除脂肪層，將澄清的上清液移至新的無酶EP管中。四、總RNA提取1.每1mLTrizol溶液加入200μL三氯甲烷，立即蓋上蓋子，劇烈振蕩15s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3-5min。2.4℃下，12000g離心15min，液體分為三層，RNA位于上層水相，約占總體積的50%，移至新無酶EP管中（用20-200μL的槍吸取上清，吸上清時，EP管傾斜大約45度，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）。3.加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次，不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min。4℃下，12,000g離心10min，可見羽毛狀白色RNA沉淀，小心吸出上清。4.1mL75%乙醇洗滌兩次（4℃7500g離心5min，加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不可使用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀）。注：RNA可與75%乙醇中4℃保存一周，-80℃保存一年。5.室溫干燥室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。視沉淀量加入適量DEPC水（至少15μL）溶解沉淀，使用NanoDrop測定RNA濃度。6.首次提取RNA時須跑膠驗證RNA質(zhì)量，核酸膠配置為：1%瓊脂糖/1×TAE緩沖液，取5μLRNA溶液混上μLLoadingBuffer，上樣跑膠，電泳大概15min，凝膠成像儀上觀察RNA條帶質(zhì)量，RNA條帶一般為三條，理想的RNA條帶為：明亮的28S條帶與18S條帶，并且28S條帶亮度大約為18S條帶兩倍，微弱或沒有5S條帶。五、反轉(zhuǎn)錄用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaraRR036A）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。1.于200μL無酶PCR管中按反應(yīng)體系配置RT液。反應(yīng)體系如下：試劑使用量終濃度5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μL1×總RNA500ngDEPC處理水補足至10μL2.輕柔混勻后進行反轉(zhuǎn)錄應(yīng)，條件如下：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）4℃3.得到的RT反應(yīng)液使用NanoDrop測定cDNA濃度，-20℃保存。

QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、QPCR原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行絕對定量分析或通過內(nèi)參對比進行相對定量分析的方法。本實驗室常采用相對定量進行分析。1.SYBRGreen：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性結(jié)合DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而游離SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2.Ct值Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。1）熒光閾值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle3-15。2）Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下：Ct=-1/lg(1+e)×lgX0+lgN/lg(1+e)n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，e為擴增效率，常默認(rèn)為1，N為熒光擴增信號達(dá)到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。二、儀器試劑SYBRGreenPCRMasterMix引物ddH2OcDNA模板EP管96孔板迷你離心機7200RPM（TOMOSTMC15287）離心機（湘儀L530）QPCR儀（伯樂Q200）三、QPCR操作步驟1.QPCR每孔體系如下：試劑使用量cDNA模板10pg-100ngSYBRGreenPCRMasterMix10μL上游引物1μL下游引物1μLddH2O補足至20μL根據(jù)樣品數(shù)量計算所需體系預(yù)混液體積（預(yù)混液中不包含cDNA模板），并按組分比例配置，振蕩器振蕩或用槍吹打均勻，迷你離心機快速離心去除氣泡。cDNA模板根據(jù)使用量用ddH2O稀釋到合適的濃度。2.根據(jù)實驗設(shè)計，小心地將體系與cDNA模板加入每孔之內(nèi)。例如：兩組樣品：對照組、處理組，每組樣品三個樣，檢測目的基因表達(dá)量，綠色部分表示檢測內(nèi)參基因表達(dá)量，藍(lán)色部分表示檢測目的基因表達(dá)量，96孔板設(shè)置如下：123456789101112A對照組1對照組1對照組1對照組1對照組1對照組1B對照組2對照組2對照組2對照組2對照組2對照組2C對照組3對照組3對照組3對照組3對照組3對照組3D處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1E處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2F處理組3處理組3處理組3處理組3處理組3處理組3GH1)樣品全都稀釋至50ng/μL，模板量采用100ng，即每孔須加樣2μL。2)預(yù)混液1：內(nèi)參基因18個孔，我們配置20個孔體系，即200μLSYBRGreenPCRMasterMix，20μL內(nèi)參基因上游引物，20μL內(nèi)參基因下游引物，ddH2O120μL。預(yù)混液2：目的基因18個孔，我們配置20個孔體系，即200μLSYBRGreenPCRMasterMix，20μL目的基因上游引物，20μL目的基因下游引物，ddH2O120μL。注：配置預(yù)混液時須適當(dāng)多配，EP管及槍頭易附著預(yù)混液引起損失，例如18個孔可配置20-22孔的預(yù)混液。3)根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將預(yù)混液加入孔內(nèi)，同一預(yù)混液不需換槍頭，注意不要將槍打到第二檔，避免產(chǎn)生氣泡。4)根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將樣品加入孔內(nèi)，每一孔都必須換槍頭，避免交叉污染。封上封口膜，用硬卡片左右上下來回刮幾下，使封口膜與96孔板貼緊，避免交叉污染，離心機1500g×2min離心。3.上QPCR儀進行反應(yīng)分析，反應(yīng)程序如下Step195℃30secStep295℃5secStep360℃30sec設(shè)置Step2-339個循環(huán)Step4添加溶解曲線注：該反應(yīng)程序僅是一般性建議，如有需要請根據(jù)具體情況優(yōu)化。4.數(shù)據(jù)導(dǎo)出，進行定量分析。相對定量分析舉例如下：內(nèi)參(Ct)基因（Ct）△Ct△△Ct2-△△Ct對照組處理組1處理組2第一步計算△Ct=基因Ct值-內(nèi)參Ct值第二步計算△△Ct=處理組△Ct-對照組△Ct第三步計算2-△△Ct最后結(jié)果對照是1，處理小于1，說明