一種建立小鼠2型糖尿病心肌病模型的方法

一種建立小鼠2型糖尿病心肌病模型的方法王金鑫;段鵬;朱慶磊【摘要】AIM:Toestablishamousemodeloftype2diabeticcardiomyopathyinducedbysustainedhigh-fatdiet(HFD)feedingandsingleintraperitonealinjectionofstreptozotocin(STZ).METHODS:The5~6-week-oldC57BL/6Jmicewererandomlydividedinto2groups(n=20pergroup):themiceincontrolgroupreceivedasustainedregulardiet;themiceinHFD+STZgroupreceivedasustainedHFDandwereintraperitoneallyinjectedwithSTZ(100mg/kg)atthe5thweek.Thebodyweightandbloodglucoseweremeasuredat0,5,6,11and16weeks.ThemiceincontrolgroupandHFD+STZgroupwereanalyzedwithechocardiography,HEstaining,ELISAandimmunohistochemistryatthe11thand16thweeks.RESULTS:ThebodyweightofthemiceinHFD+STZgroupwashigherthanthatincontrolgroup(P<0.05)duringeachmodelingperiod,andwasslightlydecreased1weekafterSTZinjection.ThebloodglucoseofthemiceinHFD+STZgroupwashigherthan13.89mmol/L1weekafterSTZinjection.TheseruminsulinofthemiceinHFD+STZgroupwaslowerthanthatincontrolgroup(P<0.05)atthe11thweekandthe16thweek.Echocardio-graphy,HEstainingandimmunohistochemistryanalysisshowedthatthemiceinHFD+STZgrouphadmildventriculardysfunctionandcardiomyocytehypertrophy,andcardiomyocyteareaandapoptosisratewereobvioushigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05)atthe16thweek,whiletheseindicatorswerenotobviouslychangedinHFD+STZgroupcom-paredwithcontrolgroupatthe11thweek.CONCLUSION:ThesustainedHFDfeedingandsingleintraperitonealinjec-tionofSTZsuccessfullyestablishamousemodeloftype2diabeticcardiomyopathy.%目的:采用連續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食(high-fatdiet,HFD)結合單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法建立小鼠2型糖尿病心肌病模型.方法將40只5~6周齡C57BL/6J雄性小鼠隨機分成2組(每組各20只):對照(control)組，持續(xù)以普通飼料喂養(yǎng);HFD+STZ組,持續(xù)以HFD喂養(yǎng),并于造模第5周注射STZ(100mg/kg).于造模實驗開始(第0周)、第5周、第6周、第11周和第16周，測量體重和血糖,并于第11周和第16周分別對control組和HFD+STZ組小鼠進行心功能檢測、胰島素水平檢測、組織學觀察和心肌細胞凋亡分析.結果:造模過程中HFD+STZ組小鼠各時期的體重均大于control組(P<0.05),注射完STZ后小鼠體重略有下降，但仍高于control組.注射STZ1周后,HFD+STZ組小鼠空腹血糖值均持續(xù)高于13.89mmol/L.在造模第11周和16周時,HFD+STZ組小鼠胰島素水平與control組相比均有降低(P<0.05).心功能檢測、組織學觀察和心肌細胞凋亡分析顯示，造模第11周時,HFD+STZ組小鼠的超聲、心肌細胞面積和凋亡率等指標與control組相比變化不明顯;造模第16周,HFD+STZ組小鼠出現(xiàn)心室功能障礙,心肌細胞肥大，心肌細胞的面積和心肌細胞凋亡率明顯大于control組(P<0.05).結論:采用連續(xù)喂養(yǎng)HFD結合單次注射STZ可成功建立小鼠2型糖尿病心肌病模型.【期刊名稱】《中國病理生理雜志》【年(卷)，期】2018(034)004【總頁數(shù)】5頁(P764-768)【關鍵詞】糖尿病心肌病;小鼠模型;高脂飲食;鏈脲佐菌素;細胞凋亡【作者】王金鑫;段鵬;朱慶磊【作者單位】解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京100853;解放軍371醫(yī)院心內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453000;解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京100853【正文語種】中文【中圖分類】R363.2;R33-33糖尿病是導致糖尿病心肌病的重要原因，糖尿病心肌病嚴重威脅糖尿病患者的生命健康。自Hayat等［1］首次提出糖尿病心肌病概念以來，國內(nèi)外眾多學者對其機制進行了研究，但其中仍有許多未知因素，其防治也未得到根本性改善［2］。因此，我們需要建立糖尿病心肌病的動物模型以明確糖尿病心肌病的發(fā)病機制。當前，糖尿病心肌病的動物模型有：(1)自發(fā)性模型，如ob/ob小鼠、db/db小鼠、GK大鼠和OLETF大鼠等；(2)誘發(fā)性模型，如單純高糖高脂飲食(high-fatdiet，HFD)、一次大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、多次小劑量腹腔注射STZ和HFD結合腹腔注射STZ等［3-4］。雖然動物模型有多種，但大都存在一些缺點，如自發(fā)性模型的費用較高，且此類基因突變的動物模型不適宜評價藥物療效；單純HFD誘導動物模型的造模時間較長；腹腔注射大劑量STZ造成動物死亡率增高；多次小劑量腹腔注射STZ操作較為繁瑣等。而采用HFD結合腹腔注射STZ建立2型糖尿病心肌病小鼠模型相比而言具有諸多優(yōu)勢。目前，國內(nèi)外卜在采用連續(xù)HFD結合STZ建立2型糖尿病心肌病大鼠模型的研究較多［5-7］，但以此方法制備小鼠模型的文獻則較為罕見。由于小鼠模型存在世代周期短、操作方便和遺傳修飾研究相對成熟等優(yōu)勢，所以建立2型糖尿病心肌病小鼠模型有利于深入研究2型糖尿病心肌病。本研究采用連續(xù)HFD結合單次腹腔注射低劑量STZ的方法，建立小鼠2型糖尿病心肌病模型。材料和方法1實驗動物5~6周齡C57BL/6J雄性小鼠，購于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心，動物質量合格證編號為No.11400700164757。小鼠飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心，SPF級。室溫保持在20~26°C,濕度為0.4~0.7，每天12h晝夜循環(huán)（光照時間為7:00AM~7:00PM）,自由進食水。造模實驗開始前，適用性飼養(yǎng)1周。所有操作均符合解放軍總醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會的要求。2藥品與試劑高脂飼料購于ResearchDiets;普通飼料購于北京斯貝福公司；STZ、檸檬酸和檸檬酸鈉均購于Sigma;40g/L多聚甲醛購于北京索萊寶公司。3實驗方法3.1造模方法將40只小鼠隨機分成2組：對照組（control組）和HFD+STZ組，每組各20只小鼠。Control組以普通飼料喂養(yǎng)；HFD+STZ組以高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水約12h，以100mg/kg的劑量腹腔注射STZ（100g/L溶于檸檬酸緩沖液），control組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液［8］。密切監(jiān)測小鼠體重和血糖變化，于第11周和第16周分別選擇control和HFD+STZ組小鼠進行心功能檢測、血清胰島素水平檢測、組織學觀察和心肌細胞凋亡分析。3.2體重（bodyweight,BW）和血糖測量分別于造模實驗開始（0周）、5周、6周、11周和16周，禁食不禁水約12h后稱重，取鼠尾血用血糖儀測量空腹血糖值（fastingbloodglucose,FBG）。以空腹血糖值＞13.89mmol/L認為2型糖尿病小鼠造模成功［9］。3.3心功能測定用異氟烷吸入麻醉小鼠，固定于實驗臺上，使用高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)Vevo770TM（VisualSonics）檢測心功能。檢測指標包括二尖瓣E'峰與A'峰之比(ratioofearlydiastolicpeakE'velocitytolatediastolicpeakAvelocity,E'/A')、=尖瓣E峰與E'峰之比(ratioofmitralvalveEvelocitytoE'velocity,MVE/E')、心輸出量(cardiacoutput,CO)、左室射血分數(shù)(leftventricularejectionfraction,LVEF)以及左室短軸縮短率(leftventricularfractionalshortening,LVFS)。取3次測量的平均值。3.4ELISA檢測取小鼠眼球血離心得到血清，用小鼠胰島素檢測試劑盒(ALPCO)檢測血清胰島素水平。3.5組織學分析取小鼠心肌組織用40g/L多聚甲醛溶液固定8~12h，石蠟包埋，組織切片，蘇木素-伊紅染色。用熒光顯微鏡(Olympus)觀察，分析心肌的病理形態(tài)情況并定量，隨機選取的小鼠心肌相似截面，并從心肌切片截面上隨機選取10個心肌細胞，計算其平均值，定量分析心肌細胞面積。3.6心肌細胞凋亡分析取小鼠心臟組織用40g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片，60^孵化15min，脫蠟，再水化。小鼠心室肌細胞的凋亡水平使用TUNEL檢測試劑盒(Roche)檢測。用熒光顯微鏡觀察，進行圖像分析和定量，用Image-ProPlus軟件在切片截面上進行細胞計數(shù)，計算心肌細胞凋亡率。4統(tǒng)計學處理統(tǒng)計軟件采用SPSS17.0。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(mean士SD)或均數(shù)士標準誤(mean±SEM)表示。組間多重比較行單因素方差分析后采用SNK-q檢驗或Tamhane’sT2檢驗，進行各組均數(shù)間兩兩比較；兩獨立樣本比較選用t-test。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1造模過程中小鼠體重的變化各組小鼠在造模過程中的體重變化情況顯示，經(jīng)過4周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD+STZ組小鼠相對于control組體重增加(P<0.05);注射STZ1周后HFD+STZ組小鼠體重略有下降，但仍比control組高(P<0.05);造模第11周和第16周，小鼠體重持續(xù)增加，與control組相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖1。Figure1.Thebodyweightofmiceinthe2groups.Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrolgroup.圖1各組小鼠體重的比較2造模過程中小鼠空腹血糖的變化在造模過程中小鼠的空腹血糖變化情況示，control組小鼠血糖值較為穩(wěn)定；經(jīng)過4周高脂飼料喂養(yǎng)后，HFD+STZ組小鼠相對于control組血糖有所增加(P<0.05),但未達到13.89mmol/L，注射STZ1周后HFD+STZ組血糖顯著增加(>13.89mmol/L),造模第11周血糖繼續(xù)增加，第16周血糖較之前比略有下降，但仍高于13.89mmol/L。造模第6、11和16周小鼠的血糖與同時期control組相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖2。Figure2.Bloodglucoseofmiceinthe2groups.Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrolgroup.圖2各組小鼠血糖的比較3小鼠血清胰島素水平ELISA檢測顯示，在造模第11周和16周時，HFD+STZ組小鼠與同時期正常對照組相比血清胰島素水平均降低(P<0.05),見圖3。Figure3.Thechangesoftheseruminsulininthe2groups.Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrolgroup.圖3小鼠血清胰島素水平的變化4小鼠心功能相關指標的變化于造模第11周和第16周分別選擇control組和HFD+STZ組進行心功能檢測，結果見表1。造模第11周，HFD+STZ組小鼠與control組相比，E7A增大(P<0.05),其它指標變化不明顯；造模第16周，HFD+STZ組小鼠與control組相比，E7A和MVE/E增大(P<0.05),CO、LVEF和LVFS減小(P<0.05)。表1小鼠造模后不同時點心功能相關指標的比較Table1.Theechocardiographicparametersofmiceinthe2groupsatdifferenttimepoints(Mean±SD.n=10)Variable11thweek16thweekControlHFD+STZControlHFD+STZE'/A'0.92±0.231.35±0.19*1.03±0.021.14±0.11*MVE/E'32.69±1.1033.25±2.7431.82±0.4234.99±3.27*CO(mL/min)37.15±4.5236.79±1.4737.08±1.9732.45±5.35*LVEF(%)54.85±4.0953.62±4.3654.28±1.3850.96±0.22*LVFS(%)31.39±2.6330.43±2.8530.88±0.0227.34±0.10**P<0.05vscontrolgroup.5小鼠心肌病理形態(tài)的改變小鼠心肌組織切片HE染色觀察和定量分析顯示，造模第16周，HFD+STZ組小鼠心肌組織結構中可見心肌細胞明顯肥大，心肌細胞面積明顯大于同時期control組(P<0.05);與造模第11周時control組相比，同時期HFD+STZ組小鼠心肌細胞面積變化不明顯，見圖4。6小鼠心肌細胞凋亡分析小鼠心肌細胞凋亡分析顯示，在造模第16周時，HFD+STZ組小鼠心肌細胞凋亡率明顯大于同時期control組(P<0.05);與造模第11周時control組相比，同時期HFD+STZ組小鼠心肌細胞凋亡率變化不明顯，見圖5。Figure4.HEstainingofthehearttissuesandcellareaquantificationinthe2groups(x400).A:controlgroup(11thweek);B:HFD+STZgroup(11thweek);C:controlgroup(16thweek);D:HFD+STZgroup(16thweek);E:thequantitativeanalysisofthecellarea.Mean±SD.n=10.*P<0.05vsgroup.圖4小鼠心臟的HE染色結果討論2型糖尿病約占所有糖尿病患者的90%以上，并且有證據(jù)顯示60%~75%的血糖控制良好且無其它并發(fā)癥的2型糖尿病患者被證明存在舒張期功能障礙，其中28%發(fā)展為伴左心室充盈壓增高的舒張功能嚴重受損［10］。隨著糖尿病病人的增多，糖尿病心肌病的防治已成為社會和醫(yī)學界共同關注的問題，但其發(fā)病機制仍不清楚。因此，建立2型糖尿病心肌病的動物模型并對其發(fā)病機制等進行研究具有重要意義。目前，采用連續(xù)高脂飲食結合單次腹腔注射低劑量STZ的方法建立2型糖尿病小鼠模型的研究已較為成熟［11-12］。HFD誘導小鼠發(fā)生胰島素抵抗，低劑量STZ使胰島P細胞中的DNA鏈斷裂從而破壞部分胰島P細胞，模擬了臨床上2型糖尿病的發(fā)病過程。本研究在造模過程中干預小鼠各時期的體重均大于正常對照小鼠，與人2型糖尿病多為肥胖的臨床表現(xiàn)相符合。本研究發(fā)現(xiàn)注射STZ1周后小鼠體重略有下降，隨后10周內(nèi)體重持續(xù)增長，小鼠體重的變化趨勢與Poucher等［13］的研究結果一致。注射STZ1周后，所有小鼠空腹血糖值均持續(xù)高于13.89mmol/L，在造模第11周和16周時，HFD+STZ組小鼠與正常對照組相比胰島素水平均有降低，說明小鼠已經(jīng)產(chǎn)生胰島素抵抗和胰島功能受損，證實成功建立2型糖尿病小鼠模型。Figure5.TUNELanalysisofcardiomyocyteapoptosisandapoptosisratequantificationinthe2groups(x400).A:controlgroup(11thweek);B:HFD+STZgroup(11thweek);C:controlgroup(16thweek);D:HFD+STZgroup(16thweek);E:thequantitativeanalysisoftheapoptoticrate.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrolgroup.圖5小鼠心肌細胞凋亡的TUNEL分析2型糖尿病患者隨病程的延長會出現(xiàn)不同程度的心肌舒縮功能異常，其中左室舒張功能的異常較早出現(xiàn)。臨床上超聲心動圖、核素顯像等檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病患者在出現(xiàn)心功能障礙時，主要表現(xiàn)為射血分數(shù)降低和峰充盈率降低等變化。2型糖尿病患者的代謝紊亂會導致廣泛的心肌損害，表現(xiàn)為心肌細胞肥大、變性、灶性壞死等。鑒于20周齡db/db小鼠出現(xiàn)明顯心臟功能障礙［14］,本研究分別檢測造模第11周(15周齡)和第16周(20周齡)小鼠的心臟功能。超聲檢測顯示，在造模第16周時，HFD+STZ組小鼠與正常對照組相比E7A和MVE/E'增大，心輸出量、左室射血分數(shù)和左室短軸縮短率減小，出現(xiàn)心功能障礙。本研究的組織學和心肌細胞凋亡分析顯示，在造模第16周時，HFD+STZ組心肌細胞肥大，心肌細胞面積和凋亡率明顯大于同時期正常對照組。造模第11周時2組小鼠上述各項指標變化不明顯。本研究的結果與上述人2型糖尿病心肌病的心功能、心肌細胞改變相符。采用連續(xù)HFD結合單次腹腔注射低劑量STZ的方法建立2型糖尿病心肌病小鼠模型有許多優(yōu)勢。(1)其相較于單純HFD誘導小鼠模型的造模時間較短，有研究顯示采用單純HFD飼養(yǎng)大于24周才能復制出2型糖尿病心肌病小鼠模型［15］。(2)其相較于自發(fā)性2型糖尿病心肌病模型，如db/db小鼠，費用更低，并且比此類基因突變的動物模型更適宜評價藥物療效。(3)有文獻報道［16］,小鼠腹腔注射150mg/kg或更大劑量的STZ可使血糖升高更明顯，但這會造成小鼠死亡率增高，并且這種方法很有可能會誘導成1型糖尿病心肌病模型;也有一些學者采用HFD結合多次注射小劑量STZ的方法建模[17]，STZ溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，操作較為繁瑣。本研究給小鼠腹腔單次注射STZ(100mg/kg)，劑量較為適宜，操作也相對簡單，未出現(xiàn)小鼠死亡，造模成功率高。綜上所述，采用連續(xù)喂養(yǎng)HFD結合單次注射STZ可成功建立2型糖尿病心肌病小鼠模型，并具有造模周期短、成功率高、操作簡單、費用低等優(yōu)勢，且與人2型糖尿病心肌病臨床特征相符，為深入研究2型糖尿病心肌病的發(fā)病機制、治療藥物等提供動物實驗模型基礎。[參考文獻]HayatSA,PatelB,KhattarRS,etal.Diabeticcardio-myopathy:mechanisms,diagnosisandtreatment[J].ClinSci(Lond),2004,107(6):539-557.BuggerH,AbelED.Molecularmechanismsofdiabeticcardiomyopathy[J].Diabetologia,2014,57(4):660-671.JoostHG,Al-HasaniH,SchurmannA,etal.Animalmodelsindiabetesresearch[M].NewYork:HumanaPress,2012:47-176.呂青蘭，孫麗，蔣碧梅，等.核仁素對小鼠糖尿病性心肌病心肌肥大與纖維化發(fā)生的影響[J].中國病理生理雜志,2017,33(7):1231-1236.鐘明，張薇，苗雅，等.凝血酶敏感蛋白-1在2型糖尿病心肌病大鼠心肌中的表達及意義[J].中國病理生理雜志,2007,23(9):1671-1675.劉群.實驗性2型糖尿病心肌病大鼠模型建立的方法[J].臨床心血管病雜志，2014,30(3):254-257.王祥，李長運，曾秋棠，等.大鼠2型糖尿病心肌病模型的建立方法[J].中國病理生理雜志,2006,22(9):1868-1870.MuJ,WoodsJ,ZhouYP,etal.Chronicinhibitionofdipeptidylpeptidase-4withasitagliptinanalogpreservespancreatic[3-cellmassandfunctioninarodentmodeloftype2diabetes[J].Diabetes,2006,55(6):1695-1704.曾位森，黃源堅，邵聰文，等.高脂飲食誘導的2型糖尿病模型小鼠的生化及病理分析[J].南方醫(yī)科大學學報,2014,34(8):1115-1120.DeiCasA,KhanSS,ButlerJ,etal.Impactofdiabetesonepidemiology,treatment,andoutcomesofpatientswithheartfailure[J].JACCHeartFail,2015,3(2):136-145.ZhangX,WangZ,HuangY,etal.Effectsofchronicadministrationofalogliptinonthedevelopmentofdiabetesand[3-cellfunctioninhighfatdiet/streptozotocindiabeticmic