四菌種保藏的原理和方法課件

第三節(jié)菌種保藏與復壯一、菌種保藏菌種保藏的重要意義：菌種是從事微生物學以及生命科學研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)，如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務首先是使菌種不死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種是國家的重要資源，1980年我國成立了中國微生物菌種保藏委員會。第三節(jié)菌種保藏與復壯一、菌種保藏1第四章菌種保藏的原理與方法第四章菌種保藏的原理與方法2一菌種保藏的原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。保藏時，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以降低菌種的代謝活動，減少菌種變異，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力，達到長期保存的目的。一個好的菌種保藏方法，應能保持原菌種的優(yōu)良特性和較高的存活率，同時也應考慮到方法本身的經(jīng)濟、簡便。一菌種保藏的原理：3二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法2．礦物油中浸沒保藏法3．固體曲保藏法4．砂土管保藏法5.普通冷凍保藏6．超低溫冷凍保藏法7.冷凍干燥法8.液氮冷凍保藏法9.

寄主保藏二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法41.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短時期內(nèi)保持不變。將新鮮瓊脂培養(yǎng)基斜面上長好的菌體或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌種均可用此方法保存1～3個月。保存期間要注意冰箱的溫度，不可波動太大，不能在0℃以下保存，否則培養(yǎng)基會結(jié)冰脫水，造成菌種性能衰退或死亡。此法最為簡單和經(jīng)濟，且不要求任何特殊的設(shè)備?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏。1.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的5但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉(zhuǎn)接菌量應保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。此方法是一種短期、過渡的保藏方法此方法，一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變6將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方法簡便有效。保存期約1年?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。2.礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方7浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油(液體石蠟可采用蒸汽滅菌，滅菌后的石蠟在40℃烘箱中烘干備用)。礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預防不測，一般保藏株2～3年也應做一次存活試驗。浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然83.固體曲保藏法這是根據(jù)我國傳統(tǒng)制曲原理加以改進的一種方法，適用于產(chǎn)孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后加以保存。該法的要點是控制適當?shù)乃帧?.固體曲保藏法這是根據(jù)我國傳統(tǒng)制曲原理加以改進的一種方法94砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌以及產(chǎn)芽孢的細菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3：2或1：1，將黃砂和泥土分別洗凈，過篩，一般沙用80目過篩，土用80～100目過篩。按比例混合后，裝人小試管內(nèi)，裝料高度約為1cm左右，121℃間歇滅菌2～3次，滅菌后烘干，并作無菌檢查后備用。4砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息10將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合?；旌虾蟮纳巴凉芊旁谑⒂形逖趸谆驘o水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。此法保存期可達1年以上。將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水洗下孢115.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護劑。甘油的最終濃度為25%。具體操作如下：①配制濃度為50％的甘油溶液，121℃滅菌后備用；②制備菌懸液，一般菌懸液的濃度為108～1010個／mL；③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后，置－20℃保藏。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。5.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物12用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。136.超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在

-60～-80℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

6.超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在14如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培157．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地將細胞凍結(jié)，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因而能長期保存，一般為5～10年。此法適用于各種微生物。具體的做法是先將微生物制成懸浮液，與保護劑（一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管內(nèi)，用低溫酒精或干冰（－15℃以下）使之速凍，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，低溫保存?zhèn)溆?。?jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸7．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地16培養(yǎng)物的凍干過程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù)。培養(yǎng)物的凍干過程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／17四菌種保藏的原理和方法課件18凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復蘇：在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下198.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的，此法國外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長。我國國內(nèi)目前已有很多單位采用液氮法保存菌種。原理用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達－196℃，遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度（－130℃），所以此時菌種的代謝活動已基本停止，化學作用亦隨之消失。

8.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的，此20

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的21菌種保藏的注意事項：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進行保存，效果較好。2．菌種保藏所用的基質(zhì)碳源、砂土、保護劑3．操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度菌種保藏的注意事項：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)22基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓力。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹谋２赜奢d體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不23建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA

輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp(氨芐青霉素)和Tet(四環(huán)素)，則培養(yǎng)時可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細胞。

建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中24三.微生物活力和穩(wěn)定性測定

所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實際保藏過程中出現(xiàn)的細胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標)應在保藏后加以檢測和確定。三.微生物活力和穩(wěn)定性測定所有保藏菌種的方法都必須是長期25成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)。細胞群體的形態(tài)學特征或一些特別的生化特征應在菌種保藏前后保持同一性，以及實驗室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。加速保藏試驗可用于預測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏6個月、1年或26四.菌種的復壯生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過程中，經(jīng)常會逐漸向不利于生產(chǎn)的方向發(fā)生變化，這種變化稱之為菌種衰退

一般衰退菌種的復壯措施如下：純種分離淘汰衰退的個體選擇合適的培養(yǎng)條件四.菌種的復壯生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過27五.國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)介紹（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection。Rockvil1．Maryland.U.S.A.美國標準菌種收藏所，美國，馬里蘭州，羅克維爾市.（2）CSHColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美國.（3）IAMInstituteofAppliedMicrobiology.UniversityofTokyo，Japan.日本東京大學應用微生物研究所，日本東京.（4）IFOInstituteforFermentation.Osaka，Japan.發(fā)酵研究所，日本大阪.（5）KCCKakenChemicalCompanyLtd．Tokyo，Japan.科研化學有限公司，日本東京.五.國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)介紹（1）ATCCAmeric28（6）NCTCNationalCollectionofTypeCulture.London，UnitedKingdom.國立標準菌種收藏所，英國倫敦.（7）NIHNationalInstitutesofHealth.Bethesda，Maryland，U.S.A.國立衛(wèi)生研究所，美國，馬里蘭州，貝塞斯達.（8）NRRLNorthernUtilizationResearchandDevelopmentDivision，U.S.DepartmentofArgiculture.Peoria，U.S.A.美國農(nóng)業(yè)部、北方開發(fā)利用研究部，美國皮奧里亞市.（6）NCTCNationalCollectiono29第三節(jié)菌種保藏與復壯一、菌種保藏菌種保藏的重要意義：菌種是從事微生物學以及生命科學研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)，如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務首先是使菌種不死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種是國家的重要資源，1980年我國成立了中國微生物菌種保藏委員會。第三節(jié)菌種保藏與復壯一、菌種保藏30第四章菌種保藏的原理與方法第四章菌種保藏的原理與方法31一菌種保藏的原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。保藏時，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以降低菌種的代謝活動，減少菌種變異，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力，達到長期保存的目的。一個好的菌種保藏方法，應能保持原菌種的優(yōu)良特性和較高的存活率，同時也應考慮到方法本身的經(jīng)濟、簡便。一菌種保藏的原理：32二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法2．礦物油中浸沒保藏法3．固體曲保藏法4．砂土管保藏法5.普通冷凍保藏6．超低溫冷凍保藏法7.冷凍干燥法8.液氮冷凍保藏法9.

寄主保藏二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法331.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短時期內(nèi)保持不變。將新鮮瓊脂培養(yǎng)基斜面上長好的菌體或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌種均可用此方法保存1～3個月。保存期間要注意冰箱的溫度，不可波動太大，不能在0℃以下保存，否則培養(yǎng)基會結(jié)冰脫水，造成菌種性能衰退或死亡。此法最為簡單和經(jīng)濟，且不要求任何特殊的設(shè)備?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏。1.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的34但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉(zhuǎn)接菌量應保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。此方法是一種短期、過渡的保藏方法此方法，一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變35將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方法簡便有效。保存期約1年?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。2.礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方36浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油(液體石蠟可采用蒸汽滅菌，滅菌后的石蠟在40℃烘箱中烘干備用)。礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預防不測，一般保藏株2～3年也應做一次存活試驗。浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然373.固體曲保藏法這是根據(jù)我國傳統(tǒng)制曲原理加以改進的一種方法，適用于產(chǎn)孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后加以保存。該法的要點是控制適當?shù)乃帧?.固體曲保藏法這是根據(jù)我國傳統(tǒng)制曲原理加以改進的一種方法384砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌以及產(chǎn)芽孢的細菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3：2或1：1，將黃砂和泥土分別洗凈，過篩，一般沙用80目過篩，土用80～100目過篩。按比例混合后，裝人小試管內(nèi)，裝料高度約為1cm左右，121℃間歇滅菌2～3次，滅菌后烘干，并作無菌檢查后備用。4砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息39將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合?；旌虾蟮纳巴凉芊旁谑⒂形逖趸谆驘o水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。此法保存期可達1年以上。將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水洗下孢405.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護劑。甘油的最終濃度為25%。具體操作如下：①配制濃度為50％的甘油溶液，121℃滅菌后備用；②制備菌懸液，一般菌懸液的濃度為108～1010個／mL；③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后，置－20℃保藏?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。5.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物41用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。426.超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在

-60～-80℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

6.超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在43如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培447．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地將細胞凍結(jié)，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因而能長期保存，一般為5～10年。此法適用于各種微生物。具體的做法是先將微生物制成懸浮液，與保護劑（一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管內(nèi)，用低溫酒精或干冰（－15℃以下）使之速凍，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，低溫保存?zhèn)溆?。?jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸7．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地45培養(yǎng)物的凍干過程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù)。培養(yǎng)物的凍干過程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／46四菌種保藏的原理和方法課件47凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復蘇：在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下488.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的，此法國外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長。我國國內(nèi)目前已有很多單位采用液氮法保存菌種。原理用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達－196℃，遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度（－130℃），所以此時菌種的代謝活動已基本停止，化學作用亦隨之消失。

8.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的，此49

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的50菌種保藏的注意事項：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進行保存，效果較好。2．菌種保藏所用的基質(zhì)碳源、砂土、保護劑3．操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度菌種保藏的注意事項：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)51基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓力。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹谋２赜奢d體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不52建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA

輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp(氨芐青霉素)和Tet(四環(huán)素)，則培養(yǎng)時可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細胞。

建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中53三.微生物活力和穩(wěn)定性測定

所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實際保藏過程中出現(xiàn)的細胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標)應在保藏后加以檢測和確定。三.微生物活力和穩(wěn)定性測定所有保藏菌種的方法都必須是長期54成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)。細胞