實(shí)驗(yàn)8酶的分離純化課件

酶的概念：酶是生物催化劑，是活細(xì)胞合成的具有高度催化效率和高度特異性的一類蛋白質(zhì)。知識(shí)回顧酶的概念：知識(shí)回顧1酶促反應(yīng)的特點(diǎn)

它遵守一般催化劑的共同性質(zhì)：

1.在化學(xué)反應(yīng)前后都沒有質(zhì)和量的改變；

2.只能促進(jìn)熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；

3.只能加速可逆反應(yīng)的速率，而不能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，即不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)。

4.酶和一般催化劑都是通過降低反應(yīng)活化能而使反應(yīng)速率加快。酶促反應(yīng)的特點(diǎn)2酶不同于一般催化劑的特點(diǎn)：（一）酶的催化效率極高通常比非催化反應(yīng)高108～1012倍；比一般催化劑高107～1013倍。過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能酶不同于一般催化劑的特點(diǎn)：過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能3實(shí)驗(yàn)8酶的分離純化課件4（二）酶具有高度特異性1．絕對(duì)特異性：有的酶只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)生成特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，稱之為絕對(duì)特異性（absolutespecificity）。2．相對(duì)特異性：大多數(shù)酶作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵，這種不太嚴(yán)格的選擇性稱為相對(duì)特異性（relativespecificity）。（二）酶具有高度特異性5絕對(duì)特異性絕對(duì)特異性6相對(duì)特異性

圖5-9蔗糖酶的水解作用相對(duì)特異性73．立體異構(gòu)特異性：一些酶僅能催化一種立體異構(gòu)體進(jìn)行反應(yīng)，或其催化的結(jié)果只產(chǎn)生一種立體異構(gòu)體，酶對(duì)立體異構(gòu)物的選擇性稱為立體異構(gòu)特異性（stereospecificity）。

圖5-11乳酸脫氫酶的立體異構(gòu)特異性3．立體異構(gòu)特異性：一些酶僅能催化一種立體異構(gòu)體進(jìn)行反應(yīng)，或8主要內(nèi)容

單底物酶處反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的分離純化主要內(nèi)容9單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度問題，即研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。酶動(dòng)力學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)在生物化學(xué)領(lǐng)域，特別在酶學(xué)研究中，有十分重要的作用。例如，根據(jù)某些因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，可推斷該酶促反應(yīng)的機(jī)制。又例如，要準(zhǔn)確測(cè)定酶活力單位，就需要對(duì)最佳反應(yīng)條件及各種因素的影響進(jìn)行研究。酶促反應(yīng)有單底物反應(yīng)和多底物反應(yīng)之分。單底物酶促反應(yīng)包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反應(yīng)。單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度問題，即10各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度3、pH（最適pH的概念）4、溫度（最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時(shí)，v=k[E]各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度1、酶濃度當(dāng)S足夠過量11第一節(jié)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度與酶和底物間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系。因?yàn)槊负偷孜锸菢?gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動(dòng)力學(xué)關(guān)系是整個(gè)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)。描寫這種基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmax[S]/(Km+[S])第一節(jié)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系12單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象13米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：當(dāng)[Et]=[ES]時(shí)，(4)所以

米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：14酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線15當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比。[S]VVmax目錄當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比。[S]VVmax目16隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速。[S]VVmax目錄隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速。[S]VVmax17當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度。[S]VVmax目錄當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度。[S]V18第二節(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

—分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法)

將實(shí)驗(yàn)所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和[S]取倒數(shù)，得各種1/v和1/[S]，將1/v對(duì)1/[S]作圖，得一直線。該直線縱截距＝1/Vmax，斜率＝Km/Vmax，橫截距＝-1/Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須注意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km附近。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

—分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、191.下圖是根據(jù)[S]在0.33～2.0Km范圍時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從此圖可準(zhǔn)確地測(cè)量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。1.下圖是根據(jù)[S]在0.33～2.0Km范圍時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而202.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線基本上是水平的。這種情況雖可測(cè)得1/Vmax

，但由于直線斜率近乎零，-1/Km則難以測(cè)得。[S]在3.3～20Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。2.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線基本上213.如果[S]比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)都接近原點(diǎn)，使-1/Km和1/Vmax

，都難以測(cè)準(zhǔn)。[S]在0.033～0.2Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。3.如果[S]比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)22二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程二、其它線性作圖法232.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖243.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程3.Eadie-Scatchard作圖法25以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使[S]比Km高得多或低得多。上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個(gè)缺點(diǎn)：第一，在v～[S]圖上，由相等增值而給出的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/v軸附近，而遠(yuǎn)離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是主觀目測(cè)以確定直線最權(quán)重的那些點(diǎn)。第二，在測(cè)定v時(shí)產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時(shí)會(huì)放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/[S]值所得的一兩個(gè)不準(zhǔn)確的點(diǎn)，會(huì)給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個(gè)缺點(diǎn)可通過選擇適當(dāng)?shù)腫S]，使1/[S]為等距離增值而得到克服。對(duì)第二個(gè)缺點(diǎn)關(guān)鍵要注意在低底物濃度下使所測(cè)初速度誤差盡可能減小。以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使[S]比Km高得多26[S]/v對(duì)[S]作圖，[S]未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對(duì)等距離[S]增值所測(cè)數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測(cè)定誤差較大時(shí)使用，比其它方法更可靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是根據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該法是把[S]值標(biāo)在橫軸的負(fù)半軸上，而把測(cè)得的v值標(biāo)在縱軸上，然后把相應(yīng)的v和[S]連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點(diǎn)，該交點(diǎn)坐標(biāo)為Km和Vmax。[S]/v對(duì)[S]作圖，[S]未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v27Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為其中是t這一段時(shí)間內(nèi)的平均速度；為反應(yīng)過程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對(duì)任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過與對(duì)比：Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理其中是t這一段28從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，即使反應(yīng)已進(jìn)行到30％，所引入的誤差也不過1％左右。很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來測(cè)定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理29酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反應(yīng)的速度必需測(cè)初速度2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法動(dòng)力學(xué)法

檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量，即用酶的活力表示。

酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反應(yīng)的速度必需測(cè)30酶活力測(cè)定方法

終點(diǎn)法:酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。

動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)物\底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度。酶活力測(cè)定方法終點(diǎn)法:酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后31

酶活力的表示方法活力單位（activeunit）

習(xí)慣單位（U）:底物(或產(chǎn)物)變化量/

單位時(shí)間國(guó)際單位（IU）:1μmoL變化量/

分鐘

Katal（Kat）：1moL變化量/

秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat）底物（μmoL）/秒·每個(gè)酶分子量度酶純度比活力（specificactivity）量度轉(zhuǎn)換效率酶活力的表示方法活力單位（activeunit）比活力32第四節(jié)酶的分析和檢測(cè)一、酶促反應(yīng)初速度隨[Et]的變化酶促反應(yīng)的初速度隨[Et]的變化而變化。通常在離體測(cè)定條件下，[Et]一般為10-12～10-7mol/L，而[St]為10-6～10-2mol/L?？蓪⒚资戏匠剔D(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)[S]為常數(shù)時(shí)，則初速度v與[Et]成正比。但一個(gè)酶促反應(yīng)速度，常因[S]的改變而改變。因此反應(yīng)時(shí)間必須盡可能短，使[S]幾乎處于恒態(tài)(即只有5％以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與[Et]之間的關(guān)系才會(huì)是線性的。第四節(jié)酶的分析和檢測(cè)一、酶促反應(yīng)初速度隨[Et]的變化這33二、酶活力單位和比活力是指酶在一定作用條件下，單位時(shí)間內(nèi)，使底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反應(yīng)的速度來度量，因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)臈l件下，v∝[E]。

為了使酶單位的文獻(xiàn)報(bào)道能統(tǒng)一，并具有可比性，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議曾制訂了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)酶單位。所謂特定條件，溫度定為25℃，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國(guó)際單位〔IU)。酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。二、酶活力單位和比活力34三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是許多酶為寡聚體。含幾個(gè)亞基，因此可用另一種方式來表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個(gè)值有時(shí)簡(jiǎn)單以min-1表示，即：酶的kp值約在50～107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即該酶一個(gè)催化周期為1.7微秒。三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)酶的kp值約在50～107min-1。碳酸酐酶35第五節(jié)酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究有兩條途徑：一是穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。它是監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)，得到關(guān)于反應(yīng)的籠統(tǒng)信息。二是穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)，它能更直接地研究整個(gè)反應(yīng)中的基本步驟或部分反應(yīng)，提供可用于分析復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制的更有效的數(shù)據(jù)，但需要特殊的儀器來測(cè)量快反應(yīng)。所謂快反應(yīng)，是相對(duì)于普通的混合和觀察方法所需要的時(shí)間而言。完成總反應(yīng)量的一半，即所謂反應(yīng)半時(shí)間，為秒或更短時(shí)間，則屬快反應(yīng)。采用手工混合啟動(dòng)反應(yīng)，用普通的分光光度計(jì)等儀器所能測(cè)量的反應(yīng)半時(shí)間為分和小時(shí)。而酶促反應(yīng)常常是反應(yīng)半時(shí)間短于一秒的快反應(yīng)，采用普通方法是不行的。限制儀器測(cè)定能力的主要因素有：混合樣品并充滿反應(yīng)池所需的時(shí)間，觀察和記錄變化所需的第五節(jié)酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)36時(shí)間?？焖俜磻?yīng)動(dòng)力學(xué)技術(shù)因此應(yīng)運(yùn)而生，并得到不斷發(fā)展。目前，甚至已能測(cè)定反應(yīng)半時(shí)間與分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)所需時(shí)間相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。化學(xué)反應(yīng)半時(shí)間不可能短于10-11秒，故可認(rèn)為已沒有哪個(gè)化學(xué)反應(yīng)是快得無法測(cè)定的。流動(dòng)法和弛豫法，是為研究溶液中快反應(yīng)動(dòng)力學(xué)而建立起來的方法。前者包括常流法、加速流動(dòng)法、停流法和淬滅法；后者包括溫度、壓力、電磁場(chǎng)的跳變或周期性變化法等。由于這些方法采用與停流相似的液體處理系統(tǒng)和相同的快響應(yīng)探測(cè)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，所以常在一臺(tái)儀器上更換相應(yīng)的附件實(shí)施上述多種測(cè)量，構(gòu)成組合式儀器。時(shí)間?？焖俜磻?yīng)動(dòng)力學(xué)技術(shù)因此應(yīng)運(yùn)而生，并得到不斷發(fā)展。目前，37酶的分離純化酶的分離純化38酶分離純化的目的

酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到應(yīng)用所需的純度。酶分離純化的目的酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到應(yīng)用39分離純化過程包括3個(gè)基本步驟：

1抽提

2純化

3制劑分離純化過程包括3個(gè)基本步驟：

1抽提

2純化

3制40Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)Crudeproductconcentrationve41某些生化物質(zhì)在原料液中的

濃度與價(jià)格的關(guān)系(1984年)

某些生化物質(zhì)在原料液中的

濃度與價(jià)格的關(guān)系(1984年)42在分離純化中必須注意：

1防止酶的變性失活；

2在分離純化過程中的每一步都

應(yīng)檢測(cè)酶的活性，以確定酶的

純化程度和回收率。在分離純化中必須注意：

1防止酶的變性失活；

243第一節(jié)酶活力的測(cè)定幾個(gè)名詞

1酶活力或酶活性 2酶活力單位 3mol催化活性（分子活性）和轉(zhuǎn)換 數(shù)（催化中心活力) 4酶的比活力第一節(jié)酶活力的測(cè)定幾個(gè)名詞44酶活力（又稱酶活性）

(enzymeactivity)（IU/g或IU/mL)

指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力；用在一定條件下，所催化的反應(yīng)初速度來表示；是研究酶的特性，酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用以及分離純化時(shí)的一項(xiàng)必不可少的指標(biāo)。酶活力（又稱酶活性）

(enzymeactivity)（45酶活力單位(enzymeactivityunit)

表示酶活力大小的尺度；

一個(gè)國(guó)際單位（IU）是指在特定條件下（25

0C），每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物或催化形成1mol產(chǎn)物所需的酶量

一個(gè)Kat是指每秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量，1Kat=6107IU。酶活力單位(enzymeactivityunit)

46mol催化活性（分子活性）和

轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力）

mol催化活性是指單位時(shí)間內(nèi)，每個(gè)酶分子所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目；轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat)是指酶分子中每個(gè)活性中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目。如果酶分子中只有一個(gè)活性中心，那么mol催化活性與轉(zhuǎn)換數(shù)相等，如果酶分子中含有n個(gè)活性中心，那么轉(zhuǎn)換數(shù)則為mol催化活性除以n。mol催化活性（分子活性）和

轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力）

47酶的比活力

（specificactivity)

酶的比活力是酶純度的量度，是指單位重量酶蛋白所具有的酶活力，單位為IU/mg。比活力越大，酶純度越高。酶的比活力

（specificactivity)

酶48酶活力的測(cè)定方法：１終止反應(yīng)法２和連續(xù)反應(yīng)法。實(shí)驗(yàn)8酶的分離純化課件49終止反應(yīng)法

在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強(qiáng)酸強(qiáng)堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停止，然后用化學(xué)法、放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。這是最經(jīng)典的酶活力測(cè)定方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)出具體的測(cè)定方法。終止反應(yīng)法

在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)間，50連續(xù)反應(yīng)法

無須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行情況，對(duì)記錄結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)算出酶活力。連續(xù)反應(yīng)法

無須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過程中用51酶不可逆失活的原因和機(jī)理酶不可逆失活的原因和機(jī)理52蛋白質(zhì)（酶）的失活機(jī)理蛋白質(zhì)（酶）的失活機(jī)理53蛋白質(zhì)不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性劑和去垢劑聚合作用氧化作用機(jī)械力變性劑重金屬離子和巰基試劑冷凍和脫水熱極端pH蛋白質(zhì)不可逆失活脲和胍高濃度鹽螯合有機(jī)溶劑輻射作用蛋白質(zhì)不可逆失活的原因蛋白酶水解表面活性劑聚合作用氧化作用機(jī)54蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化55蛋白質(zhì)穩(wěn)定化蛋白質(zhì)穩(wěn)定化途徑如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展如何防止蛋白質(zhì)不可逆失活反應(yīng)發(fā)生蛋白質(zhì)穩(wěn)定化蛋白質(zhì)穩(wěn)定化途徑如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展如何防止56穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）的方法穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）的方法57酶分離的一般流程

原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性酶分離的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物58第二節(jié)酶溶液的制備第二節(jié)酶溶液的制備59酶溶液的制備：

把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液

酶溶液的制備包括：材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎、抽提、凈化脫色、抽體液的濃縮等幾個(gè)步驟。

酶溶液的制備：

把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液

60一、材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎

材料預(yù)處理：酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：胞外酶，胞內(nèi)酶（溶酶和晶酶）。一、材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎

材料預(yù)處理：酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分61微生物胞外酶

可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥

胞內(nèi)酶

要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取微生物胞外酶

可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)62動(dòng)物材料

應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等

植物材料

應(yīng)去皮等以免單寧等物質(zhì)著色污染動(dòng)物材料

應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等

植63細(xì)胞破碎：

物理和化學(xué)兩大類方法細(xì)胞破碎：

物理和化學(xué)兩大類方法641、物理破碎：

—研磨（手磨，球磨和石磨），

—機(jī)械搗碎（勻漿器和高速組織搗碎器等），

—高壓法，

—爆破性減壓法，

—專用波振蕩，

—快速冷凍融化法等。1、物理破碎：

—研磨（手磨，球磨和石磨），

652、化學(xué)破碎：

—滲透作用

—自溶：

—酶處理

—表面活性劑2、化學(xué)破碎：

—滲透作用

—自溶：

—66（I）滲透作用

將指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體用緩沖液洗凈，并懸浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris緩沖液中，離心，加入MgCl2劇烈攪拌，可使一些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。

（I）滲透作用

將指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體用緩沖液洗凈，并67（II）自溶

向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變保持一定時(shí)間后可以使細(xì)胞自溶；（II）自溶

向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及68（III）酶處理

用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)酶釋放（III）酶處理

用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)69（IV）表面活性劑

膜結(jié)合的晶酶在細(xì)胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。（IV）表面活性劑

膜結(jié)合的晶酶在細(xì)胞破碎后很難溶70二、抽提—大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽、稀堿或稀酸的水溶液進(jìn)行抽提；—抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。二、抽提711、提取的主要方法：

（1）鹽溶液提取

（2）酸溶液提取

（3）堿溶液提取

（4）有機(jī)溶劑提取

1、提取的主要方法：

（1）鹽溶液提取

（2）酸溶液提取

722、酶提取過程的注意事項(xiàng)

——pH的選擇

——鹽的選擇

——溫度的選擇

——抽提液用量

——其它

2、酶提取過程的注意事項(xiàng)

——pH的選擇

——鹽73pH的選擇

——首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)

遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；一般選擇pH4-6

為宜。pH的選擇

——首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)

遠(yuǎn)離等74鹽的選擇

——大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液

中有較大的溶解度，一般選

擇等滲鹽溶液，如0.02-0.05

mol/L的磷酸緩沖液或0.15

mol/L的NaCl等。鹽的選擇

——大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液

75溫度的選擇

——一般控制在0-40C，如果酶

比較穩(wěn)定可以例外。溫度的選擇

——一般控制在0-40C，如果酶

76抽提液用量

——常采用材料量的1-5倍抽提液用量

——常采用材料量的1-5倍77其它

——加入蛋白酶抑制劑、半胱

氨酸或細(xì)胞色素C等，來

穩(wěn)定抽提系統(tǒng)。其它

——加入蛋白酶抑制劑、半胱

氨酸或細(xì)78三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色79絮凝

——由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排

斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的

水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困

難；因此要用絮凝劑進(jìn)行處理。

——絮凝劑：多種類型

無機(jī)：如醋酸鈣和磷酸鈣等

有機(jī)：如聚丙烯酰胺等

天然高分子：如殼多糖等絮凝

——由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排

斥以80過濾或離心凈化

——通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細(xì)胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。過濾或離心凈化

——通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾81脫色

——酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1.5%。脫色

——酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過82四、酶溶液的濃縮

—冷凍干燥法

—蒸發(fā)法：

—超過濾法：

—膠過濾法：

—干燥四、酶溶液的濃縮

—冷凍干燥法

—蒸83冷凍干燥法

——先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。冷凍干燥法

——先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分84蒸發(fā)法

——目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達(dá)到濃縮的目的。蒸發(fā)法

——目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀85超過濾法

——將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。超過濾法

——將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，86膠過濾法

——利用SephadexG-250或G-50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。膠過濾法

——利用SephadexG-250或G-50吸87其它方法

——吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。其它方法

——吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。88干燥

——將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過程。

——方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥干燥

——將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一89第三節(jié)酶分離純化的基本過程第三節(jié)酶分離純化的基本過程90一、酶分離純化方法的選擇

目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面：—首先對(duì)待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；—以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)；—嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。一、酶分離純化方法的選擇目前酶的分離純化方法都91選擇生物分離方法的依據(jù)

1物理化學(xué)性質(zhì)

2生物體系的特性

3能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇生物分離方法的依據(jù)

1物理化學(xué)性質(zhì)

2生物體系的特92

1.物理化學(xué)性質(zhì)分子大小、分子量、分子體積、極性、偶極矩、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、汽化熱、離子電荷、溶解度參數(shù)、折射率、表面張力、介電常數(shù)、密度、粘度、酸堿強(qiáng)度、pK值、等電點(diǎn)(pI)等等。物質(zhì)之間得以分離的主要依據(jù)就是組分間的物化性質(zhì)的差異。在涉及具有生物活性物質(zhì)的體系中，有關(guān)這方面的數(shù)據(jù)與化工產(chǎn)品相比要少得多，嚴(yán)重影響了生物分離過程的有效進(jìn)行。因此，生物體系的物化性質(zhì)的研究應(yīng)成為一個(gè)重點(diǎn)。1.物理化學(xué)性質(zhì)分子大小、分子量、分子體積932.生物體系的特性對(duì)一些有生物活性的物質(zhì)，不是能夠用一般的物化性質(zhì)來表達(dá)的，這就需要了解這些物質(zhì)的生物特性，特別要知道影響生物特性變化的條件和這些物質(zhì)失活的因素，包括溶劑、pH值、溫度等等。這種保持生物質(zhì)特性不至于改變的措施就是所謂的穩(wěn)定性維持。2.生物體系的特性對(duì)一些有生物活性的物質(zhì)，不943.能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)能從混合物中分離和純化出一種蛋白質(zhì)是因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)有著不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目和序列不同造成的。連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基可以是帶正電荷的或帶負(fù)電荷的、極性的或非極性的、親水性的或疏水性的。此外，多肽可折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊和各種轉(zhuǎn)角)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況。利用待分離蛋白質(zhì)與混合物中其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)上的差異，即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級(jí)分離步驟。3.能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)能從混合物中分95酶分離純化方法

—根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

—根據(jù)溶解度建立的分離純化方法

—根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法

—根據(jù)親和作用建立的分離純化方法

—根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法

．．．．．．酶分離純化方法

—根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

96一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

——透析

——超過濾

——離心

——凝膠過濾等。一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

971、透析(Dialysis)法：

過程：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進(jìn)入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中；

透析袋類型：有兩種，再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。有多種型號(hào)和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（1102D）；商品名為spectrapor等。

透析袋的預(yù)處理：干燥的透析袋在制備過程中曾用10%甘油處理過，只要浸泡濕潤(rùn)和蒸餾水洗滌即可使用；必要時(shí)可用10mmol/L碳酸氫鈉，50%乙醇和10mmol/LEDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。1、透析(Dialysis)法：

過程：將酶溶液裝入透98透析袋酶溶液蒸餾水透析袋酶溶液蒸餾水99透析裝置和過程透析裝置和過程1002、超過濾

利用壓力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。2、超過濾

利用壓力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的101超濾膜——制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)是截留分子量，耐受壓力和濾速和有效過濾面積等；主要商品型號(hào)有AmiconDiaflo系列等。

超濾器類型——有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。超濾膜——制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟102加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液超濾裝置加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液超濾裝置1033、離心法

——離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。3、離心法

——離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不104

（1）離心機(jī)的種類和用途

（2）沉降系數(shù)S

（3）離心方法的選擇

差速離心

密度梯度離心

等密度離心

（4）離心條件的確定

離心力

離心時(shí)間

離心溫度和pH值

（1）離心機(jī)的種類和用途

（2）沉降系數(shù)S

（3）離心方105梯度離心密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大,向上逐漸減小蔗糖便宜，純度高，濃溶液（60％，w/w）密度可達(dá)1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr約400000。需要高密度和低滲透壓的梯度時(shí)，可用Ficoll代替蔗糖。梯度離心密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大,向上逐漸減1064、凝膠過濾法

原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴(kuò)展，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴(kuò)展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進(jìn)入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時(shí)間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。4、凝膠過濾法

原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介107凝膠過濾凝膠過濾108凝膠過濾凝膠過濾109TubesmarchinfromleftA280Fraction#TubesmarchinfromleftA280F110部分使用的擔(dān)體目前使用最廣泛的擔(dān)體材料：※交聯(lián)后的葡聚糖凝膠※聚丙烯酰胺※瓊脂

※其它物料部分使用的擔(dān)體目前使用最廣泛的擔(dān)體材料：111二、根據(jù)溶解度建立的分離方法

1、鹽析(SaltingOut)法

2、降低介電常數(shù)法（有機(jī)溶劑沉淀

法）

3、等電點(diǎn)沉淀法

4、共沉淀法

5、選擇性沉淀法：二、根據(jù)溶解度建立的分離方法

1、鹽析(SaltingO1121、鹽析法

最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。

加入飽和硫酸銨：100ml溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)V=V0（S1-S2）/（1-S2）。

直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表”。1、鹽析法

最常用的是硫酸銨。鹽濃度以1132、降低介電常數(shù)法

（有機(jī)溶劑沉淀法）

降低介電常數(shù)方法在酶溶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑，可以降低介電常數(shù)，使酶分子間的靜電引力增加而發(fā)生沉淀。2、降低介電常數(shù)法

（有機(jī)溶劑沉淀法）

降114影響介電常數(shù)的主要因素：

——溫度

——有機(jī)溶劑

——離子強(qiáng)度

——pH值：影響介電常數(shù)的主要因素：

——溫度

——有115溫度：

——在0℃下進(jìn)行操作；有機(jī)溶劑必須冷至-15~-20℃，邊攪拌邊緩慢加入，沉淀析出后迅速離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解沉淀。溫度：

——在0℃下進(jìn)行操作；有機(jī)溶劑必須冷至-15~-116

有機(jī)溶劑：

——常用的有機(jī)溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇等

有機(jī)溶劑：

——常用的有機(jī)溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇117離子強(qiáng)度

——大多數(shù)中性鹽在低濃度時(shí)能增加酶蛋白的溶解并減少變性，在有機(jī)溶劑沉淀中加入5~10%（<0.05mol）的硫酸銨有助于提高分辨率。離子強(qiáng)度

——大多數(shù)中性鹽在低濃度時(shí)能增加酶蛋白的溶解并減118

pH值

——盡可能接近酶的等電點(diǎn)pI

pH值

——盡可能接近酶的等電點(diǎn)pI1193、等電點(diǎn)沉淀法

——酶在等電點(diǎn)處容易發(fā)生沉淀

3、等電點(diǎn)沉淀法

——酶在等電點(diǎn)處容易發(fā)生沉淀

1204、共沉淀法

——一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亞胺（PEI）單寧酸，硫酸鏈霉素以及表面活性劑（SDS）等在一定條件下可以直接或間接與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀析出,再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜怼?、共沉淀法

——一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（PE1215、選擇性沉淀法：有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過程如下：PAA+酶酶PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAA5、選擇性沉淀法：有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某122三、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計(jì)的分離方法

1、吸附法

（1）物理吸附法

（2）羥基磷灰石法

（3）離子交換吸附法-離子交換色譜法

2、電泳法

（1）區(qū)帶電泳

（2）等點(diǎn)聚焦電泳

（3）高效毛細(xì)管電泳

（4）聚焦層析三、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計(jì)的分離方法

1、吸附法

（1123（1）物理吸附法(不介紹)（1）物理吸附法(不介紹)124（2）羥基磷灰石法——羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生相互作用；在低鹽和弱酸或中性條件下進(jìn)行吸附；洗脫時(shí)提高離子強(qiáng)度；多采用柱層析方式進(jìn)行。（2）羥基磷灰石法125

（3）離子交換吸附法

——離子交換色譜法

——利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。

（3）離子交換吸附法

——離子交換色譜法

—126離子交換層析過程：

—離子交換劑的預(yù)處理

—平衡

—裝柱

—加樣吸附

—洗脫

—洗脫液收集與相應(yīng)檢測(cè)

—離子交換劑的再生離子交換層析過程：

—離子交換劑的預(yù)處理

—平衡

127離子交換劑

——一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團(tuán)（離子交換基）兩部分組成。離子交換劑

——一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團(tuán)（離128離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：（1）有高度的不溶性，即在各種溶劑中進(jìn)行交換時(shí)，交換劑不發(fā)生溶解（2）有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換（3）有較多的交換基團(tuán)（4）有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用過程中，交換劑不能因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：129離子交換劑的3種類型

——根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)

——離子交換樹脂

——離子交換纖維素

——離子交換球型多糖(如葡聚糖凝膠

和瓊脂糖凝膠等)。離子交換劑的3種類型

——根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)

—1302、電泳法

——在直流電場(chǎng)中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動(dòng)速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。2、電泳法

——在直流電場(chǎng)中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不131基本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定pH下，可解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)作用下可以向與其電荷相反的方向的電極泳動(dòng)，泳動(dòng)速度主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及顆粒的大小和形狀。基本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定pH下，可132由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）不同，分子量不同，在同一個(gè)pH緩沖溶液中所帶電荷不同，故在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度也不同，利用此性質(zhì)，可將混合物中不同蛋白質(zhì)分離開，也可用其對(duì)樣品的純度進(jìn)行鑒定。由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）不同，分子量不同，在同133雙向電泳-1雙向電泳-1134雙向電泳-2雙向電泳-2135雙向電泳-3雙向電泳-3136電泳法

（1）區(qū)帶電泳

（2）等點(diǎn)聚焦電泳

（3）高效毛細(xì)管電泳

電泳法

（1）區(qū)帶電泳

（2）等點(diǎn)聚焦電泳

（3）高效毛細(xì)137（1）區(qū)帶電泳

——在惰性支持物上進(jìn)行電泳時(shí)樣品中各組分遷移速度不同而分布成區(qū)帶的一類電泳分離方法

——按支持物的物理性狀可分為3種類型：

—膜電泳

—粉末電泳

—凝膠電泳（1）區(qū)帶電泳

——在惰性支持物上進(jìn)行電泳時(shí)樣品中各組分138膜電泳

——以濾紙、聚酰胺薄膜，醋酸纖維薄膜等為支持物的一類電泳分離方法。膜電泳

——以濾紙、聚酰胺薄膜，醋酸纖維薄膜等為支持物的一139粉末電泳

——以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法。粉末電泳

——以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法140凝膠電泳

——以聚丙烯酰胺為支持物，兼有分子篩效應(yīng)。

凝膠電泳

——以聚丙烯酰胺為支持物，兼有分子篩效應(yīng)。

141區(qū)帶電泳的優(yōu)點(diǎn)分辨率較好設(shè)備簡(jiǎn)單操作方便區(qū)帶電泳的優(yōu)點(diǎn)分辨率較好設(shè)備簡(jiǎn)單操作方便142（2）等點(diǎn)聚焦電泳

——利用兩性電解質(zhì)在直流電場(chǎng)中形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度，樣品中各種蛋白質(zhì)在各自的等電點(diǎn)在相應(yīng)的pH區(qū)段聚集而達(dá)到分離的目的。（2）等點(diǎn)聚焦電泳

——利用兩性電解質(zhì)在直流電場(chǎng)中形成一個(gè)143等電聚焦電泳等電聚焦電泳144高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳是在內(nèi)徑為25~100m的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳，毛細(xì)管中填充了緩沖液或凝膠。使用毛細(xì)管的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:它減少了由于熱效應(yīng)產(chǎn)生的許多問題，因?yàn)楣艿目讖叫?，面積與體積之比大，這樣可以提高熱散失，有助于消除由于熱引起的擴(kuò)散增加而造成的對(duì)流和區(qū)帶變寬，因此管中不需要加入穩(wěn)定介質(zhì)即可進(jìn)行自由流動(dòng)電泳。高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳是在內(nèi)徑為25~100m的石英毛細(xì)145實(shí)驗(yàn)8酶的分離純化課件146聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳方法。PAGE方法成了研究蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的重要工具之一.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla147實(shí)踐中可根據(jù)不同目的選擇所需的類型。一般單向PAGE多用于分離具有活性的生物物質(zhì)，而雙向或梯度PAGE則宜用于較難分離鑒別的生物大分子物質(zhì)。如果在PAGE時(shí)加入適量十二烷基磺酸鈉（SDS）可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量；如果PAGE與等電聚焦相結(jié)合時(shí)，可用于分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。除這些用途外，PAGE還可用于制備少量的純度高、有活性的生物大分子物質(zhì)實(shí)踐中可根據(jù)不同目的選擇所需的類型。148聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，電泳顆粒通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙時(shí)受到摩擦力的作用，摩擦力的大小與樣品顆粒的大小呈正相關(guān)。基本原理聚丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺（acrylamideAcr）單體（monomer）N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene-bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑（crosslinker）聚合交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，電泳顆粒通過149原理：當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象，特別是強(qiáng)還原劑硫基乙醇的存在，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原，從而保證蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS能破150蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。凈電荷分子的大小形狀等因素蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于151（SDS）的主要用途是蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)混合組分的分離蛋白質(zhì)亞基組分的分析等（SDS）的主要用途是蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)混152四、根據(jù)親和作用建立的純化方法四、根據(jù)親和作用建立的純化方法153根據(jù)親和作用建立的純化方法

——由于酶對(duì)底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,輔酶等配體具有較高的親和力，而其它雜蛋白對(duì)這些配體則沒有或有很弱的親和作用，因此，可以根據(jù)酶與雜蛋白對(duì)配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。

——目前已經(jīng)建立的方法有親和層析法和親和電泳法等。

根據(jù)親和作用建立的純化方法

——由于酶對(duì)底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑1541、親和層析法

——親和層析的核心是親和吸附劑，它是由固相載體和能與目的酶專一可逆結(jié)合的配體共價(jià)結(jié)合而成的。將親和吸附劑填充層析柱，讓酶液流過層析柱，則目的酶就能迅速而選擇性地吸附在親和吸附劑上，用適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行洗滌，除去一些非專一性的雜蛋白后，再用濃度高的或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行親和洗脫目的酶便可被洗脫出來。1、親和層析法

——親和層析的核心是親和吸附劑，它是由固相155親和層析中的配體構(gòu)成示意圖

Matrix:forligandattachment,shouldbechemicallyandphysicallyinert.

Spacerarm:improvebindingbetweenligandandtargetmoleculebyovercominganyeffectsofsterichindrance.Ligand:moleculethatbindsreversiblytoaspecifictargetmoleculeorgroupoftargetmolecules.親和層析中的配體構(gòu)成示意圖Matrix:forliga156親和體系的種類

親和體系的種類

157親和配基

(1)

酶的抑制劑(2)

抗體(3)

蛋白A(4)

凝集素(5)

輔酶和磷酸腺苷(6)

三嗪類染料(7)

過渡金屬離子(8)

組氨酸(9)

肝素親和配基(1)

酶的抑制劑158親和層析-1親和層析-1159親和層析-2親和層析-2160親和層析-3親和層析-3161親和層析過程示意圖

1.用緩沖液平衡親和介質(zhì)

2.樣品中的目標(biāo)分子被連接到親和介質(zhì)上，它們具有特異性吸附，但吸附是可逆的，可被洗脫下來。3.改變洗脫液可將目標(biāo)分子洗脫下來，如通過改變pH值、離子強(qiáng)度、極性等。4.親和介質(zhì)用緩沖液重新平衡親和層析過程示意圖1.用緩沖液平衡親和介質(zhì)2.樣品中162親和層析過程示意圖

EquilibrationadsorptionofsampleandelutionofunboundmaterialWashawayunboundmaterialeluteboundprotein(s)re-equilibrationColumnVolumes(cv)親和層析過程示意圖Equilibrationadsorpt1632、親和電泳——將親和配體共價(jià)偶聯(lián)于電泳凝膠上，由于親和作用，待分離的酶與配體結(jié)合后，在電泳中不再移動(dòng)，而其它雜蛋白不與配體結(jié)合，使目的酶分離出來。2、親和電泳——將親和配體共價(jià)偶聯(lián)于電泳凝膠上，由于親和作用164五、根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分

離純化方法

—1、熱變性法

—2、酸堿變性法

—3、表面變性法五、根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分

離純化方法

—1、熱1651、熱變性法

——根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。1、熱變性法

——根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較1662、酸堿變性法

——與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的pH使雜蛋白變性沉淀。

2、酸堿變性法

——與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的1673、表面變性法

——可將酶溶液與惰性液體混合，振蕩造成表面變性；如在酶液中加入氯仿，振蕩后通常可分為3層：上面為未變性的酶，中層為乳濁狀的變性蛋白，下層為氯仿。3、表面變性法

——可將酶溶液與惰性液體混合，振蕩造成表面168作業(yè)題：1.名詞解釋：酶的抽提、膜分離技術(shù)、離子交換層析、凝膠層析、凝膠點(diǎn)泳、酶的結(jié)晶、酶的回收率和提純倍數(shù)2.酶分離純化的基本環(huán)節(jié)有哪些？3.酶液制備的過程有哪些？4.細(xì)胞破碎的方法有哪些？5.說明有機(jī)溶劑沉淀分離法的優(yōu)缺點(diǎn)。6.酶的結(jié)晶方法有哪些？7.分析說明酶分離純化的應(yīng)用方法（概念、原理和過程）。作業(yè)題：1.名詞解釋：酶的抽提、膜分離技術(shù)、離子交換層析、169酶的概念：酶是生物催化劑，是活細(xì)胞合成的具有高度催化效率和高度特異性的一類蛋白質(zhì)。知識(shí)回顧酶的概念：知識(shí)回顧170酶促反應(yīng)的特點(diǎn)

它遵守一般催化劑的共同性質(zhì)：

1.在化學(xué)反應(yīng)前后都沒有質(zhì)和量的改變；

2.只能促進(jìn)熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；

3.只能加速可逆反應(yīng)的速率，而不能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，即不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)。

4.酶和一般催化劑都是通過降低反應(yīng)活化能而使反應(yīng)速率加快。酶促反應(yīng)的特點(diǎn)171酶不同于一般催化劑的特點(diǎn)：（一）酶的催化效率極高通常比非催化反應(yīng)高108～1012倍；比一般催化劑高107～1013倍。過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能酶不同于一般催化劑的特點(diǎn)：過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能172實(shí)驗(yàn)8酶的分離純化課件173（二）酶具有高度特異性1．絕對(duì)特異性：有的酶只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)生成特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，稱之為絕對(duì)特異性（absolutespecificity）。2．相對(duì)特異性：大多數(shù)酶作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵，這種不太嚴(yán)格的選擇性稱為相對(duì)特異性（relativespecificity）。（二）酶具有高度特異性174絕對(duì)特異性絕對(duì)特異性175相對(duì)特異性

圖5-9蔗糖酶的水解作用相對(duì)特異性1763．立體異構(gòu)特異性：一些酶僅能催化一種立體異構(gòu)體進(jìn)行反應(yīng)，或其催化的結(jié)果只產(chǎn)生一種立體異構(gòu)體，酶對(duì)立體異構(gòu)物的選擇性稱為立體異構(gòu)特異性（stereospecificity）。

圖5-11乳酸脫氫酶的立體異構(gòu)特異性3．立體異構(gòu)特異性：一些酶僅能催化一種立體異構(gòu)體進(jìn)行反應(yīng)，或177主要內(nèi)容

單底物酶處反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的分離純化主要內(nèi)容178單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度問題，即研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。酶動(dòng)力學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)在生物化學(xué)領(lǐng)域，特別在酶學(xué)研究中，有十分重要的作用。例如，根據(jù)某些因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，可推斷該酶促反應(yīng)的機(jī)制。又例如，要準(zhǔn)確測(cè)定酶活力單位，就需要對(duì)最佳反應(yīng)條件及各種因素的影響進(jìn)行研究。酶促反應(yīng)有單底物反應(yīng)和多底物反應(yīng)之分。單底物酶促反應(yīng)包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反應(yīng)。單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度問題，即179各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度3、pH（最適pH的概念）4、溫度（最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時(shí)，v=k[E]各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度1、酶濃度當(dāng)S足夠過量180第一節(jié)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度與酶和底物間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系。因?yàn)槊负偷孜锸菢?gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動(dòng)力學(xué)關(guān)系是整個(gè)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)。描寫這種基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmax[S]/(Km+[S])第一節(jié)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系181單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象182米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：當(dāng)[Et]=[ES]時(shí)，(4)所以

米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：183酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線184當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比。[S]VVmax目錄當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比。[S]VVmax目185隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速。[S]VVmax目錄隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速。[S]VVmax186當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度。[S]VVmax目錄當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度。[S]V187第二節(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

—分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法)

將實(shí)驗(yàn)所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和[S]取倒數(shù)，得各種1/v和1/[S]，將1/v對(duì)1/[S]作圖，得一直線。該直線縱截距＝1/Vmax，斜率＝Km/Vmax，橫截距＝-1/Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須注意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km附近。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

—分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、1881.下圖是根據(jù)[S]在0.33～2.0Km范圍時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從此圖可準(zhǔn)確地測(cè)量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。1.下圖是根據(jù)[S]在0.33～2.0Km范圍時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而1892.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線基本上是水平的。這種情況雖可測(cè)得1/Vmax

，但由于直線斜率近乎零，-1/Km則難以測(cè)得。[S]在3.3～20Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。2.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線基本上1903.如果[S]比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)都接近原點(diǎn)，使-1/Km和1/Vmax

，都難以測(cè)準(zhǔn)。[S]在0.033～0.2Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。3.如果[S]比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)191二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程二、其它線性作圖法1922.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖1933.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程3.Eadie-Scatchard作圖法194以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使[S]比Km高得多或低得多。上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個(gè)缺點(diǎn)：第一，在v～[S]圖上，由相等增值而給出的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/v軸附近，而遠(yuǎn)離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是主觀目測(cè)以確定直線最權(quán)重的那些點(diǎn)。第二，在測(cè)定v時(shí)產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時(shí)會(huì)放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/[S]值所得的一兩個(gè)不準(zhǔn)確的點(diǎn)，會(huì)給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個(gè)缺點(diǎn)可通過選擇適當(dāng)?shù)腫S]，使1/[S]為等距離增值而得到克服。對(duì)第二個(gè)缺點(diǎn)關(guān)鍵要注意在低底物濃度下使所測(cè)初速度誤差盡可能減小。以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使[S]比Km高得多195[S]/v對(duì)[S]作圖，[S]未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對(duì)等距離[S]增值所測(cè)數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測(cè)定誤差較大時(shí)使用，比其它方法更可靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是根據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該法是把[S]值標(biāo)在橫軸的負(fù)半軸上，而把測(cè)得的v值標(biāo)在縱軸上，然后把相應(yīng)的v和[S]連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點(diǎn)，該交點(diǎn)坐標(biāo)為Km和Vmax。[S]/v對(duì)[S]作圖，[S]未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v196Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為其中是t這一段時(shí)間內(nèi)的平均速度；為反應(yīng)過程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對(duì)任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過與對(duì)比：Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理其中是t這一段197從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，即使反應(yīng)已進(jìn)行到30％，所引入的誤差也不過1％左右。很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來測(cè)定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理198酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反應(yīng)的速度必需測(cè)初速度2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法動(dòng)力學(xué)法

檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量，即用酶的活力表示。

酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反應(yīng)的速度必需測(cè)199酶活力測(cè)定方法

終點(diǎn)法:酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。

動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)物\底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度。酶活力測(cè)定方法終點(diǎn)法:酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后200

酶活力的表示方法活力單位（activeunit）

習(xí)慣單位（U）:底物(或產(chǎn)物)變化量/

單位時(shí)間國(guó)際單位（IU）:1μmoL變化量/

分鐘

Katal（Kat）：1moL變化量/

秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat）底物（μmoL）/秒·每個(gè)酶分子量度酶純度比活力（specificactivity）量度轉(zhuǎn)換效率酶活力的表示方法活力單位（activeunit）比活力201第四節(jié)酶的分析和檢測(cè)一、酶促反應(yīng)初速度隨[Et]的變化酶促反應(yīng)的初速度隨[Et]的變化而變化。通常在離體測(cè)定條件下，[Et]一般為10-12～10-7mol/L，而[St]為10-6～10-2mol/L?？蓪⒚资戏匠剔D(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)[S]為常數(shù)時(shí)，則初速度v與[Et]成正比。但一個(gè)酶促反應(yīng)速度，常因[S]的改變而改變。因此反應(yīng)時(shí)間必須盡可能短，使[S]幾乎處于恒態(tài)(即只有5％以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與[Et]之間的關(guān)系才會(huì)是線性的。第四節(jié)酶的分析和檢測(cè)一、酶促反應(yīng)初速度隨[Et]的變化這202二、酶活力單位和比活力是指酶在一定作用條件下，單位時(shí)間內(nèi)，使底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反應(yīng)的速度來度量，因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)臈l件下，v∝[E]。

為了使酶單位的文獻(xiàn)報(bào)道能統(tǒng)一，并具有可比性，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議曾制訂了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)酶單位。所謂特定條件，溫度定為25℃，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國(guó)際單位〔IU)。酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。二、酶活力單位和比活力203三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是許多酶為寡聚體。含幾個(gè)亞基，因此可用另一種方式來表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個(gè)值有時(shí)簡(jiǎn)單以min-1表示，即：酶的kp值約在50～107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即該酶一個(gè)催化周期為1.7微秒。三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)酶的kp值約在50～107min-1。碳酸酐酶204第五節(jié)酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究有