基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝

基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝

藥用蛋白質(zhì)的合成復(fù)雜，要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu)，要有糖基化，才能使藥物發(fā)揮真正的功能。細(xì)菌和酵母等產(chǎn)品要么是包涵體，要么難以糖基化功能修飾。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)有功能的蛋白質(zhì)，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞特別是人源細(xì)胞的培養(yǎng)在藥物生產(chǎn)中的位置會(huì)越來越重要。人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰質(zhì)炎、乙肝疫苗。干擾素、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品。組織型血纖蛋白溶酶原激活劑、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生長(zhǎng)因子等。第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征

昆蟲系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，最成功、重要表達(dá)活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)。

一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征1.動(dòng)物細(xì)胞的特征細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核沒有細(xì)胞壁。亞細(xì)胞器，功能獨(dú)特。2.動(dòng)物細(xì)胞代謝動(dòng)物細(xì)胞的不同代謝途徑及其相應(yīng)的酶體系定位于特定的亞細(xì)胞區(qū)域。通過胞內(nèi)運(yùn)輸（囊泡包裹）實(shí)現(xiàn)區(qū)域之間的物質(zhì)、信息和能量流動(dòng)，通過穿梭實(shí)現(xiàn)不同代謝途徑之間的交換。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體，因此動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補(bǔ)償，反之亦然。谷氨酰胺是動(dòng)物細(xì)胞的氮源，谷氨酰胺受限時(shí)，可增加其他氨基酸的消耗得以補(bǔ)償。糖代謝特點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞吸收葡萄糖后，進(jìn)行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進(jìn)一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為4、5、7碳糖和還原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

氨基酸代謝特點(diǎn)：吸收谷氨酰胺后，進(jìn)入氨基酸代謝途徑，通過脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。谷氨酸還原酶把谷氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物α-酮戊二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供能量。所以谷氨酰胺在細(xì)胞能量代謝中具有重要作用。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。在快速生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。

不同的培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸。在正常細(xì)胞系中，丙酮酸羧化產(chǎn)生草酰乙酸，而草酰乙酸來源于谷氨酰胺。在連續(xù)細(xì)胞系中，沒有這種流動(dòng)。能量是以ATP和NADPH的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細(xì)胞系對(duì)各個(gè)代謝途徑的貢獻(xiàn)和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個(gè)代謝過程，避免有毒廢物積累。

3.蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)合成是以mRNA為模板，在核糖體上完成。而蛋白質(zhì)的糖基化無需模板指導(dǎo)，因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化。糖蛋白的單糖單元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-巖藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神經(jīng)氨酸（或唾液酸）。糖基化類型：寡糖基以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為N-糖基化，或與氧原子結(jié)合為O-糖基化。這兩種糖基化的位點(diǎn)和數(shù)量及糖的種類都不同。N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序列為Asn-X-Thr/Ser(X為除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X為Trp、Asp、Glu和Leu，對(duì)糖基化有負(fù)影響，而第三位Thr能增強(qiáng)糖基化。N-糖基化分為高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型三種類型，共同核心是3個(gè)甘露糖和2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺組成的5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支鏈。高甘露糖型的支鏈為甘露聚糖（5～9聚體），無其他糖。復(fù)合型含有2個(gè)以上支鏈，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。雜合型至少含有一條復(fù)合糖鏈，另一個(gè)鏈含有甘露糖。O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還沒有發(fā)現(xiàn)保守序列。O-聚糖有四種不同的核心結(jié)構(gòu)，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化會(huì)影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象。O-糖基化比較小，一般為1～6個(gè)寡聚糖，但比N-糖基化變化更大。O-糖基化只在高爾基體上進(jìn)行，糖基單元有木糖、葡萄糖。糖基化磷脂酰肌醇錨著點(diǎn)：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用，都具有相同的核心結(jié)構(gòu)：膽胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋，而肌醇在膜內(nèi)。在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，磷脂酶C可切割此類蛋白，有利于純化。細(xì)胞特異性性糖基化途途徑——淋淋巴細(xì)胞中中進(jìn)行，它它不依賴于于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和和高爾基體體。IgG的的糖糖基基化化，，等等分分GlcNAc殘殘基基連連接接在在核核心心甘甘露露糖糖上上，，該該糖糖基基化化在在抗抗體體依依賴賴性性細(xì)細(xì)胞胞介介導(dǎo)導(dǎo)的的細(xì)細(xì)胞胞毒毒性性中中起起重重要要作作用用。。IgG蛋蛋白白的的鉸鉸鏈鏈區(qū)區(qū)，，富富含含Ser、、Thr和和Pro，，5個(gè)個(gè)Ser全全部部糖糖基基化化。。促黃黃體體激激素素、、促促甲甲狀狀腺腺素素等等的的硫硫酸酸化化只只能能在在垂垂體體中中發(fā)發(fā)生生。。盡管管哺哺乳乳動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞具具有有細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)的的糖糖基基化化裝裝置置，，但但不不同同細(xì)細(xì)胞胞系系，，糖糖基基化化特特征征不不同同。。鼠和和豬豬細(xì)細(xì)胞胞傾傾向向于于添添加加乙乙酰酰果果糖糖而而不不是是乙乙酰酰唾唾液液酸酸，，在在鼠鼠雜雜交交瘤瘤或或人人鼠鼠雜雜交交瘤瘤生生產(chǎn)產(chǎn)的的抗抗體體中中，，乙乙酰酰果果糖糖占占優(yōu)優(yōu)勢(shì)勢(shì)。。CHO細(xì)胞胞不不能能合合成成等等分分N-乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺，，而而鼠鼠細(xì)細(xì)胞胞系系卻卻能能形形成成半半乳乳糖糖末末端端，，對(duì)對(duì)人人有有免免疫疫原原性性。。要根根據(jù)據(jù)糖糖基基化化的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)，，選選擇擇適適宜宜的的細(xì)細(xì)胞胞系系。。細(xì)胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠雜交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴細(xì)胞++000++0++人垂體++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠雜交瘤++000+++02.哺哺乳乳動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)基因因工工程程哺哺乳乳動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞系系：：失失去去分分化化能能力力的的無無限限生生長(zhǎng)長(zhǎng)細(xì)細(xì)胞胞系系，，即即永永久久性性細(xì)細(xì)胞胞。。表表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)能能正正確確加加工工、、修修飾飾并并折折疊疊形形成成具具有有生生物物活活性性的的功功能能分分子子，，接接近近或或類類似似天天然然產(chǎn)產(chǎn)物物。。糖基基化化等等修修飾飾是是糖糖蛋蛋白白行行使使功功能能所所必必需需的的，，而而且且對(duì)對(duì)產(chǎn)產(chǎn)品品質(zhì)質(zhì)量量有有影影響響，，如如生生物物活活性性、、穩(wěn)穩(wěn)定定性性、、免免疫疫原原性性等等。。原原核核細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)的的EPO無無糖糖基基化化，，在在體體內(nèi)內(nèi)表表現(xiàn)現(xiàn)無無活活性性。。原原核核表表達(dá)達(dá)的的GM－－CSF雖雖有有活活性性，，但但在在體體內(nèi)內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)生生抗抗體體。。動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物分分泌泌到到培培養(yǎng)養(yǎng)液液，，容容易易分分離離純純化化。。約約有有70％％批批準(zhǔn)準(zhǔn)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)藥藥物物由由哺哺乳乳動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞系系統(tǒng)統(tǒng)表表達(dá)達(dá)制制造造，，而而且且數(shù)數(shù)目目還還在在不不斷斷增增加加。。表達(dá)系統(tǒng)O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖復(fù)合體大腸桿菌0000釀酒酵母＋＋0＋＋＋＋－昆蟲Sf9＋＋＋＋＋＋0－倉(cāng)鼠CHO＋＋＋＋0＋＋倉(cāng)鼠BHK＋＋＋＋0＋＋鼠雜交瘤＋＋＋＋0＋＋鼠骨髓瘤＋＋＋＋0＋＋C127＋＋＋＋0＋＋J558L＋＋－0＋＋人淋巴細(xì)胞＋＋00＋Namalwa＋＋＋＋0＋＋人鼠雜交瘤－＋＋0＋＋

大腸桿菌酵母哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物濃度高高低分子量低高高二硫鍵有限不受限制不受限制分泌無有或無有形式包涵體單鏈，天然單鏈，天然折疊不正確正確正確糖基化無可能完全逆轉(zhuǎn)錄病毒無無可能熱原可能無無培養(yǎng)特點(diǎn)容易容易較難，成本高分離純化復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單細(xì)胞類型表達(dá)水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.05猴COS1小鼠成纖維細(xì)胞C1271～5小鼠成纖維細(xì)胞3T30.1～0.5CHO（dhfr－）0.01~0.05CHO（dhfr－）10動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)的的不不足足是是細(xì)細(xì)胞胞生生長(zhǎng)長(zhǎng)緩緩慢慢，，生生產(chǎn)產(chǎn)效效率率較較低低，，產(chǎn)產(chǎn)量量遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落落后后于于其其他他表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)。。骨髓髓細(xì)細(xì)胞胞MPG－－11生生產(chǎn)產(chǎn)IgG的的能能力力為為5pg/(細(xì)細(xì)胞胞.分分鐘鐘)，，10L反反應(yīng)應(yīng)器器，，密密度度為為107/ml，，生生產(chǎn)產(chǎn)能能力力不不到到1g/d。。連續(xù)續(xù)細(xì)細(xì)胞胞系系增增加加了了生生長(zhǎng)長(zhǎng)和和代代謝謝速速率率，，但但同同時(shí)時(shí)導(dǎo)導(dǎo)致致了了副副產(chǎn)產(chǎn)物物的的增增加加。。動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞對(duì)對(duì)培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件要要求求苛苛刻刻和和敏敏感感，，對(duì)對(duì)溫溫度度、、pH、、滲滲透透壓壓、、剪剪切切力力等等忍忍受受能能力力差差。。培培養(yǎng)養(yǎng)基基要要求求高高，，需需要要添添加加氨氨基基酸酸、、維維生生素素等等，，往往往往需需要要附附加加血血清清，，提提供供生生長(zhǎng)長(zhǎng)因因子子，，費(fèi)費(fèi)用用較較高高。。同同時(shí)時(shí)可可能能有有潛潛在在的的致致病病因因子子、、免免疫疫原原性性存存在在。。表達(dá)達(dá)載載體體的的改改進(jìn)進(jìn)和和宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞的的改改造造是是動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)的的研研發(fā)發(fā)重重要要內(nèi)內(nèi)容容。。3.昆昆蟲蟲細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)與與特特征征表達(dá)達(dá)載載體體為為昆昆蟲蟲病病毒毒，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染昆昆蟲蟲細(xì)細(xì)胞胞，，表表達(dá)達(dá)出出目目標(biāo)標(biāo)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)。。昆昆蟲蟲病病毒毒主主要要有有桿桿狀狀病病毒毒科科核核多多角角體體病病毒毒。。苜蓿蓿尺尺蠖蠖核核多多角角體體病病毒毒－－秋秋黏黏蟲蟲細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)，，家家蠶蠶核核多多角角體體病病毒毒－－家家蠶蠶幼幼蟲蟲表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)。。Micro－－GeneSys公公司司表表達(dá)達(dá)艾艾滋滋病病基基因因工工程程疫疫苗苗，，隨隨后后豬豬生生長(zhǎng)長(zhǎng)素素、、CD4膜膜蛋蛋白白及及瘧瘧疾疾疫疫苗苗、、雞雞新新城城病病毒毒疫疫苗苗、、血血吸吸蟲蟲GST疫疫苗苗、、乙乙肝肝表表面面抗抗原原、、重重組組人人GM－－CSF等等。。日日本本批批準(zhǔn)準(zhǔn)用用家家蠶蠶系系統(tǒng)統(tǒng)生生產(chǎn)產(chǎn)干干擾擾素素已已上上市市。。生生物物試試劑劑盒盒的的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品品大大多多用用昆昆蟲蟲表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)生生產(chǎn)產(chǎn)。。至少少有有600多多種種昆昆蟲蟲可可以以作作為為宿宿主主，，每每年年有有數(shù)數(shù)百百個(gè)個(gè)基基因因利利用用昆昆蟲蟲系系統(tǒng)統(tǒng)進(jìn)進(jìn)行行表表達(dá)達(dá)，，越越來來越越成成為為非非常常有有用用的的表表達(dá)達(dá)宿宿主主。。優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)1））安安全全：：桿桿狀狀病病毒毒無無致致病病性性，，產(chǎn)產(chǎn)品品安安全全性性受受FDA認(rèn)認(rèn)可可。。2））易易飼飼養(yǎng)養(yǎng)：：家家蠶蠶喪喪失失了了野野外外生生存存能能力力，，飼飼養(yǎng)養(yǎng)，，發(fā)發(fā)育育快快，，3）高量量表達(dá)：：用強(qiáng)啟啟動(dòng)子，，外源基基因可超超量表達(dá)達(dá)。表達(dá)達(dá)產(chǎn)物在在昆蟲細(xì)細(xì)胞內(nèi)能能結(jié)晶，，對(duì)產(chǎn)物物純化非非常有意意義。4）高效效表達(dá)：：可容納納較大的的外源基基因（12kb），表表達(dá)數(shù)個(gè)個(gè)外源基基因，并并且正確確裝配成成有功能能的分子子。如表表達(dá)抗體體的重鏈鏈和輕鏈鏈，自主主裝配成成有功能能的抗體體。5）翻譯譯后的加加工：昆昆蟲細(xì)胞胞能進(jìn)行行一系列列翻譯后后的加工工，包括括糖基化化、脂肪肪酸?；?、磷磷酸化、、氨基酸酸的乙酰?；?、氨氨?；鹊?，大部部分產(chǎn)物物顯示出出良好的的活性。。缺點(diǎn)：1）重組率率低，篩篩選困難難，周期期長(zhǎng)，需需要4－10天。2）外源基基因的表表達(dá)在轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染的晚晚期，大大約在20h后起始基基因表達(dá)達(dá)，在72－94h細(xì)胞裂解解死亡，，基因表表達(dá)時(shí)間間約30－50h，高水平平表達(dá)不不連續(xù)且且時(shí)間短短，這對(duì)對(duì)表達(dá)不不利。3）昆蟲細(xì)細(xì)胞糖基基化等加加工途徑徑與哺乳乳動(dòng)物細(xì)細(xì)胞不完完全相同同，它不不提供復(fù)復(fù)雜的N糖基化，，如添加加半乳糖糖和唾液液酸殘基基，有可可能造成成溶解性性、穩(wěn)定定性、免免疫性等等變化。。表達(dá)水水平非常常高，加加工裝備備跟不上上，蛋白白質(zhì)修飾飾效率可可能不高高。研究開發(fā)發(fā)的主要要方向：：有效的的病毒表表達(dá)載體體；決定基因因表達(dá)時(shí)時(shí)期啟動(dòng)動(dòng)子，無無血清培培養(yǎng)昆蟲蟲細(xì)胞系系。第二節(jié)基基因工工程動(dòng)物物細(xì)胞系系的構(gòu)建建構(gòu)建高效效表達(dá)載載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物物細(xì)胞篩選鑒定定獲得生產(chǎn)產(chǎn)用工程程化細(xì)胞胞系動(dòng)物細(xì)胞胞的表達(dá)達(dá)載體：：病毒載載體，質(zhì)質(zhì)粒載體體。病毒載體體：逆轉(zhuǎn)錄病病毒、腺腺病毒、、痘苗病病毒、桿桿狀病毒毒等載體體，對(duì)原原始病毒毒改造而而來。同源重組組構(gòu)建腺腺病毒載載體，在在靜止期期轉(zhuǎn)染細(xì)細(xì)胞，表表達(dá)時(shí)間間較長(zhǎng)。。痘病毒載載體可插插入25～40kb外源基因因，甚至至是多個(gè)個(gè)基因。。無感染染性和致致癌性，，可用于于構(gòu)建基基因工程程疫苗。。美國(guó)Genentech公司已用用SV40載體生產(chǎn)產(chǎn)乙肝疫疫苗，其其他載體體可用于于基因治治療。質(zhì)粒載體體：微生物的的質(zhì)粒載載體類似似，一般般是穿梭梭質(zhì)粒，，具有兩兩個(gè)復(fù)制制子和抗抗性篩選選標(biāo)記基基因。大腸桿菌菌的復(fù)制制子，細(xì)細(xì)菌中繁繁殖。抗生素抗抗性標(biāo)記記，原核核細(xì)胞篩篩選。動(dòng)物細(xì)胞胞的復(fù)制制子，在宿主細(xì)細(xì)胞中穩(wěn)穩(wěn)定表達(dá)達(dá)。還有絲狀狀噬菌體體復(fù)制子子。啟動(dòng)子序序列：含含有RNA聚合合酶識(shí)別別和結(jié)合合位點(diǎn)，，以便有有效轉(zhuǎn)錄錄。TATA盒盒，確定定起始位位置；GG盒，，影響轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄頻率率。來源于病病毒、動(dòng)動(dòng)物基因因和噬菌菌體的啟啟動(dòng)子。。動(dòng)物病毒毒啟動(dòng)子子：逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒毒的長(zhǎng)末末端重復(fù)復(fù)序列（（LTRS）、、SV40病毒毒的早期期和晚期期啟動(dòng)子子、腺病病毒的晚晚期啟動(dòng)動(dòng)子、人人巨噬病病毒（CMV））立即早早期基因因啟動(dòng)子子。動(dòng)物基因因的啟動(dòng)動(dòng)子：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子子EF-1α啟啟動(dòng)子、、泛素蛋蛋白啟動(dòng)動(dòng)子、ββ-肌動(dòng)動(dòng)蛋白啟啟動(dòng)子、、干擾素素-α啟啟動(dòng)子、、IgG啟動(dòng)子子、鼠金金屬硫蛋蛋白基因因啟動(dòng)子子等。噬菌體T7啟動(dòng)動(dòng)子比動(dòng)動(dòng)物基因因啟動(dòng)子子表達(dá)水水平高。。PolyA信號(hào)號(hào)序列：：保持mRNA的穩(wěn)定定性，防防止降解解，保證證了轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物的的加工和和正確性性，但序序列不宜宜太長(zhǎng)，，避免能能量過度度消耗。。添加PolyA信號(hào)號(hào)和5′′端轉(zhuǎn)錄錄暫停位位點(diǎn)，可可以減少少上游序序列轉(zhuǎn)錄錄通讀造造成的背背景。牛生長(zhǎng)素素（BGH）基基因的PolyA信號(hào)號(hào)比SV40PolyA更更強(qiáng)，常常用于高高效表達(dá)達(dá)載體中中。終止序列列：AAUAAA或連連續(xù)的終終止密碼碼UGA、UAA和UAG，，能防止止轉(zhuǎn)錄通通讀，使使轉(zhuǎn)錄在在正確的的位點(diǎn)結(jié)結(jié)束。在轉(zhuǎn)錄起起始點(diǎn)上上游或下下游使用用相同類類型的增增強(qiáng)子，，有利于于提高外外源基因因的轉(zhuǎn)錄錄水平。。雙順反子子表達(dá)載載體：兩個(gè)基因因在同一一啟動(dòng)子子控制之之下，內(nèi)內(nèi)部核糖糖體進(jìn)入入位點(diǎn)使使同一mRNA中的第二二個(gè)基因因得到翻翻譯。將將dhfr與目標(biāo)基基因串連連，dhfr的cDNA插入內(nèi)含含子中，，其轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物被被剪切，，翻譯不不出蛋白白質(zhì)，而而目標(biāo)基基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物得到翻翻譯。順反子在在多亞基基蛋白的的偶聯(lián)表表達(dá)及其其控制策策略等方方面有廣廣泛應(yīng)用用前景。。使篩選容容易，而而且能高高效表達(dá)達(dá)。選擇適宜宜的啟動(dòng)動(dòng)子，可可實(shí)現(xiàn)定定向表達(dá)達(dá)。CMV啟啟動(dòng)子和和人EF-1αα啟動(dòng)子子，可實(shí)實(shí)現(xiàn)同一一載體上上的二個(gè)個(gè)基因的的獨(dú)立表表達(dá)。組織特異異性啟動(dòng)動(dòng)子：如如鼠、山山羊酪蛋蛋白啟動(dòng)動(dòng)子，可可使基因因主要在在乳腺中中表達(dá)。。N端設(shè)計(jì)計(jì)分泌信信號(hào)肽：：如Igκ鏈鏈的可變變區(qū)和恒恒定區(qū)之之間序列列，使外外源基因因的表達(dá)達(dá)產(chǎn)物向向胞外分分泌。C端設(shè)計(jì)計(jì)跨膜錨錨定序列列：可使使外源蛋蛋白展示示在細(xì)胞胞表面。。亞細(xì)胞定定位信號(hào)號(hào)肽：目目標(biāo)基因因產(chǎn)物將將轉(zhuǎn)運(yùn)到到細(xì)胞核核、線粒粒體、內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或或細(xì)胞質(zhì)質(zhì)中，這這對(duì)基因因的功能能研究非非常合適適?；虻臄U(kuò)擴(kuò)增系統(tǒng)統(tǒng)：在逐漸提提高選擇擇壓的情情況下，，使選擇擇標(biāo)記基基因拷貝貝數(shù)增加加，并可可連帶其其兩側(cè)序序列一起起擴(kuò)增，，從而提提高表達(dá)達(dá)基因水水平。最常用二二氫葉酸酸二氫葉葉酸還原原酶（DHFR）基因系系統(tǒng)和谷谷氨酰氨氨合成酶酶（GS）基因系系統(tǒng)。氨甲喋呤呤基因與與目標(biāo)基基因重組組，氨甲甲喋呤使使dhfr基因與目目標(biāo)基因因大量增增加，達(dá)達(dá)到數(shù)千千拷貝。。硫胺蛋氨氨酸使GS系統(tǒng)的基基因得到到大量擴(kuò)擴(kuò)增。二、受體體細(xì)胞1．人源源細(xì)胞株株系Namalwa：類淋淋巴母細(xì)細(xì)胞，非非整體核核型。表表達(dá)IgM，懸懸浮生長(zhǎng)長(zhǎng)。外源源基因的的表達(dá)水水平較高高，可用用無血清清培養(yǎng)基基高密度度培養(yǎng)，，已成功功地表達(dá)達(dá)了rhEPO、rhG-CSF、、tPA等。英英國(guó)Wellcome公司用用Namalwa細(xì)胞胞的反應(yīng)應(yīng)器達(dá)8000L，用用Sendai病毒誘誘導(dǎo)，大大規(guī)模生生產(chǎn)α干干擾素，，并批準(zhǔn)準(zhǔn)上市。。WI-38：二二倍體成成纖維細(xì)細(xì)胞系，，2n=46，，第一個(gè)個(gè)被用于于制備疫疫苗。貼貼壁生長(zhǎng)長(zhǎng)，對(duì)很很多病毒毒敏感，，廣泛用用于疫苗苗生產(chǎn)。。MRC-5：二二倍體成成纖維細(xì)細(xì)胞系，，但生長(zhǎng)長(zhǎng)較WI-38快，對(duì)對(duì)逆境有有一定抗抗性也用用于制備備疫苗。。2．哺乳乳動(dòng)物細(xì)細(xì)胞株系系CHO細(xì)細(xì)胞：中中國(guó)倉(cāng)鼠鼠卵巢中中分離的的上皮樣樣細(xì)胞系系，貼壁壁型生長(zhǎng)長(zhǎng)，是目目前使用用最為普普遍和成成熟的表表達(dá)糖基基化蛋白白藥物的的宿主細(xì)細(xì)胞。核核型為亞亞二倍體體，分泌泌表達(dá)外外源蛋白白，而內(nèi)內(nèi)源蛋白白分泌很很少。貼貼壁型生生長(zhǎng)細(xì)胞胞，但可可進(jìn)行懸懸浮培養(yǎng)養(yǎng)，對(duì)剪剪切力和和滲透壓壓有較高高的忍受受能力。。蛋白質(zhì)質(zhì)翻譯后后的修飾飾準(zhǔn)確，，表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的結(jié)結(jié)構(gòu)、性性質(zhì)和生生物活性性接近天天然。有多種衍衍生突變變株應(yīng)用用于藥物物的生產(chǎn)產(chǎn)，培養(yǎng)養(yǎng)時(shí)需要要添加脯脯氨酸。。二氫葉葉酸還原原酶缺陷陷株表達(dá)達(dá)的藥物物有tPA、EPO、、HBsAg疫疫苗、G-CSF、凝凝血因子子Ⅷ、DNA酶酶Ⅰ，已已上市。。使用氨甲甲酰喋呤呤，增加加外源基基因的拷拷貝數(shù)，，提高蛋蛋白質(zhì)表表達(dá)水平平。BHK－－21：：幼倉(cāng)鼠鼠腎臟中中分離的的成纖維維樣細(xì)胞胞，非整整倍體。。用于增增殖病毒毒、制備備疫苗和和重組蛋蛋白。BHK-21表表達(dá)的重重組凝血血因子ⅧⅧ已被獲獲準(zhǔn)上市市。C127：從小小鼠乳腺腺腫瘤中中分離獲獲得的上上皮樣細(xì)細(xì)胞，貼貼壁型生生長(zhǎng)。C127細(xì)胞系系已表達(dá)達(dá)多種外外源基因因，其中中EPO的水平平達(dá)10mg/L，，生產(chǎn)rhGH已被批批準(zhǔn)上市市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎胎培養(yǎng)物物中分離離建立的的連續(xù)細(xì)細(xì)胞系，，能大量量表達(dá)外外源蛋白白，廣泛泛用于藥藥物毒理理學(xué)研究究。骨髓瘤細(xì)細(xì)胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤細(xì)細(xì)胞，分分泌IgA，用于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染研究究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，與淋巴巴細(xì)胞融融合篩選選雜交瘤瘤，分泌泌制備特特異性抗抗體。雜交瘤細(xì)細(xì)胞：從從小鼠脾脾細(xì)胞與與骨髓瘤瘤細(xì)胞的的融合細(xì)細(xì)胞中分分離獲得得雜交瘤瘤細(xì)胞系系，能在在無血清清培養(yǎng)基基中高密密度懸浮浮生長(zhǎng)，，容易轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染和生生長(zhǎng)，能能進(jìn)行糖糖基化等等加工修修飾，大大量分泌泌和高效效表達(dá)。。很多雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞系用用于抗體體的制備備。Vero：從成成年非洲洲綠猴腎腎中分離離獲得的的貼壁型型成纖維維細(xì)胞，，多倍體體核型，，能適應(yīng)應(yīng)灌流操操作，進(jìn)進(jìn)行連續(xù)續(xù)培養(yǎng)。。已有突突變細(xì)胞胞系能用用無血清清培養(yǎng)。。最為常常用VeroE6增增殖多種種病毒，，如脊髓髓灰質(zhì)炎炎、狂犬犬病毒、、乙腦病病毒等，，生產(chǎn)病病毒性疫疫苗，已已被批準(zhǔn)準(zhǔn)用于人人體。也也可作為為轉(zhuǎn)染的的宿主細(xì)細(xì)胞，用用于表達(dá)達(dá)外源基基因的蛋蛋白質(zhì)藥藥物和病病毒的檢檢測(cè)。COS：是從SV40DNA轉(zhuǎn)化的非非洲綠猴猴腎細(xì)胞胞CV1中分離得得到的，，廣泛用用于外源源基因瞬瞬時(shí)表達(dá)達(dá)的研究究。GH3用用于生長(zhǎng)長(zhǎng)激素研研究，293細(xì)細(xì)胞系用用于基因因治療的的研究。。3．昆蟲蟲細(xì)胞株株系Sf21：從秋秋粘蟲卵卵巢細(xì)胞胞中分離離得到，，細(xì)胞較較大，容容易放大大，高效效表達(dá)外外源基因因。Sf9：：從秋粘粘蟲的卵卵巢細(xì)胞胞（SF21））中分離離得到，，是最常常用的昆昆蟲表達(dá)達(dá)細(xì)胞。。對(duì)桿狀狀病毒高高度敏感感，生長(zhǎng)長(zhǎng)快，能能高效表表達(dá)外源源基因。?？箼C(jī)械械剪切，，能在無無血清培培養(yǎng)基的的攪拌反反應(yīng)器中中生長(zhǎng)。。TN-5B1-4：從從粉紋夜夜蛾卵細(xì)細(xì)胞勻漿漿中分離離得到，，無血清清培養(yǎng)，，快速倍倍增。分分泌表達(dá)達(dá)重組蛋蛋白的能能力比Sf9細(xì)細(xì)胞系高高20多多倍，能能適應(yīng)懸懸浮培養(yǎng)養(yǎng)。三、細(xì)胞胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（是是將外源源基因?qū)?dǎo)入哺乳乳動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的技技術(shù)通用用名稱。?；?qū)?dǎo)入真核核細(xì)胞的的方法很很多，主主要有化化學(xué)轉(zhuǎn)染染、物理理轉(zhuǎn)染和和病毒介介導(dǎo)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)基因槍瞬時(shí)，穩(wěn)定無多種細(xì)胞組織，器官有效，儀器操作顯微注射瞬時(shí)，穩(wěn)定無多種細(xì)胞有效，技術(shù)難度大電穿孔瞬時(shí)，穩(wěn)定無多種細(xì)胞有效，儀器操作沖擊波瞬時(shí)，穩(wěn)定無多種細(xì)胞，局部組織簡(jiǎn)單有效，儀器操作方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)，穩(wěn)定無對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞有效原生質(zhì)體融合瞬時(shí)，穩(wěn)定無懸浮細(xì)胞技術(shù)復(fù)雜生物轉(zhuǎn)染染特點(diǎn)化學(xué)轉(zhuǎn)染染是最常常用的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染方法法。其基本原原理是磷磷酸鈣、、二乙氨氨乙基（（DEAE）－葡聚聚糖（dextran）和陽(yáng)離離子樹脂脂與核酸酸形成復(fù)復(fù)合物，，附著于于細(xì)胞表表面，通通過細(xì)胞胞的內(nèi)吞吞作用進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞胞。磷酸鈣與與DNA形成不溶溶性沉淀淀，帶正正電荷的的DEAE－葡聚糖糖與帶負(fù)負(fù)電荷的的DNA磷酸基團(tuán)團(tuán)結(jié)合，，陽(yáng)離子子樹脂包包裹DNA形成脂質(zhì)質(zhì)體。滲透性休休克和DMSO等化學(xué)試試劑能促促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞胞。轉(zhuǎn)染染試劑盒盒商業(yè)化化供應(yīng)，，特別是是脂質(zhì)體體材料的的轉(zhuǎn)染試試劑。影響因因素：：細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)物的的密度度、DNA的大小、純度度與用量、化化學(xué)試劑的用用量與處理時(shí)時(shí)間、促進(jìn)劑劑的使用等。。方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)磷酸鈣瞬時(shí)、穩(wěn)定無貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞簡(jiǎn)單DEAE-葡聚糖瞬時(shí)有CV1，COS簡(jiǎn)單陽(yáng)離子樹脂瞬時(shí)、穩(wěn)定有或無貼壁、原代懸浮細(xì)胞簡(jiǎn)單，有效化學(xué)轉(zhuǎn)染的特特點(diǎn)四、轉(zhuǎn)染體篩篩選與分離轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞胞，進(jìn)行核酸酸分子雜交或或蛋白質(zhì)雜交交，檢測(cè)外源源基因的瞬時(shí)時(shí)表達(dá)。為了獲得穩(wěn)定定整合的細(xì)胞胞系，先在非非選擇性培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小小時(shí)，讓細(xì)胞胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染染DNA表達(dá)達(dá)。再按1：：15比例轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到選擇性性培養(yǎng)基上，，每2～4天天更換培養(yǎng)基基，持續(xù)2～～3周，促進(jìn)進(jìn)抗性細(xì)胞生生長(zhǎng)，清除死死細(xì)胞殘骸，，最后得到獨(dú)獨(dú)立的克隆。。在轉(zhuǎn)染中大約約有萬分之一一的細(xì)胞將穩(wěn)穩(wěn)定整合外源源基因，因此此需要顯性選選擇標(biāo)記來分分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞的選擇標(biāo)記記，使用與之之相對(duì)應(yīng)的選選擇劑。選擇劑基因使用濃度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脫氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml殺瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada4μmol/L報(bào)告基因特點(diǎn)使用與分析方法cat內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范圍窄，體外，熒光或免疫分析lacZ有內(nèi)源活性，X-gal染色，線性范圍寬體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析堿性磷酸酶分泌型，線性范圍寬，受到細(xì)胞類型限制體外，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析gus蛋白質(zhì)穩(wěn)定，線性范圍寬，X-Gluc染色體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析gfp無內(nèi)源活性，分子量小，穩(wěn)定，無需底物，紫外線激發(fā)體內(nèi)外，熒光分析第三節(jié)動(dòng)物物細(xì)胞培養(yǎng)的的需求與培養(yǎng)養(yǎng)基的制備動(dòng)物細(xì)胞離體體后，失去了了消化等系統(tǒng)統(tǒng)，不能利用用多糖、蛋白白質(zhì)等聚合程程度高的化合合物。只能利用簡(jiǎn)單單的單體化合合物如單糖、、氨基酸等，，為了維持細(xì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)長(zhǎng)，還必須添添加維生素、、無機(jī)鹽類、、生長(zhǎng)類因子子及激素、結(jié)結(jié)合蛋白質(zhì)、、貼附與伸展展因子及其它它附加成分等等。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培培養(yǎng)環(huán)境的要要求高，不同同細(xì)胞系的要要求也不盡相相同，培養(yǎng)基基要盡可能與與體內(nèi)生活條條件接近。一、動(dòng)物細(xì)胞胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)需求1.糖類糖類是細(xì)胞主主要的營(yíng)養(yǎng)物物質(zhì)，分解后后釋放出能量量ATP。培養(yǎng)基中都必必須添加葡萄萄糖，有時(shí)添添加核糖等。。提高細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)的碳源和能能源，主要是是葡萄糖和谷谷氨酰胺。2.氨基酸酸氨基酸是蛋白白質(zhì)和酶的組組成單位。氨氨基酸還參與與合成一些含含氮化合物，，核苷酸的四四種嘌呤和嘧嘧啶堿基、兒兒茶酚胺等含含氮激素及神神經(jīng)遞質(zhì)等。。氨基酸可通通過生糖或生生酮途徑轉(zhuǎn)變變?yōu)樘腔蛑痉舅?，間接提提供能量。動(dòng)物細(xì)胞：8－10種必必須氨基酸。。離體容易失去去，20種氨氨基酸中至少少12種是必必需氨基酸：：精氨酸、半胱胱氨酸、組氨氨酸、異亮氨氨酸、亮氨酸酸、賴氨酸、、蛋氨酸、苯苯丙氨酸、蘇蘇氨酸、色氨氨酸、酪氨酸酸、纈氨酸等等。谷氨酰胺還可可作為重要的的碳源和能源源而被利用。。3.維生素素維生素是一類類微量的小分分子有機(jī)生物物活性物質(zhì)，，對(duì)代謝和生生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)和和控制作用。。水溶性維生素素包括B族維維生素和維生生素C。B族族維生素以輔輔酶或輔基形形式參與酶反反應(yīng)，主要調(diào)調(diào)節(jié)酶活性和和代謝活性。。維生素C，，抗壞血酸，，在體內(nèi)參與與還原反應(yīng)、、羥化反應(yīng)，，促進(jìn)膠原蛋蛋白合成和粘粘多糖合成，，抗氧化作用用。脂溶性維生素素包括維生素素A、D、E、K四種。。維生素A維持持正常視覺和和上皮組織。。維生素D為為視固醇類化化合物，主要要是調(diào)節(jié)鈣磷磷代謝。維生生素E即生育育酚，是抗氧氧化劑，防止止生物膜中磷磷脂的不飽和和脂肪酸被氧氧化。維生素素K，促進(jìn)合合成凝血酶原原，促進(jìn)血液液凝固。5.無機(jī)鹽鹽類無機(jī)鹽是細(xì)胞胞代謝所需的的酶的輔基，，同時(shí)保持細(xì)細(xì)胞的滲透壓壓和緩沖pH的變化。Na＋和Cl－參與生理電活活動(dòng)，維持水水平衡、保持持滲透壓和酸酸堿平衡。離離體培養(yǎng)為細(xì)細(xì)胞提供足夠夠的Na和Cl離子是基基本條件，一一般生理鹽水水的離子濃度度（0.9%NaCl）。Ca2＋、Mg2＋，對(duì)細(xì)胞間的的互黏穩(wěn)定起起重要作用。。在離體培養(yǎng)養(yǎng)時(shí)，螯合細(xì)細(xì)胞間的Ca2＋和Mg2＋，可以達(dá)到分分散細(xì)胞的目目的。磷是核酸、磷磷脂等的組成成成分。碳酸鹽緩沖液液是重要的體體內(nèi)緩沖體系系，與K＋、Cl－等在維持酸堿堿平衡具有重重要作用。6.生長(zhǎng)類類因子及激素素細(xì)胞之間是相相互聯(lián)系的，，而非孤立的的。特別是高高度分化功能能的動(dòng)物細(xì)胞胞更是如此。。細(xì)胞離體生長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)，必要添添加激素與細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子子等。胰島素素是最常用的的激素，促進(jìn)進(jìn)糖原和脂肪肪酸的合成，，對(duì)細(xì)胞的生生長(zhǎng)有刺激作作用。其它激激素有促卵泡泡激素、甲狀狀腺素、乳激激素、生育酚酚等。細(xì)胞因子有表表皮生長(zhǎng)因子子、成纖維細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子子和神經(jīng)細(xì)胞胞生長(zhǎng)因子，，根據(jù)不同細(xì)細(xì)胞添加。為了細(xì)胞的貼貼壁生長(zhǎng)，必必需添加貼附附因子，纖維維結(jié)合蛋白、、膠原等，伸伸展因子如表表皮生長(zhǎng)因子子、成纖維細(xì)細(xì)胞因子等。。二、動(dòng)物細(xì)胞胞培養(yǎng)的環(huán)境境需求1.水與滲滲透壓細(xì)胞生長(zhǎng)離不不開水，水是是細(xì)胞反應(yīng)的的重要介質(zhì)。。1）水是一一種良好的溶溶媒，營(yíng)養(yǎng)物物質(zhì)在水中被被吸收，廢物物在水中被排排泄。2）具具有熱穩(wěn)定性性和導(dǎo)熱性，，調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫溫度。正常血漿滲透透壓主要是無無機(jī)鹽Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等構(gòu)成，蛋白白質(zhì)構(gòu)成膠體體滲透壓較小小。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲滲透壓有較強(qiáng)強(qiáng)的耐受性，，常用增減NaCl的濃濃度調(diào)整滲透透壓，每增加加1mg/mlNaCl，滲透壓壓增加32mOsm/kg。離體培養(yǎng)細(xì)胞胞的滲透壓應(yīng)應(yīng)控制為等滲滲透溶液。2.溫度不同種類的動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)溫溫度的要求是是不同的，變變溫動(dòng)物對(duì)溫溫度要求沒有有恒溫動(dòng)物嚴(yán)嚴(yán)格。哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞最佳培養(yǎng)溫溫度為37℃，雞細(xì)胞為為39－40℃，而昆蟲蟲類細(xì)胞為25－28℃℃。在培養(yǎng)過程中中，根據(jù)細(xì)胞胞種類選擇確確定適宜的培培養(yǎng)溫度。哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞的耐受溫度度范圍較窄，，在35-37℃內(nèi)能正常進(jìn)進(jìn)行代謝和生生長(zhǎng)，超出范范圍會(huì)引起細(xì)細(xì)胞傷害甚至至死亡。細(xì)胞對(duì)低溫的的耐受性比高高溫要強(qiáng)，低低溫抑制生長(zhǎng)長(zhǎng)，但無傷害害作用，在冰冰點(diǎn)溫度附近近仍能存活。。3.氧氣動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)必須有氧氣氣，無氧下，，能獲得能量量供應(yīng)，但細(xì)細(xì)胞缺氧時(shí)不不能生存。離離體培養(yǎng)的氣氣體含有5％％CO2和95％空氣氣，其中氧濃濃度為21％％。有時(shí)充以以N2氣稀釋O2濃度。O2濃度在60%以上為高氧氧環(huán)境，對(duì)細(xì)細(xì)胞毒性較大大。4.pH值值動(dòng)物細(xì)胞對(duì)pH值很敏感感，低于6.8或超過7.6會(huì)產(chǎn)生生嚴(yán)重影響。。機(jī)體細(xì)胞的的pH范圍為為6－8，血血液和體液中中，變化范圍圍很小。人血血液pH維持持7.36-7.44。。pH低于7.05會(huì)發(fā)發(fā)生酸中毒，，高于7.45發(fā)生堿中中毒。細(xì)胞代代謝產(chǎn)生CO2，使培養(yǎng)液變變酸，pH發(fā)發(fā)生波動(dòng)。合合成培養(yǎng)基偏偏酸性，為了了穩(wěn)定pH，，可用緩沖體體系配制。在在開放體系中中，CO2逸出，使培養(yǎng)養(yǎng)基變堿。通通入5％CO2，可維持在pH7.2-7.4范圍圍內(nèi)。5.生長(zhǎng)基基質(zhì)改變生長(zhǎng)表面面特性，促進(jìn)進(jìn)細(xì)胞貼附的的物質(zhì)。貼附細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)需要一個(gè)支支持介質(zhì)，采采用在培養(yǎng)液液中添加或在在器皿表面覆覆蓋生長(zhǎng)基質(zhì)質(zhì)，幫助細(xì)胞胞的貼附和生生長(zhǎng)。生長(zhǎng)基質(zhì)為胞胞外基質(zhì)成分分，多聚賴氨氨酸、纖維連連接蛋白、膠膠原、層黏蛋蛋白、韌黏素素等。生長(zhǎng)基質(zhì)已有有商業(yè)化產(chǎn)品品，用PBS或BBS配成10倍貯存液液，在37℃下包被，靜靜置2－4小小時(shí)或室溫過過夜，對(duì)器皿皿表面進(jìn)行包包被，然后無無菌生理鹽水水洗滌后使用用。有些還可可以直接加入入培養(yǎng)液。生長(zhǎng)基質(zhì)貯存液濃度使用濃度使用方法多聚賴氨酸0.5mg/L0.05mg/L表面包被纖維連接蛋白10mg/ml1mg/ml加入培養(yǎng)液層粘蛋白

5～10μg/ml表面包被韌粘素75μg/ml5～15μg/ml包被或加入培養(yǎng)液膠原蛋白1～3mg/ml0.1mg/ml表面包被6．抗生素動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)過程中，由由于培養(yǎng)基營(yíng)營(yíng)養(yǎng)豐富，很很容易被微生生物污染。雖雖然對(duì)使用抗抗生素仍存在在質(zhì)疑，但還還是常添加抗抗生素，以避避免輕度污染染?？股厥褂脻鉂舛炔顒e很大大，一般范圍圍為50～100μg/ml。在在大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)中，除了青青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗抗生素外，其其它抗生素可可以使用?？股厥褂脤?duì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生生毒性，而且且使實(shí)驗(yàn)室保保留抗藥性微微生物，應(yīng)加加以注意和克克服?？股刈饔脤?duì)象工作濃度（μg/ml）穩(wěn)定性（天）兩性霉素B真菌1～2.53制霉菌素真菌503氨芐青霉素G＋、G－細(xì)菌1003紅霉素G＋細(xì)菌，支原體1003四環(huán)素G＋、G－細(xì)菌，支原體104慶大霉素G＋、G－細(xì)菌，支原體505利福平G＋、G－細(xì)菌503卡那霉素G＋、G－細(xì)菌1005鏈霉素G＋、G－細(xì)菌1003氯霉素G－細(xì)菌55青霉素GG＋細(xì)菌1003三、動(dòng)物細(xì)胞胞培養(yǎng)基的種種類與組成動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培培養(yǎng)基的要求求高，不同細(xì)細(xì)胞系的要求求也不盡相同同，因此培養(yǎng)養(yǎng)基成分復(fù)雜雜而且昂貴。。但是要盡可可能提供與體體內(nèi)生活條件件接近的培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境。主要要組成成分如如下：糖類、必需氨氨基酸、維生生素、無機(jī)鹽鹽類、生長(zhǎng)類類因子及激素素、結(jié)合蛋白白質(zhì)、貼附與與伸展因子及及其它附加成成分等。不同細(xì)胞對(duì)葡葡萄糖利用相相似，但對(duì)氨氨基酸的利用用相差很大，，不同的細(xì)胞胞過程對(duì)氨基基酸的需求存存在差別。目目前停留在流流加谷氨酰胺胺上。血清：蛋白質(zhì)質(zhì)、氨基酸、、葡萄糖、激激素和生長(zhǎng)因因子等。胎牛牛血清、新生生?；虺膳Ｑ濉ⅠR血清清、雞血清、、羊血清及人人血清，最廣廣泛應(yīng)用的為為胎牛血清和和新生牛血清清。水解乳蛋蛋白和膠原富富含氨基酸。。血清和水解解酪蛋白應(yīng)用用于許多細(xì)胞胞系和原代及及傳代細(xì)胞培培養(yǎng)。脂類化合物對(duì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培培養(yǎng)是必需的的，實(shí)際中類類脂及其前體體和血清常平平行使用。添添加的蛋白質(zhì)質(zhì)試劑主要有有鐵傳遞蛋白白，起離子載載體的作用，，有時(shí)用無機(jī)機(jī)鐵鹽代替。。胰島素起生生長(zhǎng)素的作用用，白蛋白起起保護(hù)劑作用用。其他附加加成分如核苷苷類及丙酮酸酸鹽等是培養(yǎng)養(yǎng)基的必需成成分，有助于于細(xì)胞克隆和和特異化細(xì)胞胞的培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)過程中，被被微生物污染染。常添加抗抗生素，以避避免輕度污染染。1.天然培培養(yǎng)基直接取自于動(dòng)動(dòng)物組織提取取液或體液作作為培養(yǎng)基，，如血漿凝塊塊、血清、淋淋巴液、胚胎胎浸出液等。。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高高，成分復(fù)雜雜，不穩(wěn)定，，來源受到限限制，不宜大大量培養(yǎng)和生生產(chǎn)使用。2.合成培培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基用用化學(xué)成分明明確的試劑配配制的培養(yǎng)基基，組分穩(wěn)定定?，F(xiàn)在已有有幾十種合成成培養(yǎng)基，大大部分已商品品化。組成：無機(jī)鹽鹽、糖、氨基基酸、維生素素及其他成分分。由于細(xì)胞種類類和培養(yǎng)條件件不同，所用用合成培養(yǎng)基基也不同，在在動(dòng)物細(xì)胞培培養(yǎng)中最常用用培養(yǎng)基有7－8種。3.無血清清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基基是全部用已已知成分組配配的、不加血血清的合成培培養(yǎng)基。在含含有營(yíng)養(yǎng)和貼貼壁因子的基基礎(chǔ)培養(yǎng)基中中，加入適宜宜的細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)因子，細(xì)胞胞良好生長(zhǎng)，，適合于制藥藥生產(chǎn)。無血清培養(yǎng)基基提高了培養(yǎng)養(yǎng)的質(zhì)量，避避免了使用血血清帶來的麻麻煩，產(chǎn)品純純化容易，組組分穩(wěn)定，可可大量配制。。無血清培養(yǎng)基基通常需要添添加激素與生生長(zhǎng)因子、結(jié)結(jié)合蛋白、貼貼壁與伸展因因子、低分子子營(yíng)養(yǎng)成分等等。大多數(shù)無血清清培養(yǎng)基含有有蛋白質(zhì)和激激素等大分子子物質(zhì)，適宜宜于多種細(xì)胞胞系的培養(yǎng)。。對(duì)于大規(guī)模模生產(chǎn)用的無無血清培養(yǎng)基基，往往成分分不完全清楚楚，但簡(jiǎn)單而而且低成本。。四、培養(yǎng)基的的控制1.培養(yǎng)用用水質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)水質(zhì)質(zhì)最低要求電電導(dǎo)率在1X106Ωcm以上上。水存放時(shí)時(shí)間不宜超過過2周。對(duì)于于制藥，必需需使用純凈水水配制培養(yǎng)基基，普通水必必需除去各類類元素有毒或或有害物質(zhì)及及微生物，還還必需除熱源源，達(dá)到純凈凈水標(biāo)準(zhǔn)。2.緩沖液液緩沖液：弱酸酸與弱酸鹽或或弱堿與弱堿堿鹽組成的，，pH恒定但但不干擾試驗(yàn)驗(yàn)。不同種類類細(xì)胞對(duì)pH要求不一一致，不同生生長(zhǎng)階段對(duì)pH要求也不不同。原代細(xì)細(xì)胞pH要求求嚴(yán)格，而傳傳代細(xì)胞要求求較寬。細(xì)胞胞培養(yǎng)過程中中代謝產(chǎn)生酸酸性物質(zhì)，使使培養(yǎng)基的pH不斷下降降。緩沖液中中和培養(yǎng)液中中的酸性物質(zhì)質(zhì)。最廣泛泛使用用為碳碳酸氫氫鈉/碳酸酸,其其次為為磷酸酸二氫氫鈉/磷酸酸氫二二鈉，，調(diào)節(jié)節(jié)二者者的比比例，，配制制成不不同pH緩緩沖液液。碳酸鹽鹽緩沖沖液除除了直直接的的緩沖沖作用用外，，還有有間接接作用用，碳碳酸生生成揮揮發(fā)性性CO2后很快快逸出出。細(xì)細(xì)胞呼呼吸產(chǎn)產(chǎn)生的的CO2與水形形成碳碳酸，，任何何堿在在培養(yǎng)養(yǎng)液中中都被被中和和，生生產(chǎn)相相應(yīng)碳碳酸氫氫鹽其他緩緩沖液液:Tricine-Glycine、MOPS、、TES、、HEPES、、DIPSO、、HEPPSO等等等有有機(jī)緩緩沖液液，緩緩沖能能力強(qiáng)強(qiáng)。Tris所所含氨氨基具具有高高的化化學(xué)反反應(yīng)活活性，，能抑抑制細(xì)細(xì)胞生生長(zhǎng)，，并通通過生生物膜膜，它它調(diào)節(jié)節(jié)pH要依依賴于于溫度度的變變化，，因此此不宜宜作為為培養(yǎng)養(yǎng)液。。離體體培養(yǎng)養(yǎng)中，，緩沖沖液多多為平平衡鹽鹽溶液液的重重要組組分之之一，，很少少單純純使用用。3.生生理理鹽水水與平平衡鹽鹽溶液液在緩沖沖液的的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，，添加加調(diào)節(jié)節(jié)滲透透壓的的鹽類類，在在一定定程度度上能能滿足足細(xì)胞胞對(duì)pH和和鹽離離子要要求。。緩沖液液或緩緩沖鹽鹽溶液液用于于:配配制溶溶液,處處理細(xì)細(xì)胞的的溶液液。對(duì)對(duì)于直直接接接觸、、長(zhǎng)期期培養(yǎng)養(yǎng)的培培養(yǎng)液液，常常用生生理鹽鹽水和和平衡衡鹽溶溶液，，是滲滲透壓壓與胞胞漿滲滲透壓壓平衡衡的溶溶液。。生理鹽鹽水供供給細(xì)細(xì)胞水水分和和各種種離子子，維維持一一定滲滲透壓壓，并并能良良好溶溶解試試劑和和藥物物。有有各種種不同同成分分的生生理鹽鹽水，，分別別加入入pH緩沖沖劑與與指示示劑、、葡萄萄糖，，形成成平衡衡鹽溶溶液。。平衡鹽鹽溶液液：集集緩沖沖液的的緩沖沖能力力、生生理鹽鹽水的的等滲滲能力力、營(yíng)營(yíng)養(yǎng)供供給為為一體體，具具有多多種功功能和和作用用。BSS配制制：1）先先分別別溶解解CaCl2、MgCl2、MgSO4。2）在在另一一容器器中依依次溶溶解其其他試試劑。。3）在在另一一容器器中用用5.6%NaHCO3數(shù)滴溶溶解酚酚紅。。4）將將含Ca2+、Mg2+溶液緩緩慢倒倒入步步驟2配制制的溶溶液中中，攪攪拌，，防止止沉淀淀。5）再再加入入酚紅紅溶液液。6）補(bǔ)補(bǔ)足水水，并并用NaHCO3調(diào)節(jié)pH。。含葡萄萄糖的的BSS過過濾除除菌，，不含含葡萄萄糖時(shí)時(shí)常規(guī)規(guī)高壓壓滅菌菌。小小量培培養(yǎng)液液可置置4度度保存存。一一旦出出現(xiàn)沉沉淀，，要重重新配配制。。注意事事項(xiàng)：：細(xì)胞只只利用用L型型氨基基酸，，不能能利用用D型型，對(duì)對(duì)于DL混混合型型氨基基酸，，使用用量應(yīng)應(yīng)該加加倍。。谷氨酰酰胺溶溶液中中很不不穩(wěn)定定，要要單獨(dú)獨(dú)配制制成濃濃縮液液。NaHCO3一般配配成3.7％、、5.6%、7.4%三三種濃濃度，，過濾濾除菌菌或高高壓滅滅菌，，4度度保存存，使使用前前加入入，調(diào)調(diào)節(jié)培培養(yǎng)基基pH。為了優(yōu)優(yōu)化細(xì)細(xì)胞生生長(zhǎng)環(huán)環(huán)境，，還添添加其其他成成分，，如嘌嘌呤和和嘧啶啶類，，維生生素C、谷谷胱甘甘肽、、巰基基乙醇醇。一般情情況下下，培培養(yǎng)基基成分分如氨氨基酸酸、維維生素素、葡葡萄糖糖、緩緩沖液液等、、補(bǔ)充充因子子幾類類，先先配制制成高高倍濃濃縮的的母液液，過過濾滅滅菌，，冷藏藏。使使用時(shí)時(shí)按一一定比比例稀稀釋，，配制制成工工作液液。第二節(jié)節(jié)動(dòng)動(dòng)物細(xì)細(xì)胞增增殖生生長(zhǎng)的的動(dòng)力力學(xué)過過程一、單單細(xì)胞胞生長(zhǎng)長(zhǎng)增殖殖周期期從一個(gè)個(gè)細(xì)胞胞分裂裂形成成兩個(gè)個(gè)新細(xì)細(xì)胞的的過程程為一一個(gè)細(xì)細(xì)胞周周期或或一個(gè)個(gè)細(xì)胞胞世代代。單單個(gè)細(xì)細(xì)胞周周期包包括細(xì)細(xì)胞間間期、、細(xì)胞胞分裂裂期，，間期期又包包括間間期1、DNA合成成期和和間期期2三三個(gè)時(shí)時(shí)期。。不同的的細(xì)胞胞類型型其分分裂周周期及及各期期的時(shí)時(shí)間都都不同同，培培養(yǎng)條條件及及培養(yǎng)養(yǎng)基成成分也也會(huì)影影響細(xì)細(xì)胞周周期,一般地地動(dòng)物物細(xì)胞胞分裂裂周期期為12－48小時(shí),典型的的細(xì)胞胞周期期為24小時(shí)。。對(duì)連續(xù)續(xù)細(xì)胞胞系，，失去去了細(xì)細(xì)胞周周期控控制，，人工工培養(yǎng)養(yǎng)條件件不適適，細(xì)細(xì)胞將將發(fā)生生程序序化死死亡即即凋亡亡。在在培養(yǎng)養(yǎng)過程程中，，缺乏乏生長(zhǎng)長(zhǎng)因子子或血血清、、營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)受限限和逆逆境等等可引引發(fā)凋凋亡發(fā)發(fā)生。。二、細(xì)細(xì)胞群群體的的生長(zhǎng)長(zhǎng)過程程細(xì)胞群群體生生長(zhǎng)增增殖過過程與與微生生物的的生長(zhǎng)長(zhǎng)增殖殖過程程相似似1.潛潛伏伏期，，細(xì)胞胞經(jīng)歷歷一段段懸浮浮狀態(tài)態(tài)，貼貼附于于器皿皿表面面。2.對(duì)對(duì)數(shù)數(shù)生長(zhǎng)長(zhǎng)期：：細(xì)胞胞分裂裂旺盛盛，指指數(shù)增增加。。細(xì)胞胞相互互接觸觸匯合合成片片，接接觸抑抑制，，限制制分裂裂和運(yùn)運(yùn)動(dòng)，，密度度不再再增加加。3.靜靜止止期：：分分裂數(shù)數(shù)與死死亡數(shù)數(shù)相等等的相相對(duì)動(dòng)動(dòng)態(tài)平平衡時(shí)時(shí)期。。4.衰衰亡期期：細(xì)細(xì)胞死死亡數(shù)數(shù)目大大于分分裂數(shù)數(shù)目的的時(shí)期期。三、群群體細(xì)細(xì)胞生生長(zhǎng)的的動(dòng)力力學(xué)參參數(shù)細(xì)胞分分裂代代數(shù)G就可可用下下列公公式計(jì)計(jì)算：：G＝logN－－logN0））/log2第四節(jié)節(jié)動(dòng)動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的的分離離與培培養(yǎng)一、細(xì)細(xì)胞的的種類類生物體體是由由多種種多樣樣的分分化細(xì)細(xì)胞構(gòu)構(gòu)成，，如人人體的的細(xì)胞胞類型型達(dá)200余種種。這些細(xì)細(xì)胞都都是由由受精精卵分分裂產(chǎn)產(chǎn)生的的細(xì)胞胞后代代生長(zhǎng)長(zhǎng)增殖殖分化化而來來。不不同細(xì)細(xì)胞具具有不不同的的功能能，細(xì)細(xì)胞分分化異異常導(dǎo)導(dǎo)致癌癌變。。分化化程度度越高高，脫脫分化化的能能力越越差。。在胚胎發(fā)發(fā)育過程程中，高高等動(dòng)物物細(xì)胞的的分化是是由全能能性變成成多能性性，再變變成單能能性，進(jìn)進(jìn)而失去去再分化化的能力力。雖然成熟熟細(xì)胞不不能再分分化，但但其細(xì)胞胞核仍然然具有全全能性，，因此可可以通過過核移植植，克隆隆動(dòng)物。。體外培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞，，可分為為原代細(xì)細(xì)胞系、、傳代細(xì)細(xì)胞。原代培養(yǎng)養(yǎng)：從體內(nèi)取取出的組組織細(xì)胞胞進(jìn)行體體外接種種培養(yǎng)，，原代培培養(yǎng)的細(xì)細(xì)胞為原原代細(xì)胞胞，它生生長(zhǎng)分裂裂并不旺旺盛，與與體內(nèi)細(xì)細(xì)胞相似似，適合合于藥物物檢測(cè)實(shí)實(shí)驗(yàn)。生生產(chǎn)中有有些產(chǎn)品品仍沿用用原代細(xì)細(xì)胞，如如雞胚細(xì)細(xì)胞，兔兔或鼠腎腎細(xì)胞、、淋巴細(xì)細(xì)胞。傳代細(xì)胞胞:原代細(xì)胞胞轉(zhuǎn)接后后培養(yǎng)的的細(xì)胞。。傳代后后，細(xì)胞胞分裂增增殖旺盛盛，能保保持一致致的二倍倍體核型型，所以以又成為為二倍體體細(xì)胞系系。傳代代細(xì)胞的的增殖能能力有限限，所以以也稱為為有限細(xì)細(xì)胞系。。如WI－38、MRC－5、2BS等用用于生產(chǎn)產(chǎn)。根據(jù)細(xì)胞胞的傳代代次數(shù)和和壽命，，可分為為有限細(xì)細(xì)胞系和和無限細(xì)細(xì)胞系或或連續(xù)細(xì)細(xì)胞系。。有限細(xì)胞胞系:正正常細(xì)胞胞經(jīng)過多多次傳代代后，一一般可連連續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)30－－50代代，就會(huì)會(huì)逐漸失失去增殖殖能力，，也就是是說它們們只能生生長(zhǎng)有限限的時(shí)間間，經(jīng)過過若干傳傳代培養(yǎng)養(yǎng)后將老老化死亡亡。無限細(xì)胞胞系：當(dāng)當(dāng)細(xì)胞經(jīng)經(jīng)過自然然或人為為的因素素轉(zhuǎn)化為為異倍體體后，才才能變?yōu)闉闊o限細(xì)細(xì)胞系。。如腫瘤瘤細(xì)胞就就是自發(fā)發(fā)形成的的永久細(xì)細(xì)胞系，，沒有分分裂次數(shù)數(shù)的限制制。物理理、化學(xué)學(xué)或生物物因素也也能獲得得。細(xì)胞壽命命無限，，生長(zhǎng)不不受細(xì)胞胞密度的的影響，，倍增時(shí)時(shí)間短不不具接觸觸抑制現(xiàn)現(xiàn)象，它它對(duì)培養(yǎng)養(yǎng)條件和和生長(zhǎng)因因子等要要求低，，，非常常適合于于工業(yè)化化生產(chǎn)，，理想的的藥物生生產(chǎn)細(xì)胞胞系。根據(jù)細(xì)胞胞對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)特性和和對(duì)基質(zhì)質(zhì)的依賴賴性，可可分為貼貼壁依賴賴性細(xì)胞胞和非貼貼壁依賴賴性細(xì)胞胞。貼壁依賴賴性細(xì)胞胞：生長(zhǎng)長(zhǎng)需要在在適量帶帶電荷的的固體或或半固體體支持表表面，細(xì)細(xì)胞自身身分泌或或人為在在培養(yǎng)基基中加入入貼附因因子，使使細(xì)胞依依附在支支持物表表面，才才能生長(zhǎng)長(zhǎng)和增殖殖，大多多數(shù)動(dòng)物物細(xì)胞都都屬于此此類。非貼壁依依賴性細(xì)細(xì)胞：生生長(zhǎng)不依依賴于固固體支持持物表面面，可在在培養(yǎng)液液中懸浮浮生長(zhǎng)，，有時(shí)被被稱為懸懸浮細(xì)胞胞。血液液、淋巴巴細(xì)胞、、腫瘤細(xì)細(xì)胞和某某些轉(zhuǎn)化化細(xì)胞屬屬于此類類，生長(zhǎng)長(zhǎng)干擾素素的Namalwa細(xì)細(xì)胞。有些細(xì)胞胞對(duì)支持持物的依依賴性不不嚴(yán)格，，可貼壁壁生長(zhǎng)，，可懸浮浮生長(zhǎng)。。中國(guó)倉(cāng)倉(cāng)鼠卵巢巢細(xì)胞、、小鼠L929細(xì)胞、、BHK細(xì)胞。。二、工程程細(xì)胞的的獲得與與保存目前用于于制藥的的動(dòng)物細(xì)細(xì)胞有4類，即即原代細(xì)細(xì)胞系、、二倍體體細(xì)胞系系、異倍倍體細(xì)胞胞系和融融合的或或重組的的工程細(xì)細(xì)胞系。。細(xì)胞無限限傳代，，使大規(guī)規(guī)模工業(yè)業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)藥物成成為可能能。異倍體細(xì)細(xì)胞用于于產(chǎn)生重重組基因因工程產(chǎn)產(chǎn)品，使使動(dòng)物細(xì)細(xì)胞成為為藥物生生產(chǎn)的一一個(gè)新領(lǐng)領(lǐng)域。1.原原代細(xì)胞胞系的分分離與培培養(yǎng)用原代細(xì)細(xì)胞系生生產(chǎn)藥物物需要大大量的動(dòng)動(dòng)物。動(dòng)物組織織或器官官洗滌粉粉碎酶解消化化離心或過過濾接種培養(yǎng)養(yǎng)培養(yǎng)液稀稀釋細(xì)胞胞洗滌37度消消化，檢檢查是否否充分和和完全。。胰蛋白酶酶：細(xì)胞胞間質(zhì)較較少的軟軟組織，，胚胎、、肝、腎腎及傳代代細(xì)胞膠原酶：：纖維、、上皮、、癌組織織工作濃度度：0.1-0.3mg/ml鏈霉蛋白白酶、粘粘蛋白酶酶、蝸牛牛酶2.傳傳代細(xì)胞胞培養(yǎng)長(zhǎng)滿器皿皿表面的的細(xì)胞進(jìn)進(jìn)行分離離，接種種到新的的培養(yǎng)基基上，進(jìn)進(jìn)行新一一輪培養(yǎng)養(yǎng)。掌握好最最佳時(shí)期期：剛剛剛?cè)繀R匯合的細(xì)細(xì)胞，過過早產(chǎn)量量低，過過晚健康康狀態(tài)不不佳。過程與原原代細(xì)胞胞相同，，用30－50倍體的的0.25％胰胰蛋白酶酶和EDTA對(duì)對(duì)細(xì)胞塊塊消化，，消化后后再培養(yǎng)養(yǎng)。要注意消消化程度度，細(xì)胞胞對(duì)酶的的反應(yīng)不不同，有有的敏感感，掌握握好適宜宜的消化化時(shí)間和和方法，，不要過過度，獲獲得細(xì)胞胞濃度均均勻，生生長(zhǎng)速度度一致的的傳代細(xì)細(xì)胞。曾經(jīng)廣泛泛應(yīng)用，，但不是是理想的的生產(chǎn)細(xì)細(xì)胞系3.細(xì)細(xì)胞系的的建立與與保存一旦獲得得了穩(wěn)定定的有一一定特性性的細(xì)胞胞系，就就建立細(xì)細(xì)胞庫(kù)，，進(jìn)行長(zhǎng)長(zhǎng)期保存存。根據(jù)據(jù)藥品生生產(chǎn)的有有關(guān)規(guī)定定，必須須建立原原始細(xì)胞胞庫(kù)和生生產(chǎn)用細(xì)細(xì)胞庫(kù)或或工作細(xì)細(xì)胞庫(kù)。。WCB1QCWCB2QCQC原始培養(yǎng)物MCBQC內(nèi)容容：細(xì)胞胞活性檢檢測(cè)、無無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)、核型型、DNA分析、同同工酶分分析、支支原體試試驗(yàn)、其其他外源源物試驗(yàn)驗(yàn)、穩(wěn)定定性和基基因型分分析等，，工作細(xì)細(xì)胞庫(kù)必必須與主主細(xì)胞庫(kù)庫(kù)完全一一致。低溫冷凍凍保存：：用冷凍保保護(hù)液（（含10％血清清的培養(yǎng)養(yǎng)液，附附加10％甘油油或7.5%-10%二甲基基亞砜））細(xì)胞預(yù)預(yù)冷，稀稀釋成106細(xì)胞/ml。分分裝，火火焰下封封口。緩緩慢冷凍凍，細(xì)胞胞放入CO2低溫冰柜柜或液氮氮中，溫溫度為-150—-190℃，細(xì)胞的的全部活活動(dòng)幾乎乎處于停停止?fàn)顟B(tài)態(tài)。復(fù)蘇細(xì)胞胞：冷凍細(xì)胞胞取出，，立即在在37℃水浴中，，快速融融化。在在保護(hù)劑劑存在下下，慢凍凍快融是是保存復(fù)復(fù)蘇細(xì)胞胞的要領(lǐng)領(lǐng)。融化化后的細(xì)細(xì)胞可用用于進(jìn)一一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。三、大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)方法根據(jù)動(dòng)物物細(xì)胞的的生長(zhǎng)特特點(diǎn)，只只能采用用懸浮培培養(yǎng)、貼貼壁培養(yǎng)養(yǎng)、固定定化培養(yǎng)養(yǎng)等三種種主要方方法進(jìn)行行大規(guī)模模培養(yǎng)。。1.單單層貼壁壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附附于一定定的固體體支持表表面上，，進(jìn)行的的培養(yǎng)方方法。大大多數(shù)動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞胞屬于貼貼壁依賴賴性，貼貼壁培養(yǎng)養(yǎng)是動(dòng)物物細(xì)胞培培養(yǎng)的一一種重要要方法。。接種后后，細(xì)胞胞經(jīng)過吸吸附、