pce實(shí)驗(yàn)室組成與基本操作28h課件

努力學(xué)習(xí)，無論做什么都要盡你所能盡力而為。Studyhardandwhateveryoudo,doitaswellasyoupossiblecan.

—卡爾·CarlWieman2001年諾貝爾物理學(xué)獎獲得者

植物細(xì)胞工程主講教師：邵景俠TEL：E-mail：

目錄緒論(2h)第一章植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及基本操作技術(shù)(2h)第二章植物細(xì)胞工程原理概述(4h)第三章植物離體快繁技術(shù)和脫毒培養(yǎng)技術(shù)(4h)第四章植物離體單倍體誘導(dǎo)技術(shù)及應(yīng)用(2h)第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn)(2h)第六章植物體細(xì)胞無性系變異與突變體篩選(2h)第七章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交(2h)第八章植物胚胎培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用(2h)第九章植物種質(zhì)資源的離體保存(1h)第十章植物的遺傳轉(zhuǎn)化(1h)植物組織培養(yǎng)的一般程序

第一章

植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及基本操作技術(shù)

第一節(jié)：植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

第二節(jié)：基本操作技術(shù)

第三節(jié)

培養(yǎng)基的成分及配制方法第一節(jié)：植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計二、儀器設(shè)備及玻璃器皿一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計

植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室有化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、無菌室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室、攝影室、滅菌室等，（如下圖）

1、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室

用途：藥物放置、稱取、配制

儀器存放、洗滌、干燥、滅菌

培養(yǎng)基配制、消毒

制蒸餾水

接種材料：準(zhǔn)備、培養(yǎng)

要求：干凈、便于工作

放置的儀器：藥物柜、天平、烘箱、培養(yǎng)箱、

高壓滅菌器、無離子水發(fā)生器、蒸餾水器

水槽、電爐……

準(zhǔn)備室的設(shè)置及配備

2、無菌操作室

用途：接種外植體、轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，原生質(zhì)體的游離、放滅菌后用的培養(yǎng)基。

要求：關(guān)鍵保持較長時間無菌狀態(tài)。

要做到以下幾點(diǎn)：

墻壁地面光滑平整無縫隙；

空氣不對流，空氣凈化后入室內(nèi)，一天換

一次空氣或裝排氣扇；

控制溫度；

裝日光燈照明，紫外光燈消毒，工作臺裝

紫外燈消毒。

設(shè)緩沖間

作用：防工作人員帶入雜菌，約2㎡即可。

設(shè)洗手池、裝消毒液、衣架，供工作人員換衣、鞋、帽、口罩。

定期消毒：2%新潔爾滅溶液擦地板，每天甲醛、KMnO4消毒。

設(shè)置：培養(yǎng)架：放滅菌后待接種的培養(yǎng)基；

照明燈、消毒紫外光、排氣扇。

超凈工作臺或接種箱，接種箱有單人、

雙人操作兩種。(如圖2）

55cm40cm60cm18cm玻璃燈（照明、紫外線）單人接種箱雙人接種箱接種室的設(shè)置和配備設(shè)置：

光培養(yǎng)室：培養(yǎng)物上方裝日光燈，用于分化培養(yǎng)。

暗培養(yǎng)室：用于誘導(dǎo)培養(yǎng)或紫外檢測。

培養(yǎng)架：用于固體培養(yǎng)，用3*3cm或2.5*2.5cm萬用角鐵搭成4—6層，最低一層離地40cm左右，每層間隔30cm，一般1.3m長，寬50cm，每層裝2支40w日光燈。

搖床、轉(zhuǎn)床轉(zhuǎn)床（旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)）培養(yǎng)室的設(shè)置及配備培養(yǎng)架攝影顯微鏡雙目顯微鏡解剖鏡5、攝影室

6、滅菌室

用途：器皿、培養(yǎng)基高溫高壓滅菌、消毒、制蒸餾水。

要求：防潮、耐高溫、室內(nèi)排供水良好，通氣、易排蒸氣、熱量。

設(shè)備：水、電、煤氣、高溫高壓消毒儀器、制蒸餾水器。

二、儀器設(shè)備及玻璃器皿

1、儀器設(shè)備:

A、天平

B、烘箱

C、恒溫箱

D、冰箱

E、酸度計

F、超凈工作臺

使用：臺面擺放接種工具。

接種前紫外光燈照射20分鐘、操作人員入室后關(guān)燈，開動超凈臺10分鐘后（風(fēng)機(jī)鼓風(fēng)）才開始接種。使用前、后臺面用棉花酒精點(diǎn)火擦拭滅菌。

G、滅菌器：有手提式、立體和臥式三種。

H、離心機(jī)

I、顯微鏡及顯微攝影

J、搖床和轉(zhuǎn)床

A、玻璃器皿：種類多、規(guī)格多

常用的有：三角瓶、容量瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒、吸管、燒杯等。

2、玻璃器皿和用具:

第二節(jié)基本操作技術(shù)

一、清洗二、消毒滅菌三、接種一、清洗1.

玻璃器皿的清洗①

洗滌分為酸洗和堿洗兩種方法，酸洗法目前常用稀鹽酸或鉻酸洗滌液，鉻酸洗滌液是強(qiáng)的氧化劑，去污力強(qiáng)，但對油脂類無效。洗液的配制：稱量40克工業(yè)用重鉻酸鉀，先用少量水溶解，然后徐徐加入粗制濃硫酸（800毫升），最后定容1000毫升。堿洗主要用的是肥皂液和去污粉，它們均是良好的去污劑，肥皂液在加熱后去污力更強(qiáng)。

洗滌順序：去除油漬、培養(yǎng)基、霉菌等臟物↓洗衣粉或洗潔精洗刷，使內(nèi)壁不掛水珠↓清水沖洗數(shù)次↓晾、烘干備用較臟的玻璃器皿：肥皂水清洗晾干洗液浸幾分鐘至幾天取出滴干洗液清水沖干凈后晾干備用。長形器皿（吸管、移液管……）：

洗液浸滴干清水洗凈。

蓋載玻片：

分開洗、水洗后洗液浸幾小時或稀洗液中煮沸半小時清水洗凈軟布擦干放95%酒精溶液中（滴少量濃鹽酸）浸用時取出，燒或擦干。

新的玻璃器皿：有游離堿性物質(zhì)。

用1%鹽酸溶液浸一晝夜肥皂水洗

清水洗蒸餾水淋一遍干燥備用。

2.試驗(yàn)材料的洗滌外植體：從田間取回材料自來水沖洗中性洗衣粉清洗再用自來水洗滅菌

二、消毒滅菌

（一）常用的消毒滅菌方法及其使用范圍：

物理滅菌：高溫高壓滅菌(濕熱滅菌)

干熱滅菌

射線輻射

過濾滅菌

化學(xué)滅菌：熏蒸滅菌

消毒液滅菌（酒精、氯化

汞、次氯酸鈉（鈣）

溶液）。

1、高溫高壓滅菌

濕熱滅菌：用于培養(yǎng)基、工作服、口罩、帽子

用具、無菌水滅菌

方法：加熱到0.5kg/cm2放掉冷空氣,再加熱到1.1kg/cm2

，121℃，保持15—20分鐘降壓取出。

效果：殺死一切微生物的營養(yǎng)體及其孢子。

2、干熱滅菌

適于玻璃器皿滅菌。

烘箱：150℃40分鐘或120℃2小時。

金屬用具：使用前浸在70%酒精中，用的時候

酒精燈上面燒，冷卻后再用?；蚝嫦?/p>

120℃滅菌2小時

干熱滅菌3、過濾滅菌

超凈臺：篩網(wǎng)過濾空氣

液體：激素，培養(yǎng)液……原理：不同孔徑方法：（圖）如果是滅菌少量液體，可以采用一種簡單的的濾器。過濾法用途廣泛，除在飲料、藥物生產(chǎn)中使用外，空氣也常常用過濾法除菌。我們通常做微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時滅過菌的容器一般用棉花塞堵在出口處，實(shí)際上就是過濾除去空氣中的微生物，使進(jìn)入容器的空氣中沒有微生物污染。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的超凈臺也是用過濾法除菌。

4、射線滅菌培養(yǎng)室接種室花粉射線滅菌

5、化學(xué)滅菌熏蒸滅菌法：甲醛+高錳酸鉀

消毒液：

70—75%酒精溶液：氯化汞：

新潔爾滅溶液：次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液

5、化學(xué)滅菌熏蒸滅菌法：甲醛+高錳酸鉀

消毒液：種類多，各種效果不同

70—75%酒精溶液：適于各種滅菌，殺菌效果好，易揮發(fā)，滲透力強(qiáng)，滅菌時間不宜長。外植體有傷口時，易受損傷。

氯化汞：多用作接種材料消毒，用0.1%溶液消毒10—20分鐘，去除較難，但效果最好。殺菌力強(qiáng)。

新潔爾滅溶液：地板、手…消毒次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液熏蒸滅菌常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑名稱使用濃度%消毒難易滅菌時間滅菌效果酒精70-75易0.1-3好氯化汞0.1-0.2較難2-10最好漂白粉飽和溶液易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好次氯酸鈉2（活性氧）易5-30很好過氧化氫10-12最易5-15好抗菌素4-50mg/L中30-60較好（二）滅菌

培養(yǎng)材料的滅菌培養(yǎng)基的滅菌

1.

培養(yǎng)材料的滅菌培養(yǎng)材料的滅菌，一般用藥劑滅菌。方法是先用清水沖洗，然后在一定濃度的藥液中進(jìn)行浸泡滅菌。藥劑的濃度和浸泡時間，應(yīng)根據(jù)植物種類或不同器官進(jìn)行選擇。a.

莖尖、莖段及葉片等材料的滅菌b.果實(shí)及種子的滅菌c.花藥滅菌d.根及地下器官的滅菌

2.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌常用的方法有兩種，a.高壓蒸汽滅菌:適用于固體培養(yǎng)基的滅菌b.過濾滅菌：適用于液體培養(yǎng)基的滅菌Ⅰ：高壓蒸汽滅菌鍋不可過滿。

Ⅱ：鍋內(nèi)冷空氣必須排盡。

Ⅲ：鍋內(nèi)達(dá)到一定壓力后，注意在保持壓力的過程中，嚴(yán)遵守時間。

Ⅳ：三角瓶中的液體不超過總體積的70%。使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌應(yīng)注意：三、接種

1.接種操作過程：

新潔爾滅溶液拖地板甲醛、高錳酸鉀熏蒸工作前開紫外光燈20分鐘開動超凈臺10—5分鐘新潔爾滅洗手，70%酒精擦手擦超凈臺面點(diǎn)燃酒精燈燒培養(yǎng)瓶口滅菌燒工具酒精燈上無菌區(qū)內(nèi)接種燒瓶口蓋上蓋。

2.注意事項(xiàng)：無菌操作室（接種室）接種臺工作人員。d.當(dāng)接種打開包頭紙時，注意不要污染瓶口。第三節(jié)培養(yǎng)基的成分及

配制方法

一、培養(yǎng)基的成分及其作用二、培養(yǎng)基的種類及成分三、培養(yǎng)基的制備四、植物材料無菌培養(yǎng)的一般程序一、培養(yǎng)基的成分及其作用

組成：水

無機(jī)營養(yǎng)：大量元素

微量元素

有機(jī)營養(yǎng)：碳源

維生素

氨基酸

植物激素

天然提取物

瓊脂

其它：活性炭、抗生素、

抗酚類物質(zhì)污染的添加劑、

生長抑制劑、染色劑……

（一）、水：培養(yǎng)基大部分是水

來源：一般用無菌水

作用：起媒介作用

組成作物體（占75—80%）

提供O、H元素

運(yùn)輸物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓

（二）、無機(jī)營養(yǎng)

大量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以上。

微量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以下。

大量元素：O、H、N、C、P、K、Mg、

S、Ca

N：

來源：硝態(tài)或氨態(tài)氮，或兩者混用。

作用：N吸收轉(zhuǎn)化——氨基酸——蛋白質(zhì)；

蛋白質(zhì)主要組分是N，核酸含N，

酶本身是蛋白質(zhì)；

細(xì)胞生長分化需N。P：

來源：NaH2PH4或KH2PO4

作用：是植物體必需元素之一；

與蛋白質(zhì)合成有關(guān)，缺磷蛋白質(zhì)含量降；

高能磷酸鍵的化合物，供能ATP；

與生命活動關(guān)系大，形成核蛋白、含P化合物、核酸組合；

碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪合成、相互轉(zhuǎn)化需磷。

K：

來源：KCL、KNO3、KH2PO4

作用：酶促反應(yīng)活化劑。

Ca：

來源：CaCL2.H2O或Ca(NO3)2.4H2O、

作用：影響酶的活性方向。

決定新陳代謝的過程。

構(gòu)造細(xì)胞壁，影響細(xì)胞分裂。

Mg、S：

來源：MgSO4.7H2O滿足硫鎂的需要。

鎂是葉綠素組分。

作用：S是蛋白質(zhì)、氨基酸、酶的組分，缺S影

響蛋白質(zhì)合成、影響葉綠素形成。

微量元素：

Na、Cu、Zn、Fe、B、Mn、Mo、I……

稍過量會發(fā)生中毒，但對生命活動很重要Na：酶的組成成分，防葉綠素破壞。Fe：來源：Na2EDTA螯合劑加FeSO4.7H2O和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）螯合鐵，PH7.6—8。作用：植物組織延長生長有作用。Mn：與植物呼吸作用、光合作用有關(guān)

Cu：促離體根生長。

B：影響蛋白質(zhì)合成。

注意：

不同培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度相差有的高達(dá)10倍；

高濃度無機(jī)鹽保證組織生長需要的礦質(zhì)營養(yǎng)，使生長加快；

生根要求無機(jī)鹽濃度低些。（三）、有機(jī)營養(yǎng)

包括C、維生素、氨基酸、植物激素。

1.碳來源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麥芽

糖、纖維二糖……或多糖類的可溶性淀

粉、糊精及果膠……,一般2—3%的蔗糖。

作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓；

構(gòu)造植物體；

參與新陳代謝。

注意:不同濃度影響細(xì)胞的增殖分化。

2.維生素類：

總的作用：直接參與生物催化劑——酶的形成及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝。

維生素C（抗壞血酸）：強(qiáng)還原能力，防組

織氧化變褐。

B1（硫胺素）：促愈傷組織產(chǎn)生，與愈傷

組織活力有關(guān)。

B5（煙酸或維生素PP）：促代謝，促胚的

發(fā)育，高濃度會抑制生長。

B6（吡哆醇）：促根生長。

肌醇（環(huán)己六醇）：無促進(jìn)生長的作用，

但有助活性物質(zhì)發(fā)揮作用。

3.氨基酸

來源：常用甘氨酸及多種氨基的混合水解酪蛋白，水解乳蛋白等。

作用：是蛋白質(zhì)的組分；

促進(jìn)器官增殖；

可作有機(jī)氮源。

4.植物激素

低濃度：促細(xì)胞分裂、生根、開花、結(jié)果。

高濃度：有抑制作用

一般兩大類：生長素、細(xì)胞分裂素。

激素影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育

激素影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等的生理生化活動植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用

（1）生長素：促細(xì)胞伸長、分裂、增大，主要有

吲哚乙酸、奈乙酸、2，4—D等。

吲哚乙酸（IAA）：

特性：天然生長素

作用：促離體組織生長、促愈傷組織形成。

萘乙酸（NAA）：

特性：人工合成的化學(xué)物質(zhì)。

作用：利發(fā)根，但根較細(xì)弱，IAA+IBA處

理使根生長健壯。

2，4—D（二氯苯氧乙酸）：

作用：

促愈傷組織形成，誘導(dǎo)作用比IAA高10倍。

抑器官、綠芽、根形成，特別是高濃度時抑制作用更強(qiáng)。

NAAA：NAA0mg/L，芽（少），根（無）B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組織（少量）

C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量）ABC（2）細(xì)胞分裂素：促細(xì)胞分裂分化，能顯著改變其

他激素作用。

6—糠基氨基嘌呤（激動素、KT）：

特性：化學(xué)合成物質(zhì)。

作用：廣泛誘導(dǎo)芽的形成，誘導(dǎo)愈傷組織時，適量加KT能改善器官發(fā)生狀況。

6—芐基氨基嘌呤（6—BA）：

特性：人工合成

作用：廣泛誘導(dǎo)芽的形成，BA效力比KT大。

玉米素（ZT）：特性：天然產(chǎn)物

作用：對某些植物有特效。

腺嘌呤（AD）：

作用：誘導(dǎo)植物細(xì)胞分裂，對芽形成有促進(jìn)作用。

BAA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）AB（3）

植物激素的應(yīng)用規(guī)律先生長素處理，后細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂，但細(xì)胞不分化，容易產(chǎn)生多倍體細(xì)胞（核分裂和胞壁分裂不同步所致），細(xì)胞分裂素有利于胞壁形成。先細(xì)胞分裂素處理，后生長素處理、細(xì)胞分裂也分化（可能是內(nèi)源生長素起了作用）。生長素/細(xì)胞分裂素：比值高時，有利于根分化，抑制芽形成。比值低時，有利芽分化，抑制根形成。比值適中時，促進(jìn)愈傷組織生長。

小結(jié)——激素配比模式

高有利于根的形成和愈傷組織的形成適中有利于根芽的分化

低有利于芽的形成

生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。

生長素/細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg／L。4、天然提取物：

包括麥芽提取液（ME）、椰子的液體胚乳（CM）、酵母提取液（YE）、水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）、乳熟期玉米漿、荸薺汁、鮮果汁、番茄汁、……

5、瓊脂：

來源：從紅藻等海藻中提取的高分子化合物。

特性：90℃熔解，40℃以下凝固，過酸、過堿或加高溫會發(fā)生水解失凝固力，存放過久變褐失凝固力。

用量：瓊脂0.6—1.0%，卡拉膠0.4—0.8%.

作用：凝固劑，固體培養(yǎng)時使液體培養(yǎng)基凝固。

6、其它

活性炭抗生素抗氧化劑誘變劑

活性碳：

用量1—10%

作用：吸附非極性物質(zhì)色素；

利器官形成，形態(tài)發(fā)生，利生根；

調(diào)節(jié)內(nèi)外源生長物質(zhì)水平。

注意：吸附無選擇性，溫低吸附力強(qiáng)；

削弱瓊脂凝固力；

凝固前輕輕搖防沉淀。

抗生素：

常用：滅菌靈、慶大霉素、青霉素

一般用量：5—20mg/L

作用：防污染防酚類物質(zhì)污染的添加劑：

抗酚類氧化劑：半胱氨酸及其鹽類

二硫蘇糖醇、谷胱甘肽

硫乙醇

抗壞血酸

生長抑制劑

染色劑二、培養(yǎng)基的種類及成分

按培養(yǎng)基狀態(tài)來分有固體、液體；按培養(yǎng)基配方分有：MS、N6、WhiteNitsch按主要試驗(yàn)?zāi)康膩矸钟姓T導(dǎo)、分化、繼代、生根；按培養(yǎng)基處理不同有條件培養(yǎng)基、看護(hù)培養(yǎng)基等。根據(jù)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量可分為4類

1、按培養(yǎng)基狀態(tài)分：固體、液體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：加入瓊脂或卡拉膠，使培養(yǎng)基成凝固狀態(tài)，

作用；它可以支持培養(yǎng)物.

優(yōu)點(diǎn)：通氣性好，便于觀察，操作簡便。

缺點(diǎn)是：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基接觸?。?/p>

培養(yǎng)物排出代謝廢物，聚集在吸收表面上；

培養(yǎng)物生長速度低于液體培養(yǎng)。

液體培養(yǎng)基：不加瓊脂或固化劑

2、按培養(yǎng)基配方來分：培養(yǎng)基種類很多，常用的配方有MS、N6、WhiteNitsch。MS、Nitsch：培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度高。

高濃度無機(jī)鹽利于保證組織生長所需礦質(zhì)營養(yǎng)，愈傷組織生長快，在貯存配制消毒過程中不因某成分略有出入影響培養(yǎng)基離子平衡。

White：無機(jī)鹽濃度較低，適合生根培養(yǎng)。

N6：適于禾谷類作物。3、按試驗(yàn)?zāi)康姆郑赫T導(dǎo)培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基實(shí)例：非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

是將外植體誘導(dǎo)發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基加不同激素，不同的外植體需要的激素不同：僅需加入一種生長素（IAA、NAA、2，

4—D等），如菊芋；同時加入一種生長素和細(xì)胞分裂素（

KT、6BA），如煙草、胡蘿卜；

僅需加入一種細(xì)胞分裂素，如大豆；無需加激素，如煙草腫癌細(xì)胞。一般十字花科、茄科、禾本科植物加2,4-D；雙子葉植物少加或不加2，4—D。繼代培養(yǎng)基：讓培養(yǎng)出的組織繼續(xù)不斷地生長下去的培養(yǎng)基。因?yàn)榧?xì)胞或組織培養(yǎng)一段時間后，養(yǎng)分減少，水分蒸發(fā)，培養(yǎng)基變干，培養(yǎng)物生長慢，甚至變褐停止生長——死亡，所以要換新的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的基本配方相同，只是激素的濃度應(yīng)逐漸降低，一般升一代，激素濃度降1PPM（1mg/Kg）。分化培養(yǎng)基：用于從愈傷組織誘導(dǎo)形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)時，加入激素的情況一般有四種：除去分化時的生長素，用不加任何激素的基本培養(yǎng)基，如水稻、珍珠粟、甘薯等分化；加較高濃度細(xì)胞分裂素和少量生長素，適于矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等分化；需加一種或一種以上生長素，如苜蓿、百合、唐昌蒲、秋蘭、風(fēng)信子等的分化；只需加細(xì)胞分裂素，如金魚草、留蘭香、草莓、甜葉菊、小麥等。生根培養(yǎng)基：降低無機(jī)鹽濃度，如1/2或1/4MS，或用Whith培養(yǎng)基。難生根的作物加IBA、IAA溶液浸泡或加少量IBA、IAA到培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4.根據(jù)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量可分為4類高鹽成分培養(yǎng)基（

MS培養(yǎng)基；LS培養(yǎng)基；BL培養(yǎng)基；BH培養(yǎng)基；ER培養(yǎng)基）硝酸鹽含量較高的培養(yǎng)基（

B5培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基；LH培養(yǎng)基）中等無機(jī)鹽類培養(yǎng)基（

H培養(yǎng)基；尼齊培養(yǎng)基；Miller培養(yǎng)）低無機(jī)鹽培養(yǎng)基（改良

White培養(yǎng)基；Knop培養(yǎng)基；HB培養(yǎng)基）特有培養(yǎng)基（

NT培養(yǎng)基；RB-8培養(yǎng)基；氨基酸培養(yǎng)基；RM培養(yǎng)基WPM培養(yǎng)基；C17培養(yǎng)基；SH培養(yǎng)基）三、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基的配制1培養(yǎng)基母液的配制將培養(yǎng)基配方中的各種藥物，或單獨(dú)或混合配成濃度較高的溶液，一般配10—100倍母液放冰箱存放備。好處：減少稱藥麻煩；減少微量元素用藥稱量誤差。注意：

濃度高耐貯存，但準(zhǔn)確度低，濃度過低不耐貯，易長綠藻；避免不恰當(dāng)混合引起沉淀。

大量元素母液配制（10χ1000ML）微量元素母液配制（1000χ1000ML）鐵鹽母液配制（200χ1000ML）有機(jī)母液配制（100χ100ML）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配制（1000χ50-100ML）實(shí)際吸取母液的用量：制培養(yǎng)基時要吸取母液體積=配制培養(yǎng)基體積（ml）/母液濃縮倍數(shù)例如：配制200ml培養(yǎng)基吸母液體積？1、大量元素混合母液：分別稱取大量元素各種藥物——分別溶解——混合定容?；旌享樞蜃⒁釩a2+與（SO4）2+、（HPO4）2+錯開，其它幾種先混，最后加CaCl2.2H2O，再定容。2、微量元素混合母液：指Fe以外的其他B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl……元素，分別稱取各藥物后，分別溶解，按順序混合定容。3、鐵鹽母液：由于易與其它無機(jī)物反應(yīng)發(fā)生沉淀，所以要單獨(dú)配制母液。稱取FeSO4.7H2O和EDTA，分別加蒸餾水加熱溶解后相混，冷卻后定容，螯合30分鐘,顏色變?yōu)榈S色,再加熱穩(wěn)定,貯存一段時間,顏色會加深,放冰箱保存。4、有機(jī)化合物的配制：維生素——溶解——混合定容；氨基酸——溶解——混合定容；或?qū)⒕S生素、氨基酸溶解后混合定容。5、植物激素：每種激素單獨(dú)配成不同濃度的母液，母液的濃度視其在培養(yǎng)基內(nèi)的用量大小而定。如：1mg/ml或0.1mg/ml2mg/ml或0.2,0.5mg/ml等激素難溶于水，配制母液時用95%酒精或1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。實(shí)際吸取母液的用量例：若某培養(yǎng)基NAA的用量為0.5mg/L，母液濃度為0.1mg/mL，配200ml培養(yǎng)基吸母液多少ml？母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標(biāo)簽保存于冰箱要求

稱量藥品

天平預(yù)置全顯示清零稱藥母液保存：在冰箱內(nèi)

低溫保存母液分裝、貼標(biāo)簽?zāi)敢号渲埔螅?.母液濃縮倍數(shù)：10-100（大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機(jī)物50）2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學(xué)純試劑3.防止沉淀：各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合

4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100ml5.激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；

2，4-D先溶于1mlNaOH再加水；

KT、BA先溶于1mlHCl再加水。

稱取蔗糖、瓊脂放入帶刻度的量杯中加水至終體積的3/4刻度處加熱、煮沸，攪拌均勻充分混勻，并加水至終體積計算個母液的用量，移取母液并混合清洗培養(yǎng)器皿待溫度下降到50度左右，調(diào)PH將培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶或試管中，封口培養(yǎng)基高壓滅菌保存2、培養(yǎng)基配制步驟稱取蔗糖、瓊脂放入帶刻度的量杯中加H2O至終體積的3/4刻度處加熱、煮沸、攪拌均勻，瓊脂完全溶化充分混勻，并加H2O定容至終體積待溫度下降致50℃左右調(diào)pH值將培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)瓶或試管中，封口清洗需用的培養(yǎng)器皿計算各母液的取用量，移取母液并混合培養(yǎng)基高壓滅菌4℃下保存，2周內(nèi)使用；或在室溫下，1～2天后使用調(diào)節(jié)PH

1mol/l的鹽酸的配制：量取8.4ml濃鹽酸（12mol/l），加水定容至100ml，即配成1mol/l的鹽酸溶液。1mol/l的NaOH配制：稱取4克的NaOH，溶解后定容至100毫升去離子水中，即配成1mol/l的NaOH。稱取蔗糖、瓊脂取蔗糖25－30g，瓊脂7－8g。培養(yǎng)基熬制：1.將定容好的培養(yǎng)液倒入鋁鍋中，同時加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。用蒸餾水定容至1升定容：用0.1MNaOH或HCl調(diào)pH值為5.8。趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml,35瓶/L。調(diào)pH值：ｐH影響培養(yǎng)基的硬度ｐH＞6.5培養(yǎng)基會變硬ｐH＜5.0培養(yǎng)基不易凝固提示:pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度

分裝：趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml,35瓶/L。扎口與滅菌:要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應(yīng)及時滅菌，防止變質(zhì)。四、植物材料無菌培養(yǎng)的一般程序1外植體的選擇2培養(yǎng)材料的滅菌和接種3材料的培養(yǎng)4培養(yǎng)物的觀察5影響外植體生長的外界條件1.外植體的選擇植物的種類（優(yōu)良品種、有應(yīng)用前景）外植體的生理年齡與著生部位（幼嫩、生長旺盛、接近生長點(diǎn)）選取外植體的季節(jié)和時間外植體的大小2.培養(yǎng)材料的滅菌和接種（1）外植體的滅菌

75%的酒精

0.1—0.2%氯化汞

10—20%的次氯酸鈉在消毒溶液里加上少量（0.1%）的表面活化劑，如Triton-X或Tween-80會提高殺菌效果。酒精常與其它消毒劑配合使用。常用的培養(yǎng)部位

植物不同器官的消毒順序（2）外植體的接種程序接種室滅菌超凈臺滅菌接種前準(zhǔn)備接種（外植體滅菌切割放置培養(yǎng)瓶扎口貼標(biāo)簽整理臺面）錄象3.材料的培養(yǎng)初代培養(yǎng)（Primaryculture）繼代培養(yǎng)（subculture）分化培養(yǎng)壯苗培養(yǎng)生根培養(yǎng)移栽初代培養(yǎng)primaryCulture：指植物組織培養(yǎng)過程中，最初建立的外植體無菌培養(yǎng)階段?！T導(dǎo)愈傷組織組織的形成。繼代培養(yǎng)Subculture：指組織培養(yǎng)過程中，