產(chǎn)蛋白酶菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

隴東大學學士學位畢業(yè)論文（設(shè)計）蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化生命科學與技術(shù)學院08生物技術(shù)班作者：指導教師：蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化何泰杜旭謝麗娟，劉麗萍(隴東學院生命科學與技術(shù)學院，甘肅慶陽745000)摘要：采用隴東學院污水處理廠附近土壤、農(nóng)田土壤及養(yǎng)殖場附近土壤作為樣品，利用牛奶水解圈篩選模型從中分離篩選得到產(chǎn)蛋白酶能力較高的菌株whrl，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌。并對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，結(jié)果顯示該菌最適培養(yǎng)時間為24h，最佳碳源為質(zhì)量濃度1%蔗糖，最佳氮源為質(zhì)量濃度1.5%酵母膏，最適初始pH值為6.0，最適發(fā)酵溫度為35°C。關(guān)鍵詞：菌種篩選，鑒定，蛋白酶，條件優(yōu)化Proteaseproducedthescreeningofthebacteriaandtheoptimizationofthe

enzymeproductionconditions(Collegeoflifescienceandtechnology,LongdongUniversity,Qingyang74500,Gansu,China)Abstract:Thesewagetreatmentplantsoilneareastinstitute,soilandsoilsamplesnearfarms.Usingmilkhydrolysiscirclescreeningmodelseparatingscreeninginhighabilitygetproteasewhr1strains.Preliminaryappraisalofthefungusbelongtobacillus.Aftertheoptimizationofthecondition,thecapabilityofwhr1wasimproved,theoptimalconditionis:Thetimeis24h;carbonsourceissucrose1%;nitrogensourceisYeastextract1.5%,thepHis6.0;fermentationtemperatureis30C.Keyword:Screening，Identified，Protease,Conditionsoptimization0引言蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱，是一類廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面的重要工業(yè)用酶［1］，也是目前世界上產(chǎn)銷量最大的商業(yè)酶，其市場占有率約占整個商品酶銷售量的60%，微生物蛋白酶從微生物中提取，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有動物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比擬的優(yōu)越性［2,3］。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品種的發(fā)掘，并通過分離篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和誘變育種或構(gòu)建基因工程菌等綜合手段獲得高產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良菌株［4,10］。我國的蛋白酶研究還存在如微生物資源開發(fā)不足，蛋白酶種類較少，酶制劑品種單一等問題。本論文從以下幾方面對蛋白酶產(chǎn)生菌株進行較為系統(tǒng)的研究：從土壤中篩選出產(chǎn)蛋白酶能力較高菌株。對篩選出的菌株進行形態(tài)學的鑒定，將菌株初步確定到屬。研究產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件，對培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，進一步提高菌株的產(chǎn)酶活力。1實驗材料及方法1.1實驗材料與儀器1.1.1實驗儀器電熱壓力蒸汽滅菌鍋全溫振蕩培養(yǎng)箱生化培養(yǎng)箱超凈工作臺電子分析天平離心機pH測量儀分光光度計水浴鍋微波爐1.1.2實驗材料樣品：分別采自隴東學院污水處理廠附近，農(nóng)田土壤及養(yǎng)殖場附近的土壤。主要試劑：脫脂奶粉，氯化鈉（NaCl），蔗糖，碳酸鈉，酪氨酸，尿素，瓊脂粉，牛肉膏，蛋白胨，三氯乙酸，結(jié)晶紫，干酪素，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉培養(yǎng)基種子斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂粉20.0g，水1000ml，121°C滅菌20min，備用。篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂粉20.0g，脫脂奶粉25.0g，水1000ml，106C滅菌6min，備用。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000ml，121C滅菌20min，備用。試劑配制0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉42.4g，定容至1000ml。0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：稱取三氯乙酸65.4g，定容至1000ml。pH7.2磷酸緩沖液：稱取磷酸二氫鈉31.2g，定容至1000ml，即成0.2mol溶液（A液）。稱取磷酸氫二鈉71.63g，定容至1000ml，即成1.2mol溶液（B液）。取A液28mL和B液72ml，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1mol/LpH7.2的磷酸緩沖液。2%酪蛋白溶液：準確稱取干酪素2g，稱準至0.002g，加入0.1N氫氧化鈉10mL，在水浴中加熱使溶解（必要時用小火加熱煮沸），然后用pH7.2磷酸緩沖液定容至100ml即成。配置后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存，否則極易繁殖細菌，引起變質(zhì)。100gg/mL酪氨酸溶液：精確稱取在105C烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入6ml1mol/L鹽酸使溶解，用0.2mol/L鹽酸定容至100ml，其濃度為1000gg/mL，在吸取此液10ml，以0.2mol/L鹽酸定容至100ml，其濃度為100gg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后液應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細菌而變質(zhì)。1.2實驗方法1.2.1菌株篩選富集：將從隴東學院污水處理廠附近，實驗樓前植物園土壤及養(yǎng)殖場附近的土壤采集的土壤，分別稱取5g土樣，放入裝有45ml無菌水的三角瓶中，37C震蕩培養(yǎng)24h。初篩：將富集培養(yǎng)的菌液取1ml,用無菌水依次稀釋到10-7，分別取10-5、10-6、10-7三個梯度各0.1ml土壤稀釋液制成混菌平板，將培養(yǎng)皿放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h[8,9]。取出培養(yǎng)好的平皿，選擇生長良好、管號試劑形態(tài)明顯的單菌落，用無菌牙簽挑種到牛奶篩選培養(yǎng)基上，每個平皿中接4-5個，37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。挑選出能在牛奶篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈的單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基上，放入冰箱冷藏。管號復篩:從冰箱中取出初篩得到的菌株，轉(zhuǎn)接試管斜面活化，37C下恒溫培養(yǎng)24h。各取1環(huán)，接種到裝液量為20ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在37C條件下?lián)u床培養(yǎng)24h。分別取各菌株發(fā)酵液10U滴加在牛奶篩選平板中的濾紙片上（直徑為12mm），然后將培養(yǎng)皿放入37C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出后測量水解圈直徑與菌落直徑。重復此過程3次，取平均值，選取水解圈直徑與菌落直徑差值最大的菌株作為出發(fā)菌株whr1。1.2.2蛋白酶產(chǎn)生菌酶活力的測定酶活測定原理：酶活力是指酶催化某些化學反應(yīng)的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應(yīng)的初速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應(yīng)的速度，即可以用單位時間內(nèi)反應(yīng)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。蛋白酶可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑發(fā)生福林酚反應(yīng)。（福林酚反應(yīng)：福林試劑在堿性條件下極其不穩(wěn)定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現(xiàn)出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用蛋白酶在單位時間內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸的量來表示酶活力[11<]酶液的制備：從斜面培養(yǎng)基中取1環(huán)菌種于30ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37C、140rpm搖床上培養(yǎng)12h，再分別取1ml經(jīng)12h培養(yǎng)的菌液于不同條件的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后培養(yǎng)液于5000rpm離心10min取其上清液為酶液。酪氨酸標準曲線的制作：取6支25ml的比色管，編號，按下表操作測定步驟：123456取6支試管編蒸餾水，ml1086420號按表1分別100pg/ml酪氨酸，ml0246810吸取不同濃度酪氨酸1ml，各酪氨酸最終濃度，gg/ml020406080100加入0.4mol/L碳酸鈉5ml，在各加入的福林試劑1ml。搖勻置于水浴鍋中，40°C保溫發(fā)色20min，用722型分光光度計進行測定（波長660nm）。測三次，取平均值。將1-6號管所測得的光密度（OD）減去一號管所測得的光密度為凈OD值。測定酶活方法：取25ml比色管3支，每管內(nèi)加入酶液1ml,置于40C水浴中預熱2min，再各加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1ml，精確保溫10min，時間到后，立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2ml，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾，然后另取25mL試管3支，編號1、2、3,每管內(nèi)加入濾液1ml，再加0.4mol碳酸鈉5ml，已稀釋的福林試劑1ml，搖勻，40C保溫發(fā)色20min后進行光密度（OD）測定?？瞻自囼炌瑯尤≡嚬?支，編號（1）、（2）、（3），測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2ml，使酶失活，再加入酪蛋白。1.2.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化產(chǎn)酶曲線測定：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別在37C下培養(yǎng)0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，測其酶活。不同碳源對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變，選用4種濃度為1%的不同的碳源，分別為麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37C140rpm培養(yǎng)最優(yōu)時間，測其酶活。不同氮源對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳源，氮源改用5種濃度為1.5%的不同的氮源，其他成分不變，分別是尿素、（NH4）2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37C以最優(yōu)時間培養(yǎng)，測其酶活。不同培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳源、氮源，其他成分不變，選用5種不同的pH，分別是pH5、pH6、pH7、pH8、pH9,37C以最優(yōu)時間培養(yǎng)，測其酶活。不同溫度對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳源、氮源，其他成分不變，采用最優(yōu)pH值，分別在31C、33C、35C、37C、39C下以最優(yōu)時間培養(yǎng)，測其酶活［6,9］。2實驗結(jié)果2.1菌株篩選2.1.1菌株的分離篩選將土樣利用牛奶篩選培養(yǎng)基分離得到具有蛋白酶活性的菌株，選出其中水解圈較大的whr1號菌

株進行后續(xù)實驗，并斜面保藏。圖2-1菌種篩選圖2-2菌種篩選圖2-3菌種篩選2.1.2菌株的形態(tài)特征對whrl號菌株分離純化，在37^培養(yǎng)24h后，觀察單菌落，菌落呈透明乳黃色，濕潤，菌落表面光滑，邊緣形狀不規(guī)則［7。革蘭氏染色后，顯微鏡觀察菌體呈藍紫色，是陽性，菌體成直桿狀。圖2-4whrl革蘭氏染色2.2蛋白酶酶活測定整理數(shù)據(jù)作圖得到酪氨酸的標準曲線，如圖2-5所示:

標準酪氮酸溶液量(ml)圖2-5酪氨酸的標準曲線酶活定義：在40°C下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1gg酪氨酸，定義為1個酶活單位(U/ml)。酶活計算公式：酶活力(U/ml)=4*A*N/10式中：A---由樣品測得OD值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)；4---4毫升反應(yīng)液取出1ml測定；10---反應(yīng)10分鐘；N---稀釋酶液的倍數(shù)。2.3條件優(yōu)化2.3.1不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響產(chǎn)酶曲線測定：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別在37C下培養(yǎng)0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，測其酶活。實驗結(jié)果如圖2-6所示432:101111010203010432:1時間(h)圖2-6時間對酶活性的影響由表中可知，在培養(yǎng)24h和30h時差異不顯著，18h和24h差異極顯著，原因可能是0-24h時，隨著時間的延長，酶活逐漸增加，培養(yǎng)到24h時菌株產(chǎn)酶活性最高，可能菌群生長已達到對數(shù)期。24-30h隨著時間的延長，酶活逐漸降低，可能菌群生長到達穩(wěn)定期。36h時酶活最低，菌群生長已

到達衰亡期。按理24h和30h都可以作為最佳培養(yǎng)時間，但考慮到省時省料，所以選擇24h為細菌最佳培養(yǎng)時間。2.3.2不同碳源對產(chǎn)酶的影響不同碳源對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變，選用4種濃度為1%的不同的碳源，分別為麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37C培養(yǎng)最優(yōu)時間，測其酶活。實驗結(jié)果如圖2-7所示:8-612

(隹、8胡tett麥芽■糖乳糖碳源蔗糖612

(隹、8胡tett麥芽■糖乳糖碳源蔗糖圖2-7碳源對酶活性的影響常用的碳源是一些單糖、低聚糖和多聚糖等碳水化合物。從表中可以看出，蔗糖最有利于產(chǎn)酶，酶活最大，與各個碳源之間差異極顯著；麥芽糖次之，乳糖最小，盡管葡萄糖是速效碳源，但是也有關(guān)于葡萄糖會抑制蛋白酶產(chǎn)生的報道，故選擇蔗糖為whrl菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。2.3.3不同氮源對產(chǎn)酶的影響302520151030不同氮源對產(chǎn)酶的影響：在50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳源，氮源改用5種濃度為1.5%的不同的氮源，其他成分不變，分別是尿素、（NH4）2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37°302520151030■尿素硫酸鉉牛肉膏蚩白腺酵母膏氮源圖2-8氮源對酶活性的影響由表可知，在有機氮源中，以酵母膏、牛肉膏為氮源時發(fā)酵液酶活均較高，酵母膏最高，與其他氮源差異極顯著；與有機氮源相比，無機氮源不利于菌體產(chǎn)酶，有機氮源的產(chǎn)酶效果要比無機氮源要好。有機氮源成份復雜，可能是含有的物質(zhì)對產(chǎn)酶有一定的促進和誘導作用。由此結(jié)果，選擇酵母膏為whr1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。2.3.4培養(yǎng)基不同初始pH值對產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基不同初始pH值對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳源、氮源，其他成分不變，選用5種不同的pH，分別是pH5、pH6、pH7、pH8、pH9,37°C以最優(yōu)時間培養(yǎng)，測其酶活，實驗結(jié)果如圖2-9所示。100IIIIII4567S910pH圖2-9pH值對酶活性的影響對大多數(shù)菌種來說，菌種有保持其體內(nèi)細胞酸質(zhì)度在近中性條件的能力，這樣有利于菌體進行正常的新陳代謝和各種酶反應(yīng)。但介質(zhì)的pH值對細胞的新陳代謝和產(chǎn)酶有間接的影響。我們只做了培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響，分別調(diào)整發(fā)酵液起始pH為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,其它條件固定，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定蛋白酶活力。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始|3日值為6.0時，酶活力最高，與各個pH值差異極顯著。pH偏高或偏低，都不利于菌體產(chǎn)酶。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值為6.0。2.3.5不同溫度對產(chǎn)酶的影響不同溫度對產(chǎn)酶的影響：在50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最優(yōu)碳、氮源，其他成分不變，采用最優(yōu)pH值，分別在31C、33C、35C、37C、39C下140rpm以最優(yōu)時間培養(yǎng)，測其酶活。實驗結(jié)果如圖2-10所示圖2-10溫度對酶活性的影響由于大多數(shù)細菌為中溫菌，因此本試驗選擇了分別設(shè)定發(fā)酵溫度為31,33,35,37,39，其它條件固定，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定蛋白酶活力。35r產(chǎn)酶量最高，與其他溫度差異極顯著。為其最適培養(yǎng)溫度。溫度的變化不但會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，也會影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。溫度升高，反應(yīng)速率加大，生長代謝快，生產(chǎn)期提前，但是菌體容易衰老，發(fā)酵周期縮短，從而影響酶的最終產(chǎn)量。此外，溫度高。最初細菌大量繁殖，其進行分解代謝釋放的熱量.使整個發(fā)酵體系的溫度變得更高，加速了細菌的死亡。因此，要得到高產(chǎn)量的產(chǎn)物，必須選擇適宜的發(fā)酵溫度。若溫度過低，細菌增殖周期加長，細菌總量較低，直接影響酶產(chǎn)量。3.結(jié)論通過牛奶篩選培養(yǎng)基采用透明圈法從采集的土樣中篩選得到蛋白酶產(chǎn)生菌whrl，對其純化分離，培養(yǎng)一天后，進行形態(tài)學鑒定。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落生長為邊緣整齊，菌落成乳白色，菌落表面不透明，不產(chǎn)生色素。初步鑒定為芽孢桿菌。whrl號菌株的種子液擴大培養(yǎng)，發(fā)酵液在37^140rpm條件下，培養(yǎng)到24h酶活達到最大值。實驗得出培養(yǎng)基最佳條件為：培養(yǎng)基中最佳碳源添加量為質(zhì)量濃度1%的蔗糖，最佳氮源添加量為質(zhì)量濃度1.5%的酵母膏，最適初始pH值為6.0，最適發(fā)酵溫度為35