生化課件第二十一章 DNA重組及重組DNA技術

DNA重組和重組DNA技術DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章劉向華南京醫(yī)科大學生化與分子生物學系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiologyDNA重組和重組DNA技術第二十一章劉向華起初上帝創(chuàng)造天地，地是空虛混沌，淵面黑暗，上帝的靈運行在水面上，上帝說：“要有光，就有了光。”

------《舊約全書·創(chuàng)世紀》

螢火蟲的發(fā)光基因?qū)煵菡f：“要有光”，煙草就發(fā)光了。起初上帝創(chuàng)造天地，螢火蟲的發(fā)光基因?qū)煵菡f：“要有光”第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinati本節(jié)主要內(nèi)容

重組DNA技術相關概念重組DNA技術基本原理及操作步驟

PCR、核酸雜交DNA克隆工具酶目的基因基因載體本節(jié)主要內(nèi)容重組DNA技術相關概念DNA克隆重組DNA技術應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)DNA與載體DNA接合成一具有自我復制能力的重組DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子克隆或重組DNA技術

。

重組DNA技術基因克隆的主要操作步驟基因克隆的主要操作步驟粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分離)切(切割)粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分離)切(切割酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸大量生長提取大量質(zhì)粒酶切鑒定大量生長提取大量質(zhì)粒酶切鑒定基因克隆的基本步驟分：分離目的基因和載體DNA。切：用合適的限制性內(nèi)切酶切割上述兩者，產(chǎn)生

匹配的末端。接：連接酶將目的基因裝入載體。轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)入宿主細胞。篩：篩選具有重組DNA分子的陽性克隆?；蚩寺〉幕静襟E分：分離目的基因和載體DNA。

限制性核酸內(nèi)切酶

連接酶

聚合酶(Taq酶、末端轉(zhuǎn)移酶)

多聚核苷酸激酶

堿性磷酸酶合成雙鏈cDNA分子5ˊ羥基末端磷酸化

切除末端磷酸基一、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶合成雙鏈cDNA分子5ˊ羥基末端磷酸化切1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease,RE）

能識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。主要來源于原核生物由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA1.限制性核酸內(nèi)切酶能識別DNA的特異序列第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶分類

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名HindⅢⅡ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(palindrome)

GGATCCCCTAGG舟行水面水行舟Asegmentofdouble-strandedDNAinwhichthenucleotidesequenceofonestrandreadsinreverseordertothatofthecomplementarystrand.Inthesamestrandcontainingcomplementarynucleotidesequencewithoppositepolarity.Ⅱ類酶識別序列特點——回文結(jié)構(palindrome)在對稱軸中心同時切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'

II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口切割：以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’端為羥基。在對稱軸中心同時切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（blunt

在對稱軸兩側(cè)相對位點分別切割一條鏈。從5'端切割產(chǎn)生5'端突出的粘性末端，如EcoRⅠ：

從3'端切割產(chǎn)生3'端突出的粘性末端。如PstⅠ：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…G5'

AATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAA5'

G…5'5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCA3'G…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…G3'ACGTC…

5'

在對稱軸兩側(cè)相對位點分別切割一條鏈。從5'端切割產(chǎn)生5限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放

1．在下述雙鏈DNA序列(僅列出其中一鏈序列)中不屬于完全回文結(jié)構的是

A．AGAATTCTB.TGAATTCAC．GGAATTCCD．CGTTAAGCE．AGATATCT1．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…AGCTG▼AATTC…3’產(chǎn)生

2．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…CTGCA▼GAGTC…3’產(chǎn)生

3．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…AGGTT▼AACAG…3’產(chǎn)生5'端突出的粘性末端3'端突出的粘性末端平末端1．在下述雙鏈DNA序列(僅列出其中一鏈序列)中不屬于完全常用的載體按來源分為：質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體(phage)和病毒(virus)按得到的產(chǎn)物，載體可分為：克隆載體（cloningvector）主要用于基因片斷的擴增表達載體（expressionvector）用于獲得目的基因編碼的蛋白質(zhì)（二）載體的分類常用的載體按來源分為：按得到的產(chǎn)物，載體可分為：（二）載體的載體的選擇標準復制起始點，能自主復制；具有一個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標準復制起始點，能自主復制；質(zhì)粒（plasmid）

質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細胞獨立自主地進行復制，并在細胞分裂時保持恒定地傳給子代細胞。質(zhì)粒帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞新的遺傳性狀。因為質(zhì)粒DNA有自我復制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組DNA操作的載體。質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細菌染色體目錄氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點ori目錄氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點oriλ噬菌體

λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λ-DNA組成。λ噬菌體（lambdabacteriophage）DNA，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個堿基的互補粘性末端，稱COS位點。當噬菌體侵入宿主細胞，兩個粘性末端互補結(jié)合，形成環(huán)狀分子。λDNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。

SalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠλ噬菌體λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λlacZ’基因:編碼-半乳糖苷酶的-片段

M13噬菌體載體—pUC18和pUC19載體多克隆位點rlacZ’基因:編碼-半乳M13噬菌體載體—pUC18酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他三、重組DNA技術基本原理及操作步驟基本原理目的基因的獲取重組DNA導入受體菌

外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

三、重組DNA技術基本原理及操作步驟基本原理目的基因的獲取重

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目錄以目錄（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（見第20章）

（一）目的基因的獲取1.化學合成法*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列合成的基因有：人生長激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽、干擾素基因等。*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫P441(genomicDNAlibrary)組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因

逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫的特點◆代表了取材當時所表達基因的總和，不包括那些未表達的基因?！鬽RNA分子中不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列，所以cDNA文庫的復雜性要比基因組文庫低的多。

cDNA文庫的特點體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)(Mg2+)和DNA變性、復性(退火)及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴增.聚合酶鏈式反應P407

（PolymeraseChainReaction,PCR）

體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術。聚合酶5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技術的工作原理目錄DNA變性復性延伸5Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555

555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄Cycle35555555555DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cyclen理論上可達2n個拷貝原料（pg）

產(chǎn)物(μg)體外高效、快速、特異

地擴增DNA片段g→mg→ug→ng→pgDNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cycl（三）外源基因與載體的連接

粘性末端連接平端連接（二）克隆載體的選擇和構建（三）外源基因與載體的連接粘性末端連接（二）克隆載體粘性末端連接

外源DNA片段與載體用同一種限制性內(nèi)切酶切割，獲得相同的粘性末端，相互互補配對，在DNA連接酶作用下，形成重組DNA分子。DNA連接酶“縫合”基因的“分子針線”。粘性末端連接外源DNA片段與載體用同一種限制性內(nèi)DNA連接酶的作用過程點擊播放DNA連接酶的作用過程點擊播放BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接BamHⅠ切割反應GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平末端的補齊目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶

T4DNA連接酶

15oC重組體載體自連目的基因自連2.平端連接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。如將poly（dA）加到雙鏈DNA片段3’羥基上，而將poly（dT）加到質(zhì)粒載體3’羥基上，制造出粘性末端，然后通過退火進行粘性末端連接。3.同聚物加尾連接受體菌條件

安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式

轉(zhuǎn)化(transformation)

將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)染(transfection)

將外源DNA直接導入真核細胞.感染(infection)

以噬菌體和真核病毒作載體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為感染（四）重組DNA導入受體菌受體菌條件安全宿主菌CaCl2誘導轉(zhuǎn)化特殊處理受體細胞細胞膜特性改變感受態(tài)細胞的制備基因片段（特別是純化的DNA）很難直接導入受體細胞，通常將受體細胞預先加以處理，如在低溫條件下，用CaCl2（冰?。┨幚泶竽c桿菌，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。這種經(jīng)過預處理、容易導入外源核酸分子的受體細胞被稱作“感受態(tài)細胞”（competentcell）。CaCl2誘導轉(zhuǎn)化特殊處理受體細胞細胞膜特性改變感受態(tài)細胞的連接目的基因基因載體連接酶轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化后菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑：（五）重組體的篩選1.載體遺傳標記篩選抗藥性標記選擇標志補救(markerrescue)2.序列特異性篩選法（1）RE酶切法(2)PCR法（3）核酸分子雜交3.親和篩選法如免疫化學方法及酶免檢測分析等連接目的基因轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化后菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑：（五）重組體1）抗藥性標志的選擇(插入失活法)pBR322AmprTetr插入外源基因片段標志基因Tetr失活Amp平板Tet平板轉(zhuǎn)化區(qū)別非轉(zhuǎn)化菌與轉(zhuǎn)化菌？雙抗生素對照篩選重組子能在含有Ap的培養(yǎng)板上生長但不能在含有Tet的培養(yǎng)板上生長1）抗藥性標志的選擇(插入失活法)pBR322AmprTet2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段?-半乳糖苷酶活性lacZ’缺陷型的大腸桿菌Ampuc18（LacZ’基因N端序列）2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段?X-galX-galLacZ藍色化合物X-galX-galLacZ藍色化合物a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段（LacZ’基因失活）LacZ’基因C端序列LacZ酶w片段w片段X-galα互補：單獨存在的α及

ω片段都沒有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細胞與克隆載體同時表達兩個片段時，宿主細胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{色化合物。如果插入的外源基因是在lacZ’基因內(nèi)，就會影響lacZ’的表達，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長時會出現(xiàn)白色菌落；若無外源基因插入，則出現(xiàn)藍色菌落。白色菌落a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段LacZ’基因C目錄-互補：通過藍白斑篩選可以篩選、鑒定重組子與非重組子載體β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成藍色菌落。當外源基因插入后，LacZ’基因被破壞，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。目錄-互補：通過藍白斑篩選可以篩選、鑒定重組子與非重組子

指用探針檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補配對原則發(fā)生同源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復性（renaturation）預雜交（prehybridization）雜交（hybridization）

探針：帶有可檢測標記的已知序列的DNA或RNA片段。

3)核酸分子雜交（molecularhybridization）指用探針檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補菌落原位雜交菌落原位雜交雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄3.親和篩選法

雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄3.親和篩選法重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切割目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基①分______分離出目的基因及載體DNA。②切______利用限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體。③接______利用連接酶將目的基因與載體DNA共價連接形成重組DNA分子。④轉(zhuǎn)______重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞。⑤篩______篩選和鑒定含有重組DNA分子的受體細胞（陽性克隆）。重組DNA的基本過程①分______分離出目的基因及載體DNA。重組DNA的基本重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源大量生長克隆載體：拷貝大量目的基因表達載體：獲得大量目的蛋白克隆基因的表達表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化大量生長克隆載體：拷貝大量目的基因克隆基因的表達表達體系的建基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆第三節(jié)、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥（三）基因診斷（四）基因治療（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆第三節(jié)、重組技術與醫(yī)學的關系（二）

神話成現(xiàn)實

——綠葉變?yōu)轷r花神話成現(xiàn)實基因武器

20克超級基因可使60億人死于非命

一旦基因武器運用于戰(zhàn)爭，將使未來戰(zhàn)爭發(fā)生巨大變化。基因武器使用者再也不用興師動眾，而只需要在臨戰(zhàn)前將經(jīng)過基因工程培養(yǎng)的病菌投入他國，使敵方人畜在短時間患上一種無法治療的疾病，從而喪失戰(zhàn)斗能力。

基因武器可根據(jù)需要任意重組基因，可在一些生物中移入損傷人類智力的基因。當某一特定族群的人沾染上這種帶有損傷智力基因的病菌時，就會喪失正常智力。另一方面，基因作為戰(zhàn)術武器使用時，將使對方防不勝防，束手無策?；蛭淦鞯奶赜泄δ苤唬褪菑奈淦鞯氖褂玫桨l(fā)生作用都沒有明顯的征候，即使發(fā)現(xiàn)了也難以破解遺傳密碼和實施控制。基因武器一旦基因武器運用于戰(zhàn)爭，將使未來戰(zhàn)爭發(fā)基因工程生產(chǎn)人的胰島素的簡要過程：基因工程與醫(yī)學的關系普通大腸桿菌人的細胞提取人的胰島素基因與運載體DNA拼接導入大腸桿菌細胞(含人的胰島素基因)大腸桿菌(產(chǎn)生人的胰島素)上述過程的關鍵要解決是什么？？基因工程生產(chǎn)人的胰島素的簡要過程：基因工程與醫(yī)學的關系普通大基因工程生產(chǎn)人的胰島素：關鍵步驟一：胰島素基因從人的細胞內(nèi)提取出來關鍵步驟二：胰島素基因與運載體DNA連接關鍵步驟三：人的基因?qū)胧荏w(大腸桿菌)細胞限制性內(nèi)切酶DNA連接酶基因工程與醫(yī)學的關系基因工程生產(chǎn)人的胰島素：關鍵步胰島素基因從人的細胞內(nèi)提取出來大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 目錄大鼠胰島素原cDNA目錄生化課件第二十一章DNA重組及重組DNA技術“非典”可能是針對中國的基因武器

俄羅斯醫(yī)學科學院院士卡雷辛柯夫在非典疫情大規(guī)模爆發(fā)初期就斷言，非典型肺炎是一種生物武器，極可能是從實驗室里流出來的。他的依據(jù)是：非典是麻疹病毒與流行性腮腺炎病毒的混合體，而這種混合病毒只有在實驗室里才可能培育出來，在自然環(huán)境中根本不可能發(fā)生。

非典來自生化武器這一觀點提出來后，美國政府還曾兩次否定非典是美國的生化武器?！胺堑洹笨赡苁轻槍χ袊幕蛭淦鞫砹_斯醫(yī)基因治療是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎校_到治療疾病的目的。取患者骨髓分離干細胞病毒正常基因并入正?；虻母杉毎⑷牖颊唧w內(nèi)基因治療(GeneTherapy)基因治療是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎校_到治療疾基因診斷(GeneticDiagnosis):

利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術和方法，直接檢測基因結(jié)構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法.基因診斷(GeneticDiagnosis):DNAcloningPalindromeTargetgeneCloningvectorPlasmidRestrictionendonucleaseMolecularhybridizationPCRKeywordsGenomicDNAlibrarycDNAlibraryDenaturationAnnealingExtensionExpressionvectorSummaryDNAcloningKeywordsGenomicDN1.何謂基因重組技術，簡述其基本過程。2.何謂目的基因，有哪些來源？3.解釋基因載體，哪些DNA可作為基因載體？(質(zhì)粒)4.基本概念

DNA重組技術,限制性核酸內(nèi)切酶,回文結(jié)構,目的基因,基因組DNA文庫,cDNA文庫,PCR,核酸分子雜交第二十一章DNA重組及重組DNA技術1.何謂基因重組技術，簡述其基本過程。第二十一章DNA實驗結(jié)果實驗結(jié)果Summary1.RecombinantDNAtechnologybuildsonafewbasictechniques:isolationofDNA,cleavageofDNAatparticularsequences,ligationofDNAfragments,introductionofDNAintohostcells,replicationofDNA,andidentificationofhostcellsthatcontainrecombinants.Summary1.RecombinantDNAtechSummary2.AgenomiclibraryrepresentsalltheDNAofanorganism;AcDNAlibrarycontainsDNAthatiscomplementarytothemRNAfromaparticularcellortissue.3.FragmentsofDNAgeneratedbyrestrictionendonucleasesareincorporatedintovectors,whichcanbeplasmids,bacteriophages,viruses,orartificialchromosomes.Summary2.AgenomiclibraryreSummary4.Cellscontainingthedesiredrecombinantareidentifiedbyscreening.5.SpecificDNAsequencescanbeamplifiedbythepolymerasechainreaction(PCR).Summary5.SpecificDNAsequenc

DNA重組和重組DNA技術DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章劉向華南京醫(yī)科大學生化與分子生物學系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiologyDNA重組和重組DNA技術第二十一章劉向華起初上帝創(chuàng)造天地，地是空虛混沌，淵面黑暗，上帝的靈運行在水面上，上帝說：“要有光，就有了光。”

------《舊約全書·創(chuàng)世紀》

螢火蟲的發(fā)光基因?qū)煵菡f：“要有光”，煙草就發(fā)光了。起初上帝創(chuàng)造天地，螢火蟲的發(fā)光基因?qū)煵菡f：“要有光”第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinati本節(jié)主要內(nèi)容

重組DNA技術相關概念重組DNA技術基本原理及操作步驟

PCR、核酸雜交DNA克隆工具酶目的基因基因載體本節(jié)主要內(nèi)容重組DNA技術相關概念DNA克隆重組DNA技術應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)DNA與載體DNA接合成一具有自我復制能力的重組DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子克隆或重組DNA技術

。

重組DNA技術基因克隆的主要操作步驟基因克隆的主要操作步驟粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分離)切(切割)粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分離)切(切割酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸大量生長提取大量質(zhì)粒酶切鑒定大量生長提取大量質(zhì)粒酶切鑒定基因克隆的基本步驟分：分離目的基因和載體DNA。切：用合適的限制性內(nèi)切酶切割上述兩者，產(chǎn)生

匹配的末端。接：連接酶將目的基因裝入載體。轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)入宿主細胞。篩：篩選具有重組DNA分子的陽性克隆。基因克隆的基本步驟分：分離目的基因和載體DNA。

限制性核酸內(nèi)切酶

連接酶

聚合酶(Taq酶、末端轉(zhuǎn)移酶)

多聚核苷酸激酶

堿性磷酸酶合成雙鏈cDNA分子5ˊ羥基末端磷酸化

切除末端磷酸基一、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶合成雙鏈cDNA分子5ˊ羥基末端磷酸化切1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease,RE）

能識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。主要來源于原核生物由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA1.限制性核酸內(nèi)切酶能識別DNA的特異序列第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶分類

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名HindⅢⅡ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(palindrome)

GGATCCCCTAGG舟行水面水行舟Asegmentofdouble-strandedDNAinwhichthenucleotidesequenceofonestrandreadsinreverseordertothatofthecomplementarystrand.Inthesamestrandcontainingcomplementarynucleotidesequencewithoppositepolarity.Ⅱ類酶識別序列特點——回文結(jié)構(palindrome)在對稱軸中心同時切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'

II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口切割：以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’端為羥基。在對稱軸中心同時切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（blunt

在對稱軸兩側(cè)相對位點分別切割一條鏈。從5'端切割產(chǎn)生5'端突出的粘性末端，如EcoRⅠ：

從3'端切割產(chǎn)生3'端突出的粘性末端。如PstⅠ：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…G5'

AATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAA5'

G…5'5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCA3'G…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…G3'ACGTC…

5'

在對稱軸兩側(cè)相對位點分別切割一條鏈。從5'端切割產(chǎn)生5限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放

1．在下述雙鏈DNA序列(僅列出其中一鏈序列)中不屬于完全回文結(jié)構的是

A．AGAATTCTB.TGAATTCAC．GGAATTCCD．CGTTAAGCE．AGATATCT1．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…AGCTG▼AATTC…3’產(chǎn)生

2．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…CTGCA▼GAGTC…3’產(chǎn)生

3．某識別6核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶切割5’…AGGTT▼AACAG…3’產(chǎn)生5'端突出的粘性末端3'端突出的粘性末端平末端1．在下述雙鏈DNA序列(僅列出其中一鏈序列)中不屬于完全常用的載體按來源分為：質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體(phage)和病毒(virus)按得到的產(chǎn)物，載體可分為：克隆載體（cloningvector）主要用于基因片斷的擴增表達載體（expressionvector）用于獲得目的基因編碼的蛋白質(zhì)（二）載體的分類常用的載體按來源分為：按得到的產(chǎn)物，載體可分為：（二）載體的載體的選擇標準復制起始點，能自主復制；具有一個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標準復制起始點，能自主復制；質(zhì)粒（plasmid）

質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細胞獨立自主地進行復制，并在細胞分裂時保持恒定地傳給子代細胞。質(zhì)粒帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞新的遺傳性狀。因為質(zhì)粒DNA有自我復制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組DNA操作的載體。質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細菌染色體目錄氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點ori目錄氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點oriλ噬菌體

λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λ-DNA組成。λ噬菌體（lambdabacteriophage）DNA，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個堿基的互補粘性末端，稱COS位點。當噬菌體侵入宿主細胞，兩個粘性末端互補結(jié)合，形成環(huán)狀分子。λDNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。

SalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠλ噬菌體λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λlacZ’基因:編碼-半乳糖苷酶的-片段

M13噬菌體載體—pUC18和pUC19載體多克隆位點rlacZ’基因:編碼-半乳M13噬菌體載體—pUC18酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他三、重組DNA技術基本原理及操作步驟基本原理目的基因的獲取重組DNA導入受體菌

外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

三、重組DNA技術基本原理及操作步驟基本原理目的基因的獲取重

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目錄以目錄（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（見第20章）

（一）目的基因的獲取1.化學合成法*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列合成的基因有：人生長激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽、干擾素基因等。*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫P441(genomicDNAlibrary)組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因

逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫的特點◆代表了取材當時所表達基因的總和，不包括那些未表達的基因?！鬽RNA分子中不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列，所以cDNA文庫的復雜性要比基因組文庫低的多。

cDNA文庫的特點體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)(Mg2+)和DNA變性、復性(退火)及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴增.聚合酶鏈式反應P407

（PolymeraseChainReaction,PCR）

體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術。聚合酶5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技術的工作原理目錄DNA變性復性延伸5Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555

555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄Cycle35555555555DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cyclen理論上可達2n個拷貝原料（pg）

產(chǎn)物(μg)體外高效、快速、特異

地擴增DNA片段g→mg→ug→ng→pgDNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cycl（三）外源基因與載體的連接

粘性末端連接平端連接（二）克隆載體的選擇和構建（三）外源基因與載體的連接粘性末端連接（二）克隆載體粘性末端連接

外源DNA片段與載體用同一種限制性內(nèi)切酶切割，獲得相同的粘性末端，相互互補配對，在DNA連接酶作用下，形成重組DNA分子。DNA連接酶“縫合”基因的“分子針線”。粘性末端連接外源DNA片段與載體用同一種限制性內(nèi)DNA連接酶的作用過程點擊播放DNA連接酶的作用過程點擊播放BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接BamHⅠ切割反應GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平末端的補齊目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶

T4DNA連接酶

15oC重組體載體自連目的基因自連2.平端連接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。如將poly（dA）加到雙鏈DNA片段3’羥基上，而將poly（dT）加到質(zhì)粒載體3’羥基上，制造出粘性末端，然后通過退火進行粘性末端連接。3.同聚物加尾連接受體菌條件

安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式

轉(zhuǎn)化(transformation)

將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)染(transfection)

將外源DNA直接導入真核細胞.感染(infection)

以噬菌體和真核病毒作載體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為感染（四）重組DNA導入受體菌受體菌條件安全宿主菌CaCl2誘導轉(zhuǎn)化特殊處理受體細胞細胞膜特性改變感受態(tài)細胞的制備基因片段（特別是純化的DNA）很難直接導入受體細胞，通常將受體細胞預先加以處理，如在低溫條件下，用CaCl2（冰?。┨幚泶竽c桿菌，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。這種經(jīng)過預處理、容易導入外源核酸分子的受體細胞被稱作“感受態(tài)細胞”（competentcell）。CaCl2誘導轉(zhuǎn)化特殊處理受體細胞細胞膜特性改變感受態(tài)細胞的連接目的基因基因載體連接酶轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化后菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑：（五）重組體的篩選1.載體遺傳標記篩選抗藥性標記選擇標志補救(markerrescue)2.序列特異性篩選法（1）RE酶切法(2)PCR法（3）核酸分子雜交3.親和篩選法如免疫化學方法及酶免檢測分析等連接目的基因轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化后菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑：（五）重組體1）抗藥性標志的選擇(插入失活法)pBR322AmprTetr插入外源基因片段標志基因Tetr失活Amp平板Tet平板轉(zhuǎn)化區(qū)別非轉(zhuǎn)化菌與轉(zhuǎn)化菌？雙抗生素對照篩選重組子能在含有Ap的培養(yǎng)板上生長但不能在含有Tet的培養(yǎng)板上生長1）抗藥性標志的選擇(插入失活法)pBR322AmprTet2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段?-半乳糖苷酶活性lacZ’缺陷型的大腸桿菌Ampuc18（LacZ’基因N端序列）2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段?X-galX-galLacZ藍色化合物X-galX-galLacZ藍色化合物a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段（LacZ’基因失活）LacZ’基因C端序列LacZ酶w片段w片段X-galα互補：單獨存在的α及

ω片段都沒有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細胞與克隆載體同時表達兩個片段時，宿主細胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{色化合物。如果插入的外源基因是在lacZ’基因內(nèi)，就會影響lacZ’的表達，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長時會出現(xiàn)白色菌落；若無外源基因插入，則出現(xiàn)藍色菌落。白色菌落a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段LacZ’基因C目錄-互補：通過藍白斑篩選可以篩選、鑒定重組子與非重組子載體β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成藍色菌落。當外源基因插入后，LacZ’基因被破壞，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。目錄-互補：通過藍白斑篩選可以篩選、鑒定重組子與非重組子

指用探針檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補配對原則發(fā)生同源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復性（renaturation）預雜交（prehybridization）雜交（hybridization）

探針：帶有可檢測標記的已知序列的DNA或RNA片段。

3)核酸分子雜交（molecularhybridization）指用探針檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補菌落原位雜交菌落原位雜交雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄3.親和篩選法

雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄3.親和篩選法重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切割目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基①分______分離出目的基因及載體DNA。②切______利用限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體。③接______利用連接酶將目的基因與載體DNA共價連接形成重組DNA分子。④轉(zhuǎn)______重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞。⑤篩______篩選和鑒定含有重組DNA分子的受體細胞（陽性克?。?。重組DNA的基本過程①分______分離出目的基因及載體DNA。重組DNA的基本重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源大量生長克隆載體：拷貝大量目的基因表達載體：獲得大量目的蛋白克隆基因的表達表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化大量生長克隆載體：拷貝大量目的基因克隆基因的表達表達體系的建基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆第三節(jié)、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥（三）基因診斷（四）基因治療（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆第三節(jié)、重組技術與醫(yī)學的關系（二）

神話成現(xiàn)實

——綠葉變?yōu)轷r花神話成現(xiàn)實基因武器

20克超級基因可使60億人死于非命

一旦基因武器運用于戰(zhàn)爭，將使未來戰(zhàn)爭發(fā)生巨大變化?；蛭淦魇褂谜咴僖膊挥门d師動眾，而只需要在臨戰(zhàn)前將經(jīng)過基因工程培養(yǎng)的病菌投入他國，使敵方人畜在短時間患上一種