低分子量肝素的抗過(guò)敏作用

低分子量肝素的抗過(guò)敏作用*摘要：目的：研究低分子量肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)的抗過(guò)敏作用。方法：用卵白蛋白(ovalbumin,OA)免疫豚鼠造成過(guò)敏模型，觀察LMWH對(duì)OA所致的豚鼠離體回腸平滑肌收縮的影響；在大鼠顱骨骨膜接種抗血清使肥大細(xì)胞被動(dòng)致敏，觀察LMWH對(duì)OA引起肥大細(xì)胞脫顆粒的影響；以4-氨基毗啶誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)，觀察LMWH對(duì)舔體反應(yīng)的影響；以冰醋酸使小鼠毛細(xì)血管通透性增加，觀察LMWH對(duì)通透性的影響。結(jié)果：LMWH16000u.L-1(P<0.01)和8000u.L-1(P<0.05)均能顯著降低OA所致的致敏豚鼠離體回腸平滑肌收縮高度；LMWH200，50和12.5u.kg-1(PV0.01)均能明顯抑制顱骨骨膜肥大細(xì)胞脫顆粒；LMWH60u.kg-1(P<0.01)和30u.kg-1(P<0.05)均能顯著減少4-氨基毗啶誘發(fā)的小鼠舔體反應(yīng)次數(shù)，并能抑制冰醋酸所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加。結(jié)論：LMWH對(duì)多種動(dòng)物模型具有抗過(guò)敏的作用，這種作用可能與其抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和抗炎作用有關(guān)。關(guān)鍵詞：低分子量肝素；過(guò)敏反應(yīng)；肥大細(xì)胞TheeffectsoflowmolecularweightheparinonallergicresponseWangQingli(WangQL)

(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)

ShangXueyuan(ShangXY)(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)

JiJianbo(JiJB)(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)ABSTRACT:OBJECTIVE：Tostudytheeffectsoflowmolecularweightheparin(LMWH)onallergicresponse.METHODS:Guinea-pigsweresensitizedbyovalbumin(OA)andtheeffectsofLMWHontheconstrictionofileumsmoothmuscleinducedbyOAwereobservedinvitro;TheeffectsofLMWHonthedegranulationofpericraniummastcellinducedbyOAwereobservedthroughthepassiveanaphylaxisratmodelwhichwasmadebyvaccinatingantiserumatpericranium;Lickingresponsewasinducedby4-aminopyridine(4-AP)scatscruffinmice,thentheeffectofLMWHonlickingresponsewasstudiedthecapillarypemeabiltyincreasinginducedbyglactalaceticacidandtheeffectofLMWHoncapillarypemeabilitywerestudied.RESULTS:LMWH16000and8000u-L-1couldsignificantlyinhibittheconstrictionoftheisolatedileumsmoothmuscleofovalbumin(OA)-sensitizedguineapigsinducedbyOAinvitro(P<0.01,P<0.05vsvehicle);LMWH200,50and12.5u-kg-1ipcouldmarkedlyinhibitthedegranulationofpericraniumMCinrats(P<0.01vsvehicle),LMWH60and30u-kg-1ipcouldsigificantlydepressthelickingresponseinducedby4-aminopyridineandtheincreasingofcapillarypermeabilityinducedbyaceticacidinmice（PV0.01,PV0.05vsvehicle）.CONCLUSION:LMWHinthedosagesusedinthepresentstudypossessedanti-allergicactivityinseveralanimalmodels,andtheactivitywaslikelyrelatedtoitsinhibitoryeffectsonthedegranulationofMCandtoitsantiinflammatoryeffects.KEYWORDS：lowmolecularweightheparin,allergicresponse,mastcell▲肝素類(lèi)藥物除作為抗凝藥應(yīng)用于臨床外，還具有多種非抗凝活性，如免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抗腫瘤、抗艾滋病、抗炎等⑴。最近研究發(fā)現(xiàn)肝素類(lèi)藥物能抑制房塵螨提取物（house-dustmiteextract）等過(guò)敏原和組織胺引起的過(guò)敏性哮喘反應(yīng)和抗原引起的皮膚和肺的急性過(guò)敏反應(yīng)學(xué)?力。低分子量肝素（LMWH）是近年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型生化藥物，是肝素以不同的工藝分級(jí)或降解而成的低分子量的組分或片段，Mr約3000?8000，較未分級(jí)肝素具有明顯的優(yōu)越性［4?5】。本研究通過(guò)多種動(dòng)物模型研究了LMWH抗過(guò)敏反應(yīng)方面的作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。1材料1.1藥品與試劑LMWH匚"5500（本校生化制藥教研室），地塞米松（dexamethasone,Dex，濟(jì)南永寧制藥股份有限公司），冰醋酸（HAc，上海試劑一廠），吸附百日咳菌苗白喉破傷風(fēng)類(lèi)毒素混合制劑（衛(wèi)生部上海生物制品研究所）；卵白蛋白（ovalbumin,OA），4-氨基毗啶（4-aminopyridine,4-AP），依文思藍(lán)（均為Sigma產(chǎn)品），用前以NS配成所需濃度。1.2動(dòng)物豚鼠（175±25）g；Wistar大鼠（125±25）g；昆明種小鼠（20±2）g,均由山東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3儀器臺(tái)式自動(dòng)平衡記錄儀（中國(guó)上海）；U2000分光光度計(jì)（日本產(chǎn)）；Olmpus顯微鏡（日本產(chǎn)）。2方法LMWH對(duì)OA引起致敏豚鼠離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮的影響⑹豚鼠imOA50mg.ml-1溶液0.4ml，同時(shí)ip1ml致敏。30d后制備腸段進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)。充氧，負(fù)荷1g，36°C保溫，按隨機(jī)順序分別給以NS（等容量），LMWH高、低劑量或Dex使浴液終末藥物濃度分別達(dá)到16000，8000u.L-1和200mg.L-1。均于藥后5min加OA0.2mg記錄收縮高度（mm），并按下式計(jì)算收縮抑制率（%）。LMWH對(duì)大鼠顱骨骨膜肥大細(xì)胞（mastcell,MC）脫顆粒的影響［6?8】2.2.1制備抗血清大鼠兩后腿imOA10mg.kg-1，同時(shí)ip吸附百日咳菌苗白喉破傷風(fēng)類(lèi)毒素混合制劑2ml.只-1。2周后頸總動(dòng)脈取血制備抗血清，-20°C保存，用前以NS稀釋成1：20備用。2.2.2脫顆粒實(shí)驗(yàn)取大鼠隨機(jī)分成5組，第1天分別ip,NS（等容量），LMWH200，50，12.5u.kg-i和Dex2.5mg.kg-i。藥后30min，ip戊巴比妥麻醉動(dòng)物，將1：20抗血清0.15ml接種于大鼠顱頂皮下。第2天藥后30min抗原攻擊，ivOA1mg（溶于2.5mg.ml-1的依文思藍(lán)溶液1ml中）。30min后頸總動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，剪去顱頂部皮膚，取下顱蓋骨，立即浸于無(wú)水乙醇中，1h后移置無(wú)水甲醇中固定過(guò)夜，1.8mg.ml-1的中性紅無(wú)水乙醇液染色30min，自來(lái)水沖洗，小心分離骨膜，平鋪于玻片上，干燥后，顯微鏡下直接觀察進(jìn)行MC計(jì)數(shù)，計(jì)算每1mm2的MC數(shù)，計(jì)算脫顆粒率。LMWH對(duì)4-AP誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)的影響⑴取小鼠，隨機(jī)分成4組。實(shí)驗(yàn)日分別ipNS（等容量），LMWH60，30u.kg-1或Dex3mg.kg-1。藥后30min，動(dòng)物頸背部sc4-AP1mg.kg-1，記錄動(dòng)物發(fā)生舔體反應(yīng)的潛伏期和10min內(nèi)的舔體次數(shù)。LMWH對(duì)HAc所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加的影響小鼠40只，隨機(jī)分成4組，實(shí)驗(yàn)日分別ipNS（等容量），LMWH60，30u.kg-1或Dex3mg.kg-1。30min后，ip1mol.L-1HAc溶液10ml.kg-1。30min后，iv50mg.ml-1依文思藍(lán)10ml.kg-1。20min后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剪開(kāi)腹部皮膚，經(jīng)腹膜向腹腔注入6mlNS，輕輕按摩2min，回收腹腔液，離心后取上清于A560nm處測(cè)定吸光度A。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以Bis表示，按t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果LMWH對(duì)OA引起致敏豚鼠離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮的影響加入OA可引起致敏回腸平滑肌收縮，與NS組比較，LMWH16000u.L-1和8000u.L-1均能顯著降低回腸平滑肌的收縮高度（分別PV0.01和PV0.05）；Dex200mg.L-1也能顯著降低收縮高度（PV0.01）。LMWH16000u.L-1組和Dex200mg.kg-1組比較無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表1。表1LMWH對(duì)OA引起致敏豚鼠離體回腸平滑肌過(guò)敏性收縮的影響.匕LI±s組別濃度標(biāo)本數(shù)/n收縮高度/mm抑制率/%NS等容量973.0±9.5--LMWH16000u.L-1747.7±18.12)32.78000u.L-1756.0i19.11)28.9Dex200mg.L-1737.5±14.62)43.9注：與NS組比較，1）PV0.05,2）PV0.01LMWH對(duì)大鼠顱骨骨膜MC脫顆粒的影響各組MC總數(shù)無(wú)顯著性差別（PV0.05）。OA可引起被動(dòng)致敏大鼠顱骨骨膜MC

脫顆粒，與NS組比較，LMWH各劑量組和Dex2.5mg.kg-i組均能顯著減少脫顆粒MC數(shù)(PV0.01)，降低脫顆粒率作用與劑量呈正相關(guān)。LMWH50u.kg-i組和12.5u.kg-1組與Dex2.5mg.kg-1組比較，無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表2。表2LMWH對(duì)大鼠顱骨骨膜肥大細(xì)胞脫顆粒的影響.』土s,n=8組別劑量MC總數(shù)/個(gè)mm-2脫顆粒MC數(shù)/個(gè).mm-2脫顆粒率/%NS等容量407.8±118.4361.4±104.288.7±3.6LMWH200u.kg-1492.0±89.280.0±38.51)15.8±5.51)50u.kg-1449.8±89.1142.0±42.71)31.4±5.41)12.5u.kg-1377.5±110.0167.0±51.71)44.9±3.61)Dex2.5mg.kg-1351.0±55.7170.0±27.61)48.9±6.41)注：與NS組比較，1)PV0.01LMWH對(duì)4-AP誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)的影響4-AP可誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)。與NS組比較，LMWH60u.kg-1和30u.kg-1均能顯著減少4-AP誘發(fā)的小鼠舔體次數(shù)(分別PV0.01和PV?0.05)；Dex3mg.kg-1組也能明顯減少舔體次數(shù)(PV0.01)；LMWH各劑量組和Dex組對(duì)潛伏期均無(wú)顯著影響，LMWH60u.kg-1組和Dex3mg.kg-1組無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表3。表3LMWH對(duì)4-AP誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)的影響.』土s,n=10組別劑量潛伏期/s舔體次數(shù)NS等容量50.3±21.234.6±16.6LMWH60u.kg-164.7±22.016.2±4.02)30u.kg-162.7±25.721.7±5.61)Dex3mg.kg-162.6±17.315.2±7.52)注：與NS組比較，1)PV0.05,2)PV0.01LMWH對(duì)HAc所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加的影響與NS組比較，LMWH60u.kg-1(P<0.01)，30u.kg-1(P<0.05)和Dex(PV0.01)均能顯著降低A值，即降低HAc所致的毛細(xì)血管對(duì)依文思藍(lán)的通透性增加，結(jié)果見(jiàn)表4。表4EO±s,n=10組別劑量表4EO±s,n=10組別劑量ANS等容量0.454±0.054LMWH60u.kg-10.345±0.0792)LMWH對(duì)HAc所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加的影響.30u.kg-10.382+0.0821)Dex3mg.kg-10.290+0.0742)注：與NS組比較，i）PV0.05,2）PV0.014討論32+[8]3果還顯示，LMWH能抑制OA引起的致敏豚鼠離體回腸平滑肌收縮，該作用可能依賴(lài)于其抑制MC脫顆粒從而降低炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)，表明LMWH有抑制致敏原引起的過(guò)敏反應(yīng)的作用。4-AP是一種K+通道阻滯劑，可以阻滯K+通道，膜電位降低，Ca2+通道易于打開(kāi)，使更多的Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)神經(jīng)末稍釋放遞質(zhì)，從而促使MC脫顆粒[10]。頸背部4-AP可引起皮膚MC脫顆粒，釋放組胺，引起小鼠舔體反應(yīng)⑼。LMWH能顯著減少4-AP引起的小鼠舔體反應(yīng)次數(shù)，表明LMWH能夠抑制非抗原引起的MC脫顆粒。過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中伴有炎癥的發(fā)生，毛細(xì)血管通透性升高是炎癥早期的重要反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)LMWH能降低HAc所致的毛細(xì)血管通透性升高，提示LMWH也可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮其抗過(guò)敏作用?！龌痦?xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金資助號(hào)Q98Co7130作者單位：王慶利（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）尚雪原（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）紀(jì)建波（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）孟雅娟（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）朱業(yè)靖（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）程艷娜（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）張世玲（濟(jì)南山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室250012）參考文獻(xiàn)：尚麗，周序斌，張黎華.肝素的非抗凝藥理作用.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1995,11（4）：366.Diamantz,TimmersMC,vanderVeenH,etal.Effectofheparinonallergen-inducedearlyandlateasthmaticresponsesinpatientswithatopicasthma.AmJRespirCritCareMed,1996,153:1790.BowlerSD,SmithSM,LavercombePS.Heparininhibit