異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測試劑盒說明書-紫外分光光度法UPLC-MS-5073

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網址：本產品僅供科學研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質檢測技術有限公司第第頁異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測試劑盒說明書注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。貨號：UPLC-MS-5073規(guī)格：50T/48S

紫外分光光度法產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體60mL×1瓶4℃保存試劑一液體10mL×1瓶4℃保存試劑二液體10mL×1瓶4℃保存試劑三粉劑×2瓶-20℃保存試劑四粉劑×2瓶-20℃保存試劑五液體100μL×1支4℃保存試劑六液體13mL×1瓶4℃保存試劑七粉劑×1支4℃保存溶液的配制：1、提取液：臨用前將試劑七加入到提取液中，勿放于-20℃；216.25mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑-20℃2復凍融；316.6mL-20℃2凍融；4、試劑五：使用前需先離心。根據用量按照試劑五:蒸餾水為1:8的體積比例充分混勻，現用現配；5、工作液配制：按試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=145:175:210:210:15的比例將各試劑混合后備用（共755μL，1T的量），根據樣本數量現用現配。產品說明：ICL（EC）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他過程將脂肪轉變成碳水化合物。ICL是乙醛酸循環(huán)的關鍵酶之一。ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應ICL活性。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）15001mL（200W31030次15000g420置冰上待測。20.1g1mL提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃20冰上待測。二、測定步驟紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。樣本測定試劑測定管工作液（μL）755樣本（μL）35試劑六（μL）2101mL340nm10秒時的初37℃（哺乳動物25℃（其它物種水浴中準確反應分鐘；迅速取出比色皿并擦干，340nm210A2ΔA=A1-A2。三、ICL活性計算1、組織中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=2297×ΔA÷Cpr按樣本質量計算：單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/g質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W÷V提取×V樣本)÷T=2297×ΔA÷WV反應時間，2min；109：單位換算系數，1mol=109nmol。2、細菌或培養(yǎng)細胞中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=2297×ΔA÷Cpr按細菌或細胞數量計算：單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/104cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(500÷V提取×V樣本)÷T=4.59×ΔAVd：1mL石英比色皿光徑，1cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；500：細菌或細胞數量，500萬；T：反應時間，2min；109：單位換算系數，1mol=109