果膠酶活性測定

果膠酶活性測定果膠酶（Pectinase）是一類復(fù)合酶，是指分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱，主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（Pectinmethylesterase，PME）和果膠裂解酶（Pectinlyase，PL）等。其中，多聚半乳糖醛酸酶（PG）通過水解作用和反式消去作用，能切斷果膠分子中的α-1,4糖苷鍵，將果膠分子降解為小分子物質(zhì)。PG每切斷一個(gè)α-1,4糖苷鍵，就會(huì)形成一個(gè)還原性醛基。通過測定這些還原性醛基生成的量，或果膠分子降解時(shí)引起的粘度下降來測定PG的活性大小。測定果膠酶活性的方法主要有分比色法、滴定法和粘度降低法等。分光光度法測定的靈敏度、準(zhǔn)確度均高，重現(xiàn)性好，試劑用量少，尤其是操作省時(shí)、簡便；滴定法測試重現(xiàn)行好，準(zhǔn)確度高，但測定時(shí)間長，過程較繁瑣，試劑用量較大；粘度降低法測定果膠酶的復(fù)合酶活性比較準(zhǔn)確，但測定靈敏度不高。在具體測定是，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的方法。I．比色法一、目的要求學(xué)習(xí)比色法測定果蔬組織中多聚半乳糖醛酸酶活性的原理和方法。二、基本原理果膠在多聚半乳糖醛酸酶（PG）作用下，能水解產(chǎn)生帶有還原性醛基的半乳糖醛酸。3,5-二硝基水楊酸試劑可與其發(fā)生顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色的深淺程度，可以通過分光光度計(jì)測定PG活性的大小。三、材料、儀器及試劑（一）材料柑橘、蘋果、香蕉、桃等。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機(jī)、移液器、離心管、分光光度計(jì)、具塞刻度試管（25mL）、水浴鍋、容量瓶。（三）試劑1．50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液母液A（0.2mol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸餾水稀釋至1000mL。母液B（0.2mol/L醋酸鈉溶液）：稱取16.4g無水醋酸鈉（或稱取27.2g三水合乙酸鈉），用蒸餾水溶解、稀釋至1000mL。取6.8mL母液A和43.2mL母液B混合后，調(diào)節(jié)pH至5.5，稀釋至200mL，即為50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液。2．提取緩沖液（含1.8mol/LNaCl）稱取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液溶解、稀釋至100mL，搖勻。3．1%多聚半乳糖醛酸溶液稱取1.0g多聚半乳糖醛酸，溶于100mL50mmol/L、pH5.5醋酸緩沖液中。4．3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑（1）配制500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液；（2）配制262mL的2mol/LNaOH溶液；（3）稱取6.3g的3,5-二硝基水楊酸；（4）稱取5.0g結(jié)晶酚；（5）稱取5.0g亞硫酸鈉；（6）將（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，攪拌，使之溶解。待冷卻后，轉(zhuǎn)入到1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。5．預(yù)冷的95%乙醇、80%乙醇6．1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ?、?shí)驗(yàn)步驟（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，按照3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量的方法，用“0”號管作為參比調(diào)零，在540nm處測定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）酶液制備稱取10.0g果蔬樣品，置于經(jīng)預(yù)冷的研缽中，加入20mL經(jīng)預(yù)冷的95%乙醇，在冰浴條件下研磨勻漿后，全部轉(zhuǎn)入到離心管中，低溫放置10min，然后于4℃、12000×g離心20min。傾去上清液，向沉淀物中再加入10mL經(jīng)預(yù)冷的80%乙醇，振蕩，低溫放置10min，然后在相同條件下離心。再取傾去上清液，向沉淀物中再加入5mL經(jīng)預(yù)冷的提取緩沖液，于4℃放置提取20min，再經(jīng)過離心后收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆?。（三）活性測定取2支試管，每支試管中都分別加入1.0mL50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液和0.5mL1%多聚半乳糖醛酸溶液。再往其中一支試管中加入0.5mL酶提取液，另一支試管中加入0.5mL經(jīng)煮沸5min的酶提取液作為對照，混勻后置于37°C水浴中保溫1h。保溫后，迅速加入1.5mL3,5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5min。然后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻。在波長540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法比色，測定各管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)540nm吸光度值由標(biāo)曲查得糖量C(mg)樣品中PG活性(μg·h-1·g-1FW)對照樣品樣品-對照計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計(jì)算結(jié)果根據(jù)樣品反應(yīng)管和對照管溶液吸光度值的差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)葡萄糖毫克數(shù)。多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性以每小時(shí)每克鮮重（FW）果蔬組織樣品在37°C催化多聚半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的微克數(shù)表示，即μg·h-1·g-1FW。計(jì)算公式：式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖量，mg；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；t——酶促反應(yīng)時(shí)間，h；W——樣品重量，g；1.08——葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)（=194/180）。也可以每小時(shí)在37°C催化多聚半乳糖醛酸水解生成1μg半乳糖醛酸所需的酶量表示PG活性，即μg·h-1·mg-1蛋白質(zhì)。酶提取液的蛋白含量可用考馬斯亮藍(lán)染色法測得。六、注意事項(xiàng)1．在酶液制備過程中，為了將樣品中的蛋白質(zhì)沉淀出來，還可用冷的丙酮進(jìn)行蛋白質(zhì)的沉淀操作。2．酶促反應(yīng)時(shí)間、溫度條件必須嚴(yán)格控制，否則會(huì)產(chǎn)生較大誤差。為減小誤差，應(yīng)特別注意以下兩步操作：①果膠溶液先在37℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。酶液在37℃恒溫水浴中預(yù)熱2min后，加入預(yù)熱過的果膠溶液，迅速混合、記時(shí)。這樣可使反應(yīng)一開始就在預(yù)定條件下進(jìn)行。②在酶促反應(yīng)結(jié)束時(shí)，應(yīng)迅速操作。3．因?yàn)樵谂渲?,5-二硝基水楊酸（DNS）時(shí)，加入了氫氧化鈉，而使得DNS試劑的堿性非常強(qiáng)，強(qiáng)堿抑制了果膠酶的活性?？梢岳眉尤氲腄NS試劑來終止保溫后的酶促反應(yīng)。4．一般可以用葡萄糖作為還原糖進(jìn)行計(jì)算各種還原性醛基的生成量，也可以在具體測定某種還原性醛基時(shí)，可以用相應(yīng)的產(chǎn)物入半乳糖醛酸來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。5．對于某些果蔬樣品，以50mmol/L、pH4.5醋酸鈉緩沖液作為反應(yīng)緩沖液，測定效果會(huì)更好些。II．碘液滴定法一、目的要求學(xué)習(xí)碘液滴定法測定果蔬組織中果膠酶活性的原理和方法。二、基本原理果膠酶徹底水解果膠生成的半乳糖醛酸，在堿性溶液中可與碘（過量）發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)后剩余碘的量可通過硫代硫酸鈉溶液滴定進(jìn)行測定，進(jìn)而計(jì)算出酶解反應(yīng)中產(chǎn)生的半乳糖醛酸的量，用來衡量果膠酶活性的大小。三、材料、儀器及試劑（一）材料柑橘、蘋果、山楂、梨等。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機(jī)、移液器、離心管、水浴鍋、滴定管，三角瓶。（三）試劑1．100mmol/L、pH4.5醋酸緩沖液（含0.2mol/LNaCl）。2．1%果膠（多聚半乳糖醛酸）溶液稱取1.0g果膠，加熱水溶解，煮沸。冷卻后過濾，調(diào)節(jié)pH至3.5，定容到100mL。3．1mol/L碳酸鈉溶液4．0.1mol/L碘-碘化鉀溶液稱取25g碘化鉀，溶于200mL水中，再迅速稱取12.7g結(jié)晶碘，置于燒杯中，將溶解的碘化鉀溶液倒入其中，用玻璃棒攪拌直至碘完全溶解后，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，貯于磨口試劑瓶。5．1mol/L硫酸溶液取1mL濃硫酸，稀釋到18mL。6．50mmol/L硫代硫酸鈉稱取13.0gNa2S2O3?5H2O和0.2g碳酸鈉，溶于煮沸的蒸餾水，冷卻后稀釋至1000mL。7．0.5%淀粉指示劑稱取0.5g可溶性淀粉，加少量蒸餾水?dāng)噭颍{(diào)成糊狀，隨后一面攪拌一面加入約60mL熱水，再將此溶液煮沸2~3min，靜置冷卻后定容至100mL（可冷藏備用）。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提取同比色法。（二）酶活性測定取6.0mL1%果膠溶液，加入1.0mL酶液，在50℃水浴中保溫2h后取出，加熱煮沸3min。待冷卻后，取5.0mL反應(yīng)液移入三角瓶中，加入1.0mL1mol/L碳酸鈉溶液和5.0mL0.1mol/L碘-碘化鉀溶液，搖勻，加塞，于室溫下避光放置20min。然后，加入2.0mL1mol/L硫酸溶液，立即用50mmol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至淡黃色后，加入1.0mL0.5%淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。記錄所消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)（A）?？瞻自囼?yàn)中，取6.0mL1%果膠溶液，加入1.0mL酶液后立即加熱煮沸3min。待冷卻后，直接從中取5.0mL混合液移入三角瓶中，進(jìn)行相同操作，然后滴定，記錄消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)（B）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液總體積V(mL)吸取樣液體積Vs(mL)硫代硫酸鈉消耗量(mL)硫代硫酸鈉濃度C(mol/L)樣品中果膠酶活性(μmol·h-1·g-1FW)樣品A空白B計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計(jì)算結(jié)果在上述條件下，將每克果蔬組織每小時(shí)催化果膠分解生成1μmol游離半乳糖醛酸時(shí)定為一個(gè)果膠酶活性單位（U），則U=μmol·h-1·g-1FW。計(jì)算公式：式中：C——硫代硫酸鈉的摩爾濃度，mol/L；B——空白滴定消耗硫代硫酸鈉體積，mL；A——樣品滴定消耗硫代硫酸鈉體積，mL；0.51——1mol硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51mol游離半乳糖醛酸；V——果膠酶提取液總體積，mL；VS——吸取樣液體積，mL；t——酶促反應(yīng)時(shí)間，h；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)硫代硫酸鈉滴定液（50mmol/L）的標(biāo)定：精確稱取0.15g經(jīng)120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀，置碘瓶中，加50mL蒸餾水溶解，再加入2.0g碘化鉀，輕輕振搖使溶解，最后加入40mL1mol/L硫酸溶液，搖勻，密塞后在暗處放置10分鐘。然后加入250mL蒸餾水稀釋。用本硫代硫酸鈉滴溶液滴定至近終點(diǎn)時(shí)，加3mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失而顯亮綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1mL的硫代硫酸鈉滴定液（50mmol/L）相當(dāng)于2.452mg的重鉻酸鉀。根據(jù)本液的消耗量與重鉻酸鉀的取用量，算出本液的濃度即可。在室溫25℃以上時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)液及稀釋用水降溫至約20℃。III．粘度降低法一、目的要求學(xué)習(xí)粘度降低法測定果蔬組織中果膠酶性的原理和方法。二、基本原理果膠溶于水后形成粘稠狀溶液。在果膠酶作用下，果膠分子降解，聚合程度和酯化程度降低，果膠溶液粘度降低。因此，果膠溶液粘度的下降程度可以反映果膠酶的活性大小。三、材料、儀器及試劑（一）材料柑橘、蘋果、山楂、梨等。（二）儀器及用具粘度計(jì)、研缽、高速冷凍離心機(jī)、計(jì)時(shí)器、移液器、離心管，水浴鍋。（三）試劑4%多聚半乳糖醛酸（鈉鹽）溶液，用50mmol/L、pH4.5醋酸緩