生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告-DNA定量測(cè)定(二苯胺法)800字

生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告--DNA定量測(cè)定(二苯胺法)800字

DNA的定量測(cè)定-二苯胺法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)和掌握用濃鹽法從動(dòng)物肝臟中提取DNA的原理和方法；2.學(xué)習(xí)和掌握用二苯胺法測(cè)定DNA含量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1．DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成ω-羥基-γ-酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍(lán)色化合物（λmax=595nm）。2．在DNA濃度為20-200μg/ml的范圍內(nèi)，吸光度與DNA濃度成正比，可用比色法測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)儀器?試管?移液管?7220分光光度計(jì)四、實(shí)驗(yàn)試劑1、DNA標(biāo)準(zhǔn)液（200ug/ml）：稱取10mgDNA鈉鹽溶于5mol/l氫氧化鈉溶液并稀釋至100ml。2、二苯胺試劑：A液：稱取純二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加濃硫酸1.5ml。貯于棕色瓶中。B液：稱取1.6ml乙醛溶于100ml蒸餾水中，臨用時(shí)配制臨用時(shí)，將20mlA液和0.1mlB液混合即可五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)DNA濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測(cè)定吸取DNA樣液1.0ml，加入蒸餾水1.0ml，混勻。然后加入二苯胺溶液4.0ml,加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)所測(cè)得的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得DNA的質(zhì)量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：由上表可知樣液的吸光度y=0.115，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出DNA樣液的濃度x=18.49μg/ml。故樣品中DNA的質(zhì)量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、實(shí)驗(yàn)分析1.測(cè)定DNA含量的方法還有哪些原理?熒光法，用PicoGreen熒光染料，測(cè)定DNA濃度比較靈敏，并且適合測(cè)量低濃度和微量DNA，并且受其它雜質(zhì)的影響不大，缺點(diǎn)要有專門的熒光檢測(cè)儀器，試劑比較昂貴。2.實(shí)驗(yàn)中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的斷裂損傷,DNA在酸性條件下加熱，在反應(yīng)液中加入少量乙醛,可以提高反應(yīng)靈敏度.

第二篇：二苯胺法測(cè)定DNA含量1100字實(shí)驗(yàn)12二苯胺法測(cè)定DNA含量一、目的學(xué)習(xí)和掌握測(cè)定DNA的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技術(shù)。二、原理脫氧核糖核酸中的α—脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成ω—羥基—γ酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。CH2C—CHCHO藍(lán)色化合物酸性條件二苯胺Oω—羥基—γ酮基戊醛三、材料、試劑和器具（一）試劑1、DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氫氧化鈉溶液配制成200微克/毫升的溶液。2、DNA樣品液：（自己提取）控制其DNA含量在50~100微克/毫升左右。3、二苯胺試劑：稱取1克結(jié)果的二苯胺試劑溶于100毫升分析純的冰醋酸中，再加入10毫升過(guò)氯酸（A.R60%以上）或濃硫酸2.75毫升，混勻備用。臨用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液應(yīng)保存于冰箱，一周內(nèi)可使用）所配得的溶液應(yīng)為無(wú)色。（二）器具1、試管及試管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒溫水浴4、可見光分光光度計(jì)四、操作步驟（一）DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支試管，編號(hào)，按下表加入試劑==加畢，搖勻，于60℃恒溫水浴中保溫1小時(shí)，（或于沸水中煮沸15分鐘，冷卻測(cè)0.D595nm值。）以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測(cè)定取2支試管，各加0.2~0.5毫升的待測(cè)液（內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)范圍之內(nèi)）加蒸餾水稀釋至2毫升，再加4毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同。根據(jù)測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光密度DNA的含量，按下式計(jì)算出樣品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待測(cè)液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值×稀釋倍數(shù)DNA產(chǎn)率(%)?含量/毫升?總體積新鮮鮮肝(g)?106?100五、注意事項(xiàng)1、二茉胺法測(cè)定DNA含量靈敏度不高，待測(cè)樣品中DNA含量低于50mg/L即難以測(cè)定。乙醛可增加二苯胺法測(cè)定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測(cè)定的靈敏度。2、樣品中含有少量RNA并不影響測(cè)定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應(yīng)形成有色化合物，故能干擾DNA定