響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!主要內(nèi)容1.香菇多糖與提取方法簡介2.Plackett-Burman設(shè)計法與響應(yīng)面分析法3.實驗材料與方法4.Plackett-Burman優(yōu)化培養(yǎng)基實驗設(shè)計5.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成6.結(jié)論響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!1.香菇多糖與提取方法簡介香菇多糖：是一種生理活性物質(zhì)。它具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能。提取方法：從香菇子實體或經(jīng)深層發(fā)酵后的發(fā)酵液中提取。香菇子實體生長周期長，產(chǎn)量和多糖得率均較低。而深層發(fā)酵培養(yǎng)香菇菌絲體不僅發(fā)酵液中含有與子實體相當或更高的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還可利用農(nóng)副產(chǎn)品作原料，成本低，周期短，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因此已得到廣泛應(yīng)用于重視。

但目前香菇菌絲體發(fā)酵水平較低，通過優(yōu)化條件以提高多糖含量是發(fā)酵過程中急需解決的問題。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!本實驗優(yōu)化香菇多糖培養(yǎng)基方法用Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選影響香菇產(chǎn)多糖的主要因素用Box-Behnken實驗設(shè)計對培養(yǎng)基做響應(yīng)面分析實驗回歸模型驗證實驗，確定最優(yōu)培養(yǎng)基最陡爬坡法確定因素水平用統(tǒng)計軟件SAS8.0進行回歸擬合，建立回歸模型與方程響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!3.4粗多糖提取將發(fā)酵菌懸液離心（4,000r/min，20min），分別收集上清液和菌體。上清液中加入無水乙醇至75%（v/v），冰箱保存過夜，再經(jīng)離心（8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多糖測定。菌體洗滌后，懸浮于一定體積的去離子水中，超聲波破壁（300Hz，10min)，高速離心（10,000r/min，10min）收集上清液，處理過程同上，用于胞內(nèi)多糖測定。粗多糖為胞內(nèi)多糖與胞外多糖之和。1.5粗多糖測定粗多糖含量測定采用苯酚-硫酸法（Duboisetal.1956）響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!表1Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果BACK響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!4.2最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果要得到響應(yīng)面擬合方程，必須要先逼近最佳值區(qū)域。而本方法以實驗值的變化方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值大小確定變化步長。根據(jù)表2分析結(jié)果，確定不顯著因素的水平，表現(xiàn)為負效應(yīng)的因素取低值水平，正效應(yīng)的取高值。顯著因素的變化步長及方向的實驗設(shè)計及結(jié)果表明（表3），第3組產(chǎn)量最高，因此以第3組的水平作為響應(yīng)面實驗的中心點，即葡萄糖2%，魚粉1.0%，KH2PO40.1%。0.50.051.5最佳組響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!表5Box-Behnken實驗設(shè)計及相應(yīng)結(jié)果3個中心實驗效果佳響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!模型的F檢驗值在α=0.05時遠大于F（9,5）=4.77，說明方程有很高的顯著性。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!葡萄糖影響最為顯著多糖開始由X2X3濃度增加而減少兩者相互作用顯著響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!回歸模型驗證實驗根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)基配方對模型進行驗證，香菇菌絲體產(chǎn)粗多糖為2.33g/L，實際值與預(yù)測值的誤差為+3.61%。初始培養(yǎng)基條件下總多糖產(chǎn)量為0.80g/L，優(yōu)化后提高了1.91倍。該結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)香菇粗多糖最佳培養(yǎng)基是可行有效的。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!2.Plackett-Burman設(shè)計法與響應(yīng)面分析法同：都是20世紀中葉后發(fā)展起來的的優(yōu)化實驗條件的統(tǒng)計學方法。能用較少的實驗次數(shù)推算出目標值的優(yōu)化條件，優(yōu)化效率高。異：

Plackett-Burman試驗就是篩選實驗設(shè)計，主要針對因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對于相應(yīng)變量的顯著性，采用的試驗方法。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化實驗條件尋優(yōu)的方法，它通過試驗設(shè)計、建模、檢驗?zāi)Ｐ偷暮线m性，尋求最佳組合條件的眾多試驗和統(tǒng)計技術(shù)。

響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!3.實驗材料與方法3.1菌種來源：香菇135，本實驗室分離保存（浙江慶元）3.2試劑：馬鈴薯購自農(nóng)貿(mào)市場，魚粉為浙江工業(yè)大學藥學院提供，其余所需的主要試劑均為分析純，3.3培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH自然，121℃滅菌30min。初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（%）：葡萄糖1.5，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O0.1。初始pH5.5，121℃滅菌30min。斜面菌種轉(zhuǎn)接至裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置回轉(zhuǎn)式搖床180r/min，25℃培養(yǎng)5d。然后將菌絲體無菌條件下打散制成種子懸液，以10%的接種量轉(zhuǎn)接入100mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床180r/min，25℃培養(yǎng)6d后結(jié)束。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!4.Plackett-Burman優(yōu)化培養(yǎng)基實驗設(shè)計4.1Plackett-Burman實驗篩選主要影響因子本實驗選用N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計，對葡萄糖（A）、魚粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、KH2PO4（G）和初始pH（H）8個因素進行考察，每個因素取高（+）低（-）兩個水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為總粗多糖產(chǎn)量（Y），實驗設(shè)計見表1，因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見表2。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!表2Plackett-Burman實驗分析結(jié)果由表可知，在香菇菌株135產(chǎn)多糖過程中葡萄糖、魚粉和KH2PO4這3個因素對多糖產(chǎn)量顯著，可考慮作為主要因素進一步做響應(yīng)面實驗。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!5.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成5.1Box-Benhnken實驗設(shè)計與分析：依據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡法實驗確定的因素與水平。采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基進行3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗。響應(yīng)面實驗中心點響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!5.2二次回歸模型擬合和方差分析利用系統(tǒng)軟件SAS8.0對表5實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，通過RESEG（響應(yīng)面回歸）過程進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平，得到回歸方程：Y=2.136667+0.44625X1+0.045X2-0.01375X3-0.44583X12-0.13833X22-0.09083X32-0.1175X1X2+0.015X1X3-0.0725X2X3響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!R2=0.9973，表明方程模型與實驗數(shù)據(jù)有99.73%的符合度，調(diào)整后的R2adj=0.9925，表明方程模型有很高的可信度。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!5.3培養(yǎng)基最適組合在獲得非線性回歸模型和響應(yīng)面之后，為了求得培養(yǎng)基最佳濃度，對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導數(shù)，并令其為得到三元一次方程組，求解此方程組可以得到最大多糖量時的最佳條件：X1=0.5066(2.2533%)，X2=-0.0488(0.9756%)，X3=0.0144(0.0993%)，Y=2.2487g/L。所以產(chǎn)多糖最高時的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2.2533%，魚粉0.9756%，VB10.003%，NaCl0.8%，MgSO4·7H2O0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O0.04%，KH2PO40.0993%，初始pH值5.5。響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基共20頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!6.結(jié)論該研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化，得出菌株產(chǎn)多糖的最佳培養(yǎng)基配方為：

葡萄糖2.2533%，魚粉0.9756%，VB10.003%，NaCl0.8%，MgSO4·7H2O0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O0.04%，KH2PO40.0993%，初始pH值5.5。在優(yōu)化條件下經(jīng)3批搖瓶培養(yǎng)實驗驗證，粗多糖產(chǎn)量均值為2.33g/L與預(yù)測值2.2487g/L誤差為+3.61%，與原始培養(yǎng)條件相比，多糖產(chǎn)量提高了1.91