昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)新版課件

昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)1（優(yōu)選）昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)（優(yōu)選）昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)2ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec3UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunctionUnrelatedproteinsassumesimi引言在人體的進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務(wù)：酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)或者核酸分子；抗體起到防護(hù)的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì):生物合成不需要消耗很多能量專一性很強(qiáng)不產(chǎn)生副作用并且能很快降解引言在人體的進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務(wù)5蛋白質(zhì)沒有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用，其原因:(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學(xué)方法生產(chǎn);(2)蛋白質(zhì)的功能是在生理?xiàng)l件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機(jī)溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專一性致使其應(yīng)用范圍受到影響。

蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的原因蛋白質(zhì)沒有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用，其原因:蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的6蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題7RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和無論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性異源專一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)抗DON單鏈抗體改體研究1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；10×TaqPCRBuffer5μL2．突變方法鑒定突變功能殘基計(jì)算機(jī)模擬突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析基因構(gòu)建Pr設(shè)計(jì)循環(huán)第一節(jié)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例計(jì)算機(jī)模8蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果分析與原先的結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的輸入蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白9Pr突變體設(shè)計(jì)的3個(gè)步驟利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的aa利用能量?jī)?yōu)化及動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的Pr結(jié)構(gòu)比較，利用Pr結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)新Pr可能具有的性質(zhì)Pr突變體設(shè)計(jì)的3個(gè)步驟利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換10英國劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分子上作了實(shí)驗(yàn)(人源化抗體)VL(3)專一性致使其應(yīng)用范圍受到影響。occursinthecytosol72℃40s，25個(gè)循環(huán)；制備感受態(tài)細(xì)胞無論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。同時(shí)利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以修正所選擇的氨基酸位點(diǎn)和突變后的氨基酸種類。把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。differentlength二是在三維結(jié)構(gòu)未知的情況下，借助一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)工作。（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.occursinthecytosol蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

英國劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分11在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)新版課件12

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。（內(nèi)部十分保守的區(qū)域）Pr內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體），沒有重疊蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白13所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個(gè)交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所取代疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成14金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對(duì)于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用。

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心15最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)結(jié)構(gòu)及功能的專一性。這是Pr設(shè)計(jì)最困難的問題

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理16一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類設(shè)計(jì)的目的主要有兩個(gè)：

一是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案和指導(dǎo)性信息，如以此提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類設(shè)計(jì)的目的主要有兩個(gè)：17二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理，如簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用力的類型及本質(zhì)的很好途徑，也為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。

二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理，如簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋18（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為兩個(gè)層次：一是在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)已知基礎(chǔ)上的分子設(shè)計(jì)；二是在三維結(jié)構(gòu)未知的情況下，借助一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)工作。（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為兩個(gè)層次：19（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類1．定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法2．拼接組裝設(shè)計(jì)法3．從頭設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類1．定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法20二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則1．活性設(shè)計(jì)2．對(duì)專一性的設(shè)計(jì)3．Scaffold設(shè)計(jì)(框架)4．疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則1．活性設(shè)計(jì)21白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)有兩類：利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)；我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受其氨基酸序列控制,而功能又與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。VH如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)生物合成不需要消耗很多能量Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)如果能夠找到構(gòu)造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構(gòu)和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)問題。依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。(A)β-sheetbarrel(紅色)（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。involveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.VH結(jié)構(gòu)骨架模板、分級(jí)迭代算法插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；異源專一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)溶菌酶結(jié)構(gòu)例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設(shè)計(jì)過程中，其中EFAEEAASF多肽能水解幾丁質(zhì)和葡聚糖，但糖苷酶活性較低。

Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和溶菌酶結(jié)構(gòu)例如:雞卵清22設(shè)計(jì)步驟蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)步驟圖修正設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)序列合成檢測(cè)結(jié)構(gòu)信息分析建立結(jié)構(gòu)模型設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)步驟蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)步驟圖修正設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)序列合成檢23序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)α螺旋時(shí)，應(yīng)選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設(shè)計(jì)全β結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)角時(shí)常選擇Pro-Asn殘基對(duì)。序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)α螺旋時(shí)，應(yīng)選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋24第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)有兩類：一是進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進(jìn)行蛋白質(zhì)分子裁剪拼接，即“中改”。

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子25一、定位突變

基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類。一、定位突變26（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法

定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法定位突變常見的27Hartley等于1986年完成了一個(gè)我們所要的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對(duì)氧化的穩(wěn)定性對(duì)重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團(tuán)，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)，改變酸堿度Hartley等于1986年完成了一個(gè)我們所要的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解28（二）定位突變的種類

要進(jìn)行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學(xué)合成、基因直接修飾法、盒式突變技術(shù)等。根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類：插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。（二）定位突變的種類要進(jìn)行基因定位突29（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型

可以通過X射線晶體學(xué)、二維核磁共振等測(cè)定結(jié)構(gòu)，也可以根據(jù)類似物的結(jié)構(gòu)或其他結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法建立起結(jié)構(gòu)模型。（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型302．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當(dāng)?shù)剡x擇突變殘基是一個(gè)關(guān)鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質(zhì)，同時(shí)還需要借助于已有的三維結(jié)構(gòu)或分子模型。2．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當(dāng)?shù)剡x擇313．預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)

根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)；同時(shí)利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以修正所選擇的氨基酸位點(diǎn)和突變后的氨基酸種類。3．預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)根據(jù)所選定的氨基324．構(gòu)建突變體，獲得突變體蛋白

依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。4．構(gòu)建突變體，獲得突變體蛋白332、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差<3aa本實(shí)驗(yàn)將能夠各自產(chǎn)生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達(dá)出能同時(shí)與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結(jié)合的雙特異性單鏈抗體。研究蛋白質(zhì)質(zhì)折疊規(guī)律的重要手段。蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設(shè)計(jì)74aaββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.12345678VLT1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)測(cè)定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對(duì)應(yīng)的天然蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)突變?cè)O(shè)計(jì)的效果，同時(shí)進(jìn)一步修正設(shè)計(jì)方案。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)測(cè)定新蛋白質(zhì)的34蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定蛋白質(zhì)中功能根據(jù)結(jié)構(gòu)信息利用蛋白質(zhì)同源性（四）蛋白質(zhì)中功能殘351．根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。1．根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變最有效最直接的方法362．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進(jìn)另外一種突變來檢測(cè)隨機(jī)突變技術(shù)刪除分析及連接片段掃描突變2．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進(jìn)另外一種突變來檢測(cè)373．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結(jié)構(gòu)有關(guān)。非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。探測(cè)突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。3．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白38（五）定位突變的應(yīng)用RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。（五）定位突變的應(yīng)用RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的39二、蛋白質(zhì)分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關(guān)的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個(gè)大小和形狀都非常相似的結(jié)構(gòu)域拼接構(gòu)成的，各結(jié)構(gòu)域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結(jié)構(gòu)域特征有利于它的細(xì)胞識(shí)別和粘合作用。二、蛋白質(zhì)分子拼接40而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。M12根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。Anti-DONgene改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識(shí)還不夠,所以蛋白質(zhì)全新二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)differentlength插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)實(shí)例能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。Anti-DONgene如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。VH和VL的PCR擴(kuò)增結(jié)果ββα型異源四聚體的設(shè)計(jì)歷程探測(cè)突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和英國劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分子上作了實(shí)驗(yàn)(人源化抗體)而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾41單鏈抗體scFv結(jié)構(gòu)（抗體工程)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素單鏈抗體scFv結(jié)構(gòu)（抗體工程)抗DON單鏈抗體改體研究DO42

單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL單鏈抗體的linker改造43

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥44

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ雙酶切EcoRIXhoⅠ雙酶切EcoRISalI雙酶切differentlength連接ＶＨＶＬ

技術(shù)路線EcoRILinkerXhoⅠSalⅠEcoRIEcoRIdi45轉(zhuǎn)化篩選、檢測(cè)

蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)生成

表達(dá)載體構(gòu)建

感受態(tài)細(xì)胞的制備純化親和力初步測(cè)定轉(zhuǎn)化篩選、檢測(cè)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)生成表達(dá)載體構(gòu)建感受態(tài)細(xì)46PCR擴(kuò)增重鏈、輕鏈策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2PCR擴(kuò)增重鏈、輕鏈策略47PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件50L反應(yīng)體系如下：10×TaqPCRBuffer5μLdNTP(2.5mM)3μLForwardPrimer(20mM)1μLReversePrimer(20mM)1μLTemple1μLrTaq0.3μL

AddddH2Otoafinalvolumeof50μLPCR循環(huán)條件為：94℃5min，1個(gè)循環(huán)；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃40s，25個(gè)循環(huán)；72℃7min，1個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5μL，1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件50L反應(yīng)體系如下：

48VH

和VL的PCR擴(kuò)增結(jié)果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000VH和VL的PCR擴(kuò)增結(jié)果１２３４５９６７８7500149

菌落PCR重組子驗(yàn)證123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100菌落PCR重組子驗(yàn)證150

改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化151

改體抗體的ELISA初步測(cè)定312456789101112改體抗體的ELISA初步測(cè)定3124567891011152在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型XhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法Temple1μL（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類。T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和AlanFersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇AddddH2Otoafinalvolumeof50μLTemple1μL能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。<3aa如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)PCR擴(kuò)增Anti-DON基因單鏈抗體抗體：是體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子。由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）組成。雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建與表達(dá)在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及53單鏈抗體（scFv）：抗體可變區(qū)的重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段約15-25個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽（Linker）相連，融合表達(dá)出來的抗體片斷。

單鏈抗體（scFv）：54雙特異性單鏈抗體能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。本實(shí)驗(yàn)將能夠各自產(chǎn)生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達(dá)出能同時(shí)與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結(jié)合的雙特異性單鏈抗體。玉米赤霉烯酮(ZEN)雙特異性單鏈抗體玉米赤霉烯酮(ZEN)55技術(shù)路線

DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增目的片段

制備感受態(tài)細(xì)胞

酶切目的片段、載體，linker連接

轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物

酶切驗(yàn)證重組子

表達(dá)、純化蛋白技術(shù)路線DON和ZEN抗體基因的提取目的基因56載體的構(gòu)建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ連接

Linker載體的構(gòu)建Anti-ZENgeneAnti-DONgen57PCR擴(kuò)增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500PCR擴(kuò)增Anti-DON基因158PCR擴(kuò)增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bpPCR擴(kuò)增Anti-ZEN基因M59重組驗(yàn)證重組驗(yàn)證60PCR驗(yàn)證以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行Anti-DON基因的PCR分析。PCR驗(yàn)證以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行Anti-DON基因的PCR61取PCR產(chǎn)物5μL，1.AlanFersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。與數(shù)目達(dá)到最大；一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法穩(wěn)定相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)新Pr可能具有的性質(zhì)（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)3、評(píng)價(jià)：使用特定的評(píng)分系統(tǒng)將構(gòu)建的分子與活性位點(diǎn)的匹配性進(jìn)行排序，可以選擇其中優(yōu)良的結(jié)果作為合成實(shí)驗(yàn)的對(duì)象。Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。VL最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。酶切目的片段、載體，linker連接ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線結(jié)構(gòu)(Alietal.最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化如果能夠找到構(gòu)造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構(gòu)和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)問題。如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次雙特異性抗體的表達(dá)取PCR產(chǎn)物5μL，1.雙特異性抗體的表達(dá)62

我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受其氨基酸序列控制,而功能又與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

如果能夠找到構(gòu)造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構(gòu)和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)問題。第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受其氨基酸序列控制,63

蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)概念

從頭設(shè)計(jì)能夠根據(jù)生物分子的活性位點(diǎn)特征產(chǎn)生一系列的結(jié)構(gòu)片段，通過連接這些結(jié)構(gòu)片段可以構(gòu)成一個(gè)全新分子；或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。

從頭設(shè)計(jì)方法可以生成全新的分子結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)概念從頭設(shè)計(jì)能夠根據(jù)生物分子的活64全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括

一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括

65

全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)過程設(shè)計(jì)目標(biāo)序列生成結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)合成構(gòu)建模型檢測(cè)設(shè)計(jì)目標(biāo)序列生成結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)合成構(gòu)建模型檢測(cè)66（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序模擬分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序模擬分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一、全新蛋白67（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇依據(jù)設(shè)計(jì)的目的可以分為：從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)從頭功能設(shè)計(jì)（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇依據(jù)設(shè)計(jì)的目的可以分為：68從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

中心問題：穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)序列；基本障礙：線性聚合構(gòu)象熵；解決方法：（1）使相互作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)到最大；（2）共價(jià)交叉連接。從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

中心問題：穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)69從頭設(shè)計(jì)方法包含的步驟1、活性位點(diǎn)分析：對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的具體的化學(xué)信息進(jìn)行掃描、分析和歸類。這些信息的三維空間相互關(guān)系都必須充分考慮。

2、配體分子構(gòu)建：采用不同的片段選擇和分子構(gòu)建方法，產(chǎn)生相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)。

3、評(píng)價(jià)：使用特定的評(píng)分系統(tǒng)將構(gòu)建的分子與活性位點(diǎn)的匹配性進(jìn)行排序，可以選擇其中優(yōu)良的結(jié)果作為合成實(shí)驗(yàn)的對(duì)象。也可以將之做新一輪計(jì)算的起點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。從頭設(shè)計(jì)方法包含的步驟1、活性位點(diǎn)分析：對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的具體的化70二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)（一）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)原則1．二級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則α螺旋β折疊片轉(zhuǎn)角2．超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)（一）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)原則71(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學(xué)方法生產(chǎn);Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)實(shí)例根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類：非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的aa穩(wěn)定相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)新Pr可能具有的性質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則AddddH2Otoafinalvolumeof50μL,1996,1998)；把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或TyrVLGGGGSGGGGSGG進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。利用能量?jī)?yōu)化及動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)VLVLVL生物合成不需要消耗很多能量或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)72β折疊片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa)β折疊片(HPHPH或PHPHP，5-10aa)73轉(zhuǎn)角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）

轉(zhuǎn)角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）74蛋白質(zhì)的幾種超二級(jí)結(jié)構(gòu)

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β蛋白質(zhì)的幾種超二級(jí)結(jié)構(gòu)

αα、ββ、β-α-β、β75從頭設(shè)計(jì)的三股式β折疊

從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)實(shí)例結(jié)構(gòu)骨架模板、分級(jí)迭代算法從頭設(shè)計(jì)的三股式β折疊從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β76ββα型異源四聚體的設(shè)計(jì)歷程結(jié)構(gòu)域替換寡聚化策略

異源專一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)23個(gè)氨基酸自動(dòng)折疊成的鋅指結(jié)構(gòu)（ββα5）的核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)(Struthersetal.,1996,1998)；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.,2004)；ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線結(jié)構(gòu)(Alietal.,2005).ββα型異源四聚體的設(shè)計(jì)歷程結(jié)構(gòu)域替換異源專77α/β-筒狀蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)(Offredi1,etal.2003)(A)β-sheetbarrel(紅色)(B)四周環(huán)繞α-helixbarrel(藍(lán)色)(C)二者由簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)域αβ1、αβ3和βABα（灰色）連接(D)全新α/β-筒狀蛋白質(zhì)。α/β-筒狀蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)(Offredi1,etal7874aaDegrado設(shè)計(jì)四螺旋束74aaDegrado設(shè)計(jì)四螺旋束79四螺旋束四螺旋束80舉例Hodges設(shè)計(jì)（周期性重復(fù)七肽）23

coiled-coil疏水性aa舉例疏水性aa81coiled-coil

from:coiled-coil

from:82二級(jí)模塊單元的自組裝最簡(jiǎn)單、最直接的策略—合成單一二級(jí)結(jié)構(gòu)單元優(yōu)點(diǎn)無論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；容易合成。缺點(diǎn)涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)。二級(jí)模塊單元的自組裝最簡(jiǎn)單、最直接的策略—合成單一二級(jí)結(jié)構(gòu)單83測(cè)定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等，VH結(jié)果分析與原先的結(jié)構(gòu)比較3-12aa2．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.AddddH2Otoafinalvolumeof50μL蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；對(duì)于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì):進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差10×TaqPCRBuffer5μL或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。制備感受態(tài)細(xì)胞T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的現(xiàn)狀和前景

現(xiàn)狀

蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到自然界不存在的具有全新結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和研究蛋白質(zhì)質(zhì)折疊規(guī)律的重要手段。由于我們對(duì)蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的理論基礎(chǔ)即蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識(shí)還不夠,所以蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)還處在探索階段。測(cè)定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等，蛋白質(zhì)全新84前景

隨著新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的速度和效率必將得到極大的提高。如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)中必然能夠大大地縮短設(shè)計(jì)的周期,并將徹底改變蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的面貌。前景隨著新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)全85昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)86（優(yōu)選）昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)（優(yōu)選）昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)87ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec88UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunctionUnrelatedproteinsassumesimi引言在人體的進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務(wù)：酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)或者核酸分子；抗體起到防護(hù)的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì):生物合成不需要消耗很多能量專一性很強(qiáng)不產(chǎn)生副作用并且能很快降解引言在人體的進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務(wù)90蛋白質(zhì)沒有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用，其原因:(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學(xué)方法生產(chǎn);(2)蛋白質(zhì)的功能是在生理?xiàng)l件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機(jī)溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專一性致使其應(yīng)用范圍受到影響。

蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的原因蛋白質(zhì)沒有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用，其原因:蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的91蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題92RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和無論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性異源專一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)抗DON單鏈抗體改體研究1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；10×TaqPCRBuffer5μL2．突變方法鑒定突變功能殘基計(jì)算機(jī)模擬突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析基因構(gòu)建Pr設(shè)計(jì)循環(huán)第一節(jié)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例計(jì)算機(jī)模93蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果分析與原先的結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的輸入蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白94Pr突變體設(shè)計(jì)的3個(gè)步驟利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的aa利用能量?jī)?yōu)化及動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的Pr結(jié)構(gòu)比較，利用Pr結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)新Pr可能具有的性質(zhì)Pr突變體設(shè)計(jì)的3個(gè)步驟利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換95英國劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分子上作了實(shí)驗(yàn)(人源化抗體)VL(3)專一性致使其應(yīng)用范圍受到影響。occursinthecytosol72℃40s，25個(gè)循環(huán)；制備感受態(tài)細(xì)胞無論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。同時(shí)利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以修正所選擇的氨基酸位點(diǎn)和突變后的氨基酸種類。把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。differentlength二是在三維結(jié)構(gòu)未知的情況下，借助一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)工作。（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.occursinthecytosol蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

英國劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分96在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設(shè)計(jì)新版課件97

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。（內(nèi)部十分保守的區(qū)域）Pr內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體），沒有重疊蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白98所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個(gè)交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所取代疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成99金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對(duì)于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用。

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心100最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)結(jié)構(gòu)及功能的專一性。這是Pr設(shè)計(jì)最困難的問題

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理101一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類設(shè)計(jì)的目的主要有兩個(gè)：

一是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案和指導(dǎo)性信息，如以此提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類設(shè)計(jì)的目的主要有兩個(gè)：102二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理，如簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用力的類型及本質(zhì)的很好途徑，也為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。

二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理，如簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋103（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為兩個(gè)層次：一是在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)已知基礎(chǔ)上的分子設(shè)計(jì)；二是在三維結(jié)構(gòu)未知的情況下，借助一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)工作。（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為兩個(gè)層次：104（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類1．定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法2．拼接組裝設(shè)計(jì)法3．從頭設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類1．定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法105二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則1．活性設(shè)計(jì)2．對(duì)專一性的設(shè)計(jì)3．Scaffold設(shè)計(jì)(框架)4．疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則1．活性設(shè)計(jì)106白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)有兩類：利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)；我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受其氨基酸序列控制,而功能又與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。VH如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)生物合成不需要消耗很多能量Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)如果能夠找到構(gòu)造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構(gòu)和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)問題。依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。(A)β-sheetbarrel(紅色)（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。involveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.VH結(jié)構(gòu)骨架模板、分級(jí)迭代算法插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；異源專一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)溶菌酶結(jié)構(gòu)例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設(shè)計(jì)過程中，其中EFAEEAASF多肽能水解幾丁質(zhì)和葡聚糖，但糖苷酶活性較低。

Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和溶菌酶結(jié)構(gòu)例如:雞卵清107設(shè)計(jì)步驟蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)步驟圖修正設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)序列合成檢測(cè)結(jié)構(gòu)信息分析建立結(jié)構(gòu)模型設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)步驟蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)步驟圖修正設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)序列合成檢108序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)α螺旋時(shí)，應(yīng)選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設(shè)計(jì)全β結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)角時(shí)常選擇Pro-Asn殘基對(duì)。序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)α螺旋時(shí)，應(yīng)選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋109第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)有兩類：一是進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進(jìn)行蛋白質(zhì)分子裁剪拼接，即“中改”。

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子110一、定位突變

基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類。一、定位突變111（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法

定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法定位突變常見的112Hartley等于1986年完成了一個(gè)我們所要的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對(duì)氧化的穩(wěn)定性對(duì)重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團(tuán)，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)，改變酸堿度Hartley等于1986年完成了一個(gè)我們所要的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解113（二）定位突變的種類

要進(jìn)行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學(xué)合成、基因直接修飾法、盒式突變技術(shù)等。根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類：插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。（二）定位突變的種類要進(jìn)行基因定位突114（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型

可以通過X射線晶體學(xué)、二維核磁共振等測(cè)定結(jié)構(gòu)，也可以根據(jù)類似物的結(jié)構(gòu)或其他結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法建立起結(jié)構(gòu)模型。（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型1152．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當(dāng)?shù)剡x擇突變殘基是一個(gè)關(guān)鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質(zhì)，同時(shí)還需要借助于已有的三維結(jié)構(gòu)或分子模型。2．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當(dāng)?shù)剡x擇1163．預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)

根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)；同時(shí)利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以修正所選擇的氨基酸位點(diǎn)和突變后的氨基酸種類。3．預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)根據(jù)所選定的氨基1174．構(gòu)建突變體，獲得突變體蛋白

依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。4．構(gòu)建突變體，獲得突變體蛋白1182、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差<3aa本實(shí)驗(yàn)將能夠各自產(chǎn)生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達(dá)出能同時(shí)與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結(jié)合的雙特異性單鏈抗體。研究蛋白質(zhì)質(zhì)折疊規(guī)律的重要手段。蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到定位突變常見的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設(shè)計(jì)74aaββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結(jié)構(gòu)（Alietal.12345678VLT1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)測(cè)定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對(duì)應(yīng)的天然蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)突變?cè)O(shè)計(jì)的效果，同時(shí)進(jìn)一步修正設(shè)計(jì)方案。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)測(cè)定新蛋白質(zhì)的119蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定蛋白質(zhì)中功能根據(jù)結(jié)構(gòu)信息利用蛋白質(zhì)同源性（四）蛋白質(zhì)中功能殘1201．根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。1．根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變最有效最直接的方法1212．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進(jìn)另外一種突變來檢測(cè)隨機(jī)突變技術(shù)刪除分析及連接片段掃描突變2．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進(jìn)另外一種突變來檢測(cè)1223．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結(jié)構(gòu)有關(guān)。非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。探測(cè)突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。3．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白123（五）定位突變的應(yīng)用RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例T1核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。（五）定位突變的應(yīng)用RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的124二、蛋白質(zhì)分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關(guān)的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個(gè)大小和形狀都非常相似的結(jié)構(gòu)域拼接構(gòu)成的，各結(jié)構(gòu)域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結(jié)構(gòu)域特征有利于它的細(xì)胞識(shí)別和粘合作用。二、蛋白質(zhì)分子拼接125而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。M12根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。Anti-DONgene改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識(shí)還不夠,所以蛋白質(zhì)全新二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)differentlength插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)實(shí)例能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱為雙特異性單鏈抗體。Anti-DONgene如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。VH和VL的PCR擴(kuò)增結(jié)果ββα