(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)

實驗四、臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)實驗四、臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)1當(dāng)前，新發(fā)動物疫病不斷發(fā)生，老病出現(xiàn)新癥狀，多重復(fù)合感染，動物疫病日趨復(fù)雜。研制快速、準確、廉價的診斷試劑是動物疫病防制的迫切需求。在動物傳染病的預(yù)防與控制中，疾病的診斷，病原學(xué)與流行病學(xué)調(diào)查與研究非常重要，但這都需要簡便快速、敏感特異的診斷方法與試劑盒。新型診斷試劑的研究當(dāng)前，新發(fā)動物疫病不斷發(fā)生，老病出現(xiàn)新癥狀，多重復(fù)合感染，動2快速檢測方法抗原檢測方法抗體檢測方法乳膠凝集試驗（LAT)膠體金試紙條酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)乳膠凝集試驗（LAT)膠體金試紙條酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)常規(guī)診斷LAT鑒別診斷LAT常規(guī)診斷ELISA鑒別診斷ELISA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）快速檢測方法抗原檢測方法抗體檢測方法乳膠凝集試驗（LAT)膠3(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)4(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)5膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl46質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱角。質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。膠體金的質(zhì)量判定標準質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱7膠體金標記技術(shù)（Immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為示蹤標記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金標記的原理：膠體金在堿性條件下帶負電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團藉靜電吸引而形成牢固結(jié)合。膠體金標記技術(shù)（Immunogoldlabelingte8（二）膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體。最常用的是雙抗夾心法檢測抗原（二）膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理以硝酸纖維素膜為載體，利9試驗所用試劑全部為干試劑，主要有：

1.免疫金復(fù)合物干片2.特異抗體3.抗小鼠IgG膠體金標記的單克隆抗體（小鼠IgG）試驗所用試劑全部為干試劑，主要有：1.免疫金復(fù)合物干片210多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條：A和B：硝酸纖維素膜條的上端和下端C：免疫金復(fù)合物干片，緊貼硝酸纖維素膜條T：包被特異抗體的測試區(qū)R：包被抗小鼠IgG的參照區(qū)

多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單111.測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。測定1.測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體122.若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T）。測定2.若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，13測定3.過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質(zhì)控線條（R）。測定3.過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠14測定4.反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。測定4.反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。15樣品墊連接墊層析模檢測線對照線吸水墊背襯膠體金試紙條構(gòu)成示意圖樣品墊膠體金試紙條構(gòu)成示意圖16檢測線質(zhì)檢線金標顆粒吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜膠體金試紙條示意圖檢測線質(zhì)檢線金標顆粒吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜膠體金試紙條示意17膠體金快速診斷技術(shù)的特點

1.簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。2.結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。3.特異性好：因為該技術(shù)大多用于單克隆抗體標記，這決定了它具有很好的特異性。膠體金快速診斷技術(shù)的特點1.簡捷快速：操作簡單，一般只要5181.病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、豬瘟等。2.寄生蟲疾病：血吸蟲病、旋毛蟲病、囊蟲病、恙蟲病。3.細菌性疾?。夯魜y弧菌、類鼻疽。膠體金快速診斷技術(shù)的應(yīng)用1.病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、19（三）實驗材料1.流感膠體金試紙條試劑盒2.槍頭3.被檢樣品4.移液器（三）實驗材料1.流感膠體金試紙條試劑盒20（四）操作方法1.用移液器吸取被檢樣品20μl，滴在試紙條的加樣孔中。2.靜置5－10分鐘。3.觀察反應(yīng)結(jié)果。（四）操作方法1.用移液器吸取被檢樣品20μl，滴在試紙條的21陽性結(jié)果陰性對照（五）結(jié)果判定陽性結(jié)果陰性對照（五）結(jié)果判定22二、乳膠凝集試驗

Latexagglutinationtest，LAT二、乳膠凝集試驗

Latexagglutination23一、實驗?zāi)康亩嶒炘砣?、實驗材料四、操作步驟五、實驗注意事項六、實驗結(jié)果處理乳膠凝集試驗一、實驗?zāi)康娜槟z凝集試驗24（一）實驗?zāi)康?.了解并掌握乳膠凝集試驗的基本原理。2.掌握乳膠凝集試驗檢測細小病毒抗體快速檢測方法的操作方法和結(jié)果判定方法。（一）實驗?zāi)康?.了解并掌握乳膠凝集試驗的基本原理。25（二）基本原理

乳膠凝集試驗是以聚苯乙烯乳膠顆粒作為載體，吸附特定的抗原或抗體，當(dāng)遇到血清中相應(yīng)的抗體或處理過的病料中相應(yīng)的抗原成份時，會形成肉眼可見的凝集顆粒。（二）基本原理乳膠凝集試驗是以聚苯乙烯乳膠顆粒作為載體26(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)271.普通乳膠：依靠物理吸附發(fā)生致敏。2.羧化乳膠：通過化學(xué)發(fā)應(yīng)在乳膠顆粒和致敏原之間形成酰氨鍵，發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)致敏乳膠，從而更穩(wěn)定。3.雙色乳膠：緩沖液和乳膠顆粒為不同的顏色，結(jié)果更易于觀察。乳膠類型1.普通乳膠：依靠物理吸附發(fā)生致敏。乳膠類型28（三）實驗材料1.潔凈玻片2.槍頭3.細小病毒致敏乳膠4.細小病毒病陽性、陰性或臨床待檢血清（三）實驗材料1.潔凈玻片29（四）操作方法1.在一潔凈的玻片的不同位置滴加3滴致敏乳膠（每滴約20μl）。2.用移液器分別取20μl的待檢血清，滴加到上述3滴致敏乳膠中，并用槍頭混勻。3.輕輕搖晃玻片，使抗原和血清充分混勻，靜置1-2分鐘，觀察結(jié)果。（四）操作方法1.在一潔凈的玻片的不同位置滴加3滴致敏乳膠（30（五）實驗注意事項1.取不同試劑時應(yīng)注意更換槍頭，防止交叉污染。2.混勻過程中，避免陽性對照、陰性對照和被檢樣品之間的交叉污染。（五）實驗注意事項1.取不同試劑時應(yīng)注意更換槍頭，防止交叉污31乳膠凝集的陰性和陽性反應(yīng)（六）結(jié)果判定乳膠凝集的陰性和陽性反應(yīng)（六）結(jié)果判定32判定標準++++為全部乳膠凝集，顆粒聚集于液滴邊緣，液體透明；+++為大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；++為50％乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁；+有極少量的凝集，液體呈混濁；-呈原有的均勻乳狀。

判定標準++++為全部乳膠凝集，顆粒聚集于液滴邊緣33致敏乳膠試劑與被檢血清樣品檢測結(jié)果致敏乳膠試劑++++++++++-++++++++-++++++++++++—空白乳膠試劑致敏乳膠試劑與被檢血清樣品檢測結(jié)果致敏乳膠試劑++34乳膠凝集試驗的特點1.操作簡捷，結(jié)果易于判定；2.敏感性較低；3.致敏乳膠的穩(wěn)定性低，保存期短。乳膠凝集試驗的特點1.操作簡捷，結(jié)果易于判定；35乳膠凝集試驗的應(yīng)用1.病毒性疾病：偽狂犬病毒抗體，細小病毒抗體、乙型腦炎病毒抗體，禽流感病毒和抗體，傳染性法氏囊病毒血清抗體，鴨呼腸孤病毒；2.寄生蟲疾病：弓形蟲等；3.細菌性疾病：豬萎縮性鼻炎抗體等。乳膠凝集試驗的應(yīng)用1.病毒性疾?。簜慰袢《究贵w，細小病毒抗36(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)37(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)38(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)39實驗報告撰寫要求實驗內(nèi)容實驗?zāi)康幕驹韺嶒灢牧虾喪霾僮鬟^程結(jié)果判定總結(jié)分析實驗報告撰寫要求實驗內(nèi)容40謝謝!謝謝!41實驗四、臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)實驗四、臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)42當(dāng)前，新發(fā)動物疫病不斷發(fā)生，老病出現(xiàn)新癥狀，多重復(fù)合感染，動物疫病日趨復(fù)雜。研制快速、準確、廉價的診斷試劑是動物疫病防制的迫切需求。在動物傳染病的預(yù)防與控制中，疾病的診斷，病原學(xué)與流行病學(xué)調(diào)查與研究非常重要，但這都需要簡便快速、敏感特異的診斷方法與試劑盒。新型診斷試劑的研究當(dāng)前，新發(fā)動物疫病不斷發(fā)生，老病出現(xiàn)新癥狀，多重復(fù)合感染，動43快速檢測方法抗原檢測方法抗體檢測方法乳膠凝集試驗（LAT)膠體金試紙條酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)乳膠凝集試驗（LAT)膠體金試紙條酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)常規(guī)診斷LAT鑒別診斷LAT常規(guī)診斷ELISA鑒別診斷ELISA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）快速檢測方法抗原檢測方法抗體檢測方法乳膠凝集試驗（LAT)膠44(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)45(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)46膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl447質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱角。質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。膠體金的質(zhì)量判定標準質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱48膠體金標記技術(shù)（Immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為示蹤標記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金標記的原理：膠體金在堿性條件下帶負電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團藉靜電吸引而形成牢固結(jié)合。膠體金標記技術(shù)（Immunogoldlabelingte49（二）膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體。最常用的是雙抗夾心法檢測抗原（二）膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理以硝酸纖維素膜為載體，利50試驗所用試劑全部為干試劑，主要有：

1.免疫金復(fù)合物干片2.特異抗體3.抗小鼠IgG膠體金標記的單克隆抗體（小鼠IgG）試驗所用試劑全部為干試劑，主要有：1.免疫金復(fù)合物干片251多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條：A和B：硝酸纖維素膜條的上端和下端C：免疫金復(fù)合物干片，緊貼硝酸纖維素膜條T：包被特異抗體的測試區(qū)R：包被抗小鼠IgG的參照區(qū)

多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單521.測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。測定1.測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體532.若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T）。測定2.若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，54測定3.過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質(zhì)控線條（R）。測定3.過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠55測定4.反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。測定4.反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。56樣品墊連接墊層析模檢測線對照線吸水墊背襯膠體金試紙條構(gòu)成示意圖樣品墊膠體金試紙條構(gòu)成示意圖57檢測線質(zhì)檢線金標顆粒吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜膠體金試紙條示意圖檢測線質(zhì)檢線金標顆粒吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜膠體金試紙條示意58膠體金快速診斷技術(shù)的特點

1.簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。2.結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。3.特異性好：因為該技術(shù)大多用于單克隆抗體標記，這決定了它具有很好的特異性。膠體金快速診斷技術(shù)的特點1.簡捷快速：操作簡單，一般只要5591.病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、豬瘟等。2.寄生蟲疾?。貉x病、旋毛蟲病、囊蟲病、恙蟲病。3.細菌性疾?。夯魜y弧菌、類鼻疽。膠體金快速診斷技術(shù)的應(yīng)用1.病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、60（三）實驗材料1.流感膠體金試紙條試劑盒2.槍頭3.被檢樣品4.移液器（三）實驗材料1.流感膠體金試紙條試劑盒61（四）操作方法1.用移液器吸取被檢樣品20μl，滴在試紙條的加樣孔中。2.靜置5－10分鐘。3.觀察反應(yīng)結(jié)果。（四）操作方法1.用移液器吸取被檢樣品20μl，滴在試紙條的62陽性結(jié)果陰性對照（五）結(jié)果判定陽性結(jié)果陰性對照（五）結(jié)果判定63二、乳膠凝集試驗

Latexagglutinationtest，LAT二、乳膠凝集試驗

Latexagglutination64一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理三、實驗材料四、操作步驟五、實驗注意事項六、實驗結(jié)果處理乳膠凝集試驗一、實驗?zāi)康娜槟z凝集試驗65（一）實驗?zāi)康?.了解并掌握乳膠凝集試驗的基本原理。2.掌握乳膠凝集試驗檢測細小病毒抗體快速檢測方法的操作方法和結(jié)果判定方法。（一）實驗?zāi)康?.了解并掌握乳膠凝集試驗的基本原理。66（二）基本原理

乳膠凝集試驗是以聚苯乙烯乳膠顆粒作為載體，吸附特定的抗原或抗體，當(dāng)遇到血清中相應(yīng)的抗體或處理過的病料中相應(yīng)的抗原成份時，會形成肉眼可見的凝集顆粒。（二）基本原理乳膠凝集試驗是以聚苯乙烯乳膠顆粒作為載體67(動物傳染病學(xué)實驗課件)5-臨床血清學(xué)快速檢測技術(shù)681.普通乳膠：依靠物理吸附發(fā)生致敏。2.羧化乳膠：通過化學(xué)發(fā)應(yīng)在乳膠顆粒和致敏原之間形成酰氨鍵，發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)致敏乳膠，從而更穩(wěn)定。3.雙色乳膠：緩沖液和乳膠顆粒為不同的顏色，結(jié)果更易于觀察。乳膠類型1.普通乳膠：依靠物理吸附發(fā)生致敏。乳膠類型69（三）實驗材料1.潔凈玻片2.槍頭3.細小病毒致敏乳膠4.細小病毒病陽性、陰性或臨床待檢血清（三）實驗材料1.潔凈玻片70（四）操作方法1.在一潔凈的玻片的不同位置滴加3滴致敏乳膠（每滴約20μl）。2.用移液器分別取20μl的待檢血清，滴加到上述3滴致敏乳膠中，并用槍頭混勻。3.輕輕搖晃玻片，使抗原和血清充分混勻，靜置1-2分鐘，觀察結(jié)果。（四）操作方法1.在一潔凈的玻片的不同位置滴加3滴致敏乳膠（71（五）實驗注意事項1.取不同試劑時應(yīng)注意更換槍頭，防止交叉污染。2.混勻過程中，避免陽性對照、陰性對照和被檢樣品之間的交叉污染。（五）實驗注意事項1.取不同試劑時應(yīng)注意更換槍頭，防止