第五章：(酶工程) 酶分子修飾課件

第五章酶分子修飾酶的活性中心酶化學(xué)修飾的目的酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用第五章酶分子修飾1第一節(jié)酶的活性中心（activesite）

一、活性中心的概念由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域.

第一節(jié)酶的活性中心（activesite）2第五章：(酶工程)酶分子修飾課件3二、活性中心的共性

(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。(4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)酶與底物通過(guò)鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合。二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（14第五章：(酶工程)酶分子修飾課件5第五章：(酶工程)酶分子修飾課件6第五章：(酶工程)酶分子修飾課件7ActivesiteTheactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.Theactivesiteisathree-dimensionalentity,oftenacleft

orcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.Activesite8三、研究酶活性中心的方法

1.物理學(xué)方法：用X射線衍射法直接檢測(cè)底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對(duì)位置。三、研究酶活性中心的方法92.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為

1)非專一性化學(xué)修飾

用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若某基團(tuán)被修飾后：酶活性不變——該基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)酶活性降低或喪失——該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。2.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為10活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)①失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。②S或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）。活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)11差別標(biāo)記：底物或抑制劑存在活性基團(tuán)不與修飾劑作用去除底物或抑制劑原來(lái)被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)?；瘜W(xué)修飾含同位素標(biāo)記的同樣試劑差別標(biāo)記：化學(xué)修飾含同位素標(biāo)記的同樣試劑122)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）

用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。作用機(jī)制：利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）13化學(xué)修飾的專一性化學(xué)修飾的專一性14親和修飾劑：

①與S結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基親和力大，而與活性中心以外的氨基酸殘基親和力小。②具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。親和修飾劑：153.蛋白質(zhì)工程：（定點(diǎn)誘變法）將酶相應(yīng)的cDNA定點(diǎn)突變，突變的cDNA只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。3.蛋白質(zhì)工程：（定點(diǎn)誘變法）16第二節(jié)酶化學(xué)修飾及修飾目的一、酶化學(xué)修飾

1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因： 1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 2)酶活性不夠高； 3)具有抗原性。

第二節(jié)酶化學(xué)修飾及修飾目的172.改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。2.改變酶特性有兩種主要的方法：18二、酶化學(xué)修飾的目的（一）研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（二）人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。

二、酶化學(xué)修飾的目的191.修飾酶的熱穩(wěn)定性1.修飾酶的熱穩(wěn)定性20

2.修飾酶的抗原性2.修飾酶的抗原性213.修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力

3.修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力

224.修飾酶在體內(nèi)的半衰期

4.修飾酶在體內(nèi)的半衰期

235.最適pH

5.最適pH

246.Km的變化

6.Km的變化

25

第三節(jié)酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第三節(jié)酶化學(xué)修飾的原理26三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶27四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境28

第四節(jié)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)

一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性包括酶的——1.活性部位情況2.穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件3.側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性第四節(jié)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)29二、修飾劑的選擇要考慮——

1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量）2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)）3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件二、修飾劑的選擇要考慮——30三、反應(yīng)條件的選擇要注意——1.酶與修飾劑的分子比例2.反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件3.反應(yīng)溫度及時(shí)間三、反應(yīng)條件的選擇要注意——31第五節(jié)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用

一、酶的表面化學(xué)修飾（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。第五節(jié)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用322.修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化(P157），然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。2.修飾劑：333.應(yīng)用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）

延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期（P160表5-1）又如：PEG－天冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性提高酶活3.應(yīng)用：34（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）35幾種重要的修飾反應(yīng)類型：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)幾種重要的修飾反應(yīng)類型：361.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。1.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型1)烷基化反應(yīng)37烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)38

2)酰基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：含有

結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；??？勺饔没鶊F(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）2)酰基化反應(yīng)39?；磻?yīng)

?；磻?yīng)403)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺還原劑：巰基乙醇、DTT（二硫蘇糖醇）等?？杀谎趸膫?cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。3)氧化和還原反應(yīng)41連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。424)芳香環(huán)取代反應(yīng)

試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋+HI硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）4)芳香環(huán)取代反應(yīng)（四硝基甲烷）432.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1)氨基的化學(xué)修飾：來(lái)源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化酰基化修飾劑:

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾44第五章：(酶工程)酶分子修飾課件45

2)羧基的化學(xué)修飾常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

碳化二亞胺酶-碳二亞胺衍生物

463)胍基的化學(xué)修飾來(lái)源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基?；Ｐ揎梽?/p>

丁二酮二羰基化合物1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛3)胍基的化學(xué)修飾47第五章：(酶工程)酶分子修飾課件484)巰基的化學(xué)修飾來(lái)源：Cys修飾反應(yīng):烷基化

修飾劑：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）E－SH＋

修飾酶（300nm)4)巰基的化學(xué)修飾修飾酶（300nm)495)二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）5)二硫鍵的化學(xué)修飾50氧化：過(guò)甲酸:Performicacid氧化：過(guò)甲酸:Performicacid51

6)咪唑基的化學(xué)修飾

來(lái)源：His修飾反應(yīng):?；c烷基化

酰基化修飾劑:常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）++C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH+HI修飾酶（240nm)6)咪唑基的化學(xué)修飾修飾酶（240nm)527）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）（高度專一的對(duì)酚羥基修飾）7）酚羥基的化學(xué)修飾（高度專一的對(duì)酚羥基修飾）538）吲哚基的化學(xué)修飾來(lái)源：Trp修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺（NBS)8）吲哚基的化學(xué)修飾54氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷T(mén)rp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟55（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）56二、酶分子內(nèi)部修飾

（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）

利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾通常采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。

二、酶分子內(nèi)部修飾

（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）57

酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：58應(yīng)用實(shí)例：1）酶原激活a、胃蛋白酶原的激活應(yīng)用實(shí)例：59第五章：(酶工程)酶分子修飾課件60b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活61c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活622）提高酶活力：

天冬氨酸酶通過(guò)胰蛋白酶修飾。從羧基端切除10個(gè)氨基酸殘基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5倍左右。3）消除抗原性：（抗原性還與分子大小有關(guān)）

木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，除去其肽鏈的2/3，該酶的活力基本保持。其抗原性卻大大降低。第五章：(酶工程)酶分子修飾課件63（二）氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。（二）氨基酸置換修飾64酶分子的定點(diǎn)突變1、新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)2、突變基因堿基序列的確定3、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變4、酶基因克隆表達(dá)5、變異特性分析酶分子的定點(diǎn)突變1、新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)65（三）金屬離子置換修飾

改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。（三）金屬離子置換修飾66常用金屬離子（往往是二價(jià)離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。方法步驟：酶的分離純化－向酶液加入一定量的EDTA－將酶與金屬螯合物分離－金屬離子置換。舉例：α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過(guò)程中添加一定量的鈣離子。常用金屬離子（往往是二價(jià)離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+67（四）核苷酸鏈剪切修飾在核苷酸鏈的特定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的特性和功能的方法。RNA核酸類酶除去一部分核苷酸殘基（無(wú)催化活性）（四）核苷酸鏈剪切修飾核酸類酶除去一部分核苷酸殘基（無(wú)催化活685’GAG3’G-IVS(414nt)(15nt)GA+(399nt)(4nt)+(399nt)L-19IVS(395nt)G5’GAG3’G-IVS(414nt)(15n69（五）核苷酸置換修飾將酶分子核苷酸鏈上的某一個(gè)核苷酸換成另一個(gè)核苷酸，引起酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變，從而改變核酸類酶的某些特性和功能的方法。常采用定位突變技術(shù)。例如：L-19IVS活性中心由第22-27位的6個(gè)核苷酸殘基組成，只要將其中的堿基置換一個(gè)，就可以是底物專一性發(fā)生改變。（P170表5-2)（五）核苷酸置換修飾70(六)酶分子的物理修飾通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。(六)酶分子的物理修飾71舉例：

1.纖維素酶經(jīng)高壓處理后，最適溫度有所降低，在30℃-40℃條件下，酶活比天然酶提高了10%。2.鹽酸胍使胰蛋白酶的原有空間構(gòu)象破壞，透析出去變性劑后，再在不同溫度下，使酶重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象。結(jié)果表明，50℃條件下重新構(gòu)建的酶的穩(wěn)定性比天然酶提高5倍。舉例：72補(bǔ)充：抗體酶一、抗體酶的理論基礎(chǔ)1.抗體酶又稱催化抗體（Catalyticantibody)是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。2.抗原與抗體：當(dāng)外源物性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、顆粒（細(xì)菌、細(xì)胞、病毒）進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)便產(chǎn)生相應(yīng)的免疫球蛋白（immuneglobin），并以之結(jié)合，以消除異物的毒害。此反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，此異物便是抗原，此球蛋白便是抗體。補(bǔ)充：一、抗體酶的理論基礎(chǔ)73IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格743.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論

酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過(guò)渡態(tài)，降低能障（反應(yīng)的活化能）。以過(guò)渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。3.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論75二、抗體酶的制備1.誘導(dǎo)法

用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過(guò)與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，使宿主有機(jī)體針對(duì)抗原產(chǎn)生抗體，取免疫動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能在體外培養(yǎng)。將雜交體克隆化，即能產(chǎn)生單一均勻的抗體酶。二、抗體酶的制備76第五章：(酶工程)酶分子修飾課件772、修飾法：

抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在抗體與抗原的結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基因。如氨基酸置換修飾或側(cè)鏈基團(tuán)修飾。2、修飾法：78

三、抗體酶的應(yīng)用

1.戒毒:

用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。三、抗體酶的應(yīng)用

1.戒毒:

用可卡因水解792.腫瘤治療抗體酶的高度專一性可由于藥物對(duì)靶細(xì)胞的定位，臨床應(yīng)用時(shí)可減少藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害，達(dá)到更好的療效。目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。2.腫瘤治療80作業(yè)：1.名詞解釋：金屬離子置換修飾；分子內(nèi)交聯(lián)修飾；抗體酶2.為什么要對(duì)酶進(jìn)行分子修飾？酶分子修飾的意義是什么？3.分別舉例說(shuō)明大分子修飾后酶的穩(wěn)定性提高及抗原性消除。4.分別寫(xiě)出用哪種修飾劑可以進(jìn)行酶蛋白中賴氨酸、組氨酸、羧基、巰基及N端氨基酸的檢測(cè)？作業(yè)：1.名詞解釋：金屬離子置換修飾；分子內(nèi)交聯(lián)修飾；抗81第五章酶分子修飾酶的活性中心酶化學(xué)修飾的目的酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用第五章酶分子修飾82第一節(jié)酶的活性中心（activesite）

一、活性中心的概念由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域.

第一節(jié)酶的活性中心（activesite）83第五章：(酶工程)酶分子修飾課件84二、活性中心的共性

(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。(4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)酶與底物通過(guò)鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合。二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（185第五章：(酶工程)酶分子修飾課件86第五章：(酶工程)酶分子修飾課件87第五章：(酶工程)酶分子修飾課件88ActivesiteTheactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.Theactivesiteisathree-dimensionalentity,oftenacleft

orcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.Activesite89三、研究酶活性中心的方法

1.物理學(xué)方法：用X射線衍射法直接檢測(cè)底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對(duì)位置。三、研究酶活性中心的方法902.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為

1)非專一性化學(xué)修飾

用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若某基團(tuán)被修飾后：酶活性不變——該基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)酶活性降低或喪失——該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。2.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為91活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)①失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。②S或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）。活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)92差別標(biāo)記：底物或抑制劑存在活性基團(tuán)不與修飾劑作用去除底物或抑制劑原來(lái)被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)?；瘜W(xué)修飾含同位素標(biāo)記的同樣試劑差別標(biāo)記：化學(xué)修飾含同位素標(biāo)記的同樣試劑932)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）

用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。作用機(jī)制：利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）94化學(xué)修飾的專一性化學(xué)修飾的專一性95親和修飾劑：

①與S結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基親和力大，而與活性中心以外的氨基酸殘基親和力小。②具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。親和修飾劑：963.蛋白質(zhì)工程：（定點(diǎn)誘變法）將酶相應(yīng)的cDNA定點(diǎn)突變，突變的cDNA只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。3.蛋白質(zhì)工程：（定點(diǎn)誘變法）97第二節(jié)酶化學(xué)修飾及修飾目的一、酶化學(xué)修飾

1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因： 1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 2)酶活性不夠高； 3)具有抗原性。

第二節(jié)酶化學(xué)修飾及修飾目的982.改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。2.改變酶特性有兩種主要的方法：99二、酶化學(xué)修飾的目的（一）研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（二）人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。

二、酶化學(xué)修飾的目的1001.修飾酶的熱穩(wěn)定性1.修飾酶的熱穩(wěn)定性101

2.修飾酶的抗原性2.修飾酶的抗原性1023.修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力

3.修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力

1034.修飾酶在體內(nèi)的半衰期

4.修飾酶在體內(nèi)的半衰期

1045.最適pH

5.最適pH

1056.Km的變化

6.Km的變化

106

第三節(jié)酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第三節(jié)酶化學(xué)修飾的原理107三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶108四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境109

第四節(jié)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)

一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性包括酶的——1.活性部位情況2.穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件3.側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性第四節(jié)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)110二、修飾劑的選擇要考慮——

1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量）2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)）3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件二、修飾劑的選擇要考慮——111三、反應(yīng)條件的選擇要注意——1.酶與修飾劑的分子比例2.反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件3.反應(yīng)溫度及時(shí)間三、反應(yīng)條件的選擇要注意——112第五節(jié)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用

一、酶的表面化學(xué)修飾（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。第五節(jié)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用1132.修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化(P157），然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。2.修飾劑：1143.應(yīng)用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）

延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期（P160表5-1）又如：PEG－天冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性提高酶活3.應(yīng)用：115（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）116幾種重要的修飾反應(yīng)類型：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)幾種重要的修飾反應(yīng)類型：1171.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。1.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型1)烷基化反應(yīng)118烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)119

2)?；磻?yīng)試劑特點(diǎn)：含有

結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；??？勺饔没鶊F(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）2)酰基化反應(yīng)120?；磻?yīng)

酰基化反應(yīng)1213)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺還原劑：巰基乙醇、DTT（二硫蘇糖醇）等?？杀谎趸膫?cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。3)氧化和還原反應(yīng)122連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。1234)芳香環(huán)取代反應(yīng)

試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋+HI硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）4)芳香環(huán)取代反應(yīng)（四硝基甲烷）1242.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1)氨基的化學(xué)修飾：來(lái)源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化?；揎梽?

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾125第五章：(酶工程)酶分子修飾課件126

2)羧基的化學(xué)修飾常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

碳化二亞胺酶-碳二亞胺衍生物

1273)胍基的化學(xué)修飾來(lái)源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基?；?。修飾劑：

丁二酮二羰基化合物1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛3)胍基的化學(xué)修飾128第五章：(酶工程)酶分子修飾課件1294)巰基的化學(xué)修飾來(lái)源：Cys修飾反應(yīng):烷基化

修飾劑：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）E－SH＋

修飾酶（300nm)4)巰基的化學(xué)修飾修飾酶（300nm)1305)二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）5)二硫鍵的化學(xué)修飾131氧化：過(guò)甲酸:Performicacid氧化：過(guò)甲酸:Performicacid132

6)咪唑基的化學(xué)修飾

來(lái)源：His修飾反應(yīng):?；c烷基化

酰基化修飾劑:常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）++C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH+HI修飾酶（240nm)6)咪唑基的化學(xué)修飾修飾酶（240nm)1337）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）（高度專一的對(duì)酚羥基修飾）7）酚羥基的化學(xué)修飾（高度專一的對(duì)酚羥基修飾）1348）吲哚基的化學(xué)修飾來(lái)源：Trp修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺（NBS)8）吲哚基的化學(xué)修飾135氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷T(mén)rp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟136（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）137二、酶分子內(nèi)部修飾

（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）

利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾通常采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。

二、酶分子內(nèi)部修飾

（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）138

酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：139應(yīng)用實(shí)例：1）酶原激活a、胃蛋白酶原的激活應(yīng)用實(shí)例：140第五章：(酶工程)酶分子修飾課件141b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活142c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活1432）提高酶活力：

天冬氨酸酶通過(guò)胰蛋白酶修飾。從羧基端切除10個(gè)氨基酸殘基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5倍左右。3）消除抗原性：（抗原性還與分子大小有關(guān)）

木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，除去其肽鏈的2/3，該酶的活力基本保持。其抗原性卻大大降低。第五章：(酶工程)酶分子修飾課件144（二）氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。（二）氨基酸置換修飾145酶分子的定點(diǎn)突變1、新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)2、突變基因堿基序列的確定3、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變4、酶基因克隆表達(dá)5、變異特性分析酶分子的定點(diǎn)突變1、新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)146（三）金屬離子置換修飾

改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。（三）金屬離子置換修飾147常用金屬離子（往往是二價(jià)離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。方法步驟：酶的分離純化－向酶液加入一定量的EDTA－將酶與金屬螯合物分離－金屬離子置換。舉例：α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過(guò)程中添加一定量的鈣離子。常用金屬離子（往往是二價(jià)離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+148（四）