免疫學(xué)檢測技術(shù)

關(guān)于免疫學(xué)檢測技術(shù)第一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測未知抗體；用已知抗體檢測未知抗原：定性或定量檢測體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測半抗原物質(zhì)。第二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1.特異性和交叉反應(yīng)

特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)第三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日交叉反應(yīng)（crossreaction）性：若兩種抗原分子有一個或數(shù)個相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。第四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日結(jié)合價：天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個抗體分子結(jié)合，為多價。單體形式的抗體分子有兩個Fab段，能結(jié)合兩個相同的抗原決定基，為兩價。

2.比例性第五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日比例合適：若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個Fab段分別與兩個抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)

Ab過剩和Ag過?？乖涂贵w結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，與兩者的濃度和比例密切相關(guān)第六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過剩和Ag過剩第七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）抗體過?？乖^?？贵w抗體比例合適抗原抗體第八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點(diǎn)，可借助親和層析法純化抗原或抗體。3.可逆性第九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日4.階段性抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段

特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見。

可見的反應(yīng)階段：反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。

第十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1.電解質(zhì)

抗原和抗體有對應(yīng)的極性基團(tuán)，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗(yàn)中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。（二）、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素第十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日2.酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。3.溫度最適溫度為37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。第十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

4.抗原和抗體的性質(zhì)抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。

第十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日抗體分子上一個抗原結(jié)合點(diǎn)與對應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)第十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類：1.凝集反應(yīng)2.沉淀反應(yīng)3.補(bǔ)體參加的反應(yīng)4.免疫標(biāo)記技術(shù)（三）、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法第十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)非標(biāo)記凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接抑制凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗(yàn)、凝膠內(nèi)凝集試驗(yàn)補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)、毒素中和試驗(yàn)標(biāo)記標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱凝集素（agglutinin)。

凝集反應(yīng)（AgglutinationTests）第十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1．直接凝集（directagglutination)

：

細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。2．間接凝集（indirectorpassiveagglutination)：檢測針對可溶性Ag的Ab3．間接凝集抑制試驗(yàn)(directagglutinationinhibitiontest)4.協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-agglutinationtest）

載體為金葡菌，其細(xì)胞壁蛋白A與IgG的Fc結(jié)合，用于細(xì)菌、病毒的快速檢測。第十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日妊娠免疫診斷試驗(yàn)

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。HCG檢測為間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用第二十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細(xì)菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（PrecipitationTests）用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱沉淀素（precipitin)。

第二十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日大多沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。第二十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1．單向免疫擴(kuò)散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)沉淀反應(yīng)第二十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第二十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。第二十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第二十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（ComplementFixationtest,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢。第二十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complementfixationtest，CFT)將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。第二十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日試驗(yàn)原理作用原理：利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用進(jìn)行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測定5種成分，3個系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：已知抗原（或抗體）與待測抗體（或抗原）補(bǔ)體系統(tǒng)：指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗(yàn)時常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶菌系統(tǒng)第二十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日反應(yīng)分兩步進(jìn)行

第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體的作用

第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體的反應(yīng)不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性，而溶血為試驗(yàn)陰性第三十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞溶解情況AgPatient’sserum

AbNoAbAg第三十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）第三十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進(jìn)行定性或定位。

1．免疫熒光法(immunofluorescence,IF)第三十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對標(biāo)本進(jìn)行檢測。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類第三十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日免疫熒光法圖示第三十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。常見的標(biāo)記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）

２．酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)第三十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)第三十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1）ELISA是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強(qiáng)，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。第三十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日分類：（1）放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)（2）免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）3．放射免疫技術(shù)第三十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)第四十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日屬于非競爭性放射性配體結(jié)合分析技術(shù)。他與RIA為代表的競爭性放射性配體分析技術(shù)的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：一，放射性核素標(biāo)記的是抗體而不是抗原，其二是采用過量抗體而不是限量抗體。RIMA與RIA相比較，提高了檢測的靈敏度并使檢測范圍增寬，特異性和精確度進(jìn)一步提高。

免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）

第四十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日免疫放射分析法有以下特點(diǎn)：1.以標(biāo)記抗體作為示蹤劑2.反應(yīng)動力學(xué)：因標(biāo)記抗體是過量的，且反應(yīng)是非競爭性的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA快。3.靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的10～100倍。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬。5.特異性高。6.穩(wěn)定性好。第四十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日４．金標(biāo)記免疫技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabelingtechnique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。第四十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日免疫膠乳試驗(yàn)應(yīng)用第四十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日膠乳凝集試驗(yàn)原理：

膠乳凝集試驗(yàn)是一種間接凝集試驗(yàn)，它是以聚苯乙烯膠乳微粒作為惰性載體。膠乳為人工合成的載體，因此其性能比生物來源的紅細(xì)胞穩(wěn)定，均一性好。但膠乳與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力以及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此作為間接凝集試驗(yàn)，膠乳試驗(yàn)的敏感度不及血凝試驗(yàn)。第四十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日膠乳凝集試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)的膠乳凝集試驗(yàn)分試管法與玻片法。試管法先將受檢標(biāo)本在試管中以緩沖液作倍比稀釋，然后加入致敏的膠乳試劑，反應(yīng)后觀察膠乳凝集結(jié)果。玻片法操作簡便，1滴受檢標(biāo)本和1滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續(xù)搖動2～3min即可觀察結(jié)果。出現(xiàn)大顆粒凝集的為陽性反應(yīng)，保持均勻乳液狀為陰性反應(yīng)。

第四十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）原理：膠乳凝集試驗(yàn)原理相同，在受檢者血清中，加入溶血素“O”,出現(xiàn)凝集顆粒，即為陽性。參考值：ASO≤250U/L第四十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日臨床意義：1.ASO測定對于診斷A族鏈球菌感染很有價值，其存在及含量可反映感染的嚴(yán)重程度。2.風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、猩紅熱、急性扁桃體炎等ASO明顯升高。3.少數(shù)肝炎、結(jié)締組織病、結(jié)核病及多發(fā)性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。4.當(dāng)效價>250U/L時，才被認(rèn)為有診斷價值。

抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）第四十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。類風(fēng)濕因子是由于感染因子（細(xì)菌、病毒等）引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG為抗原的一種抗體，故又稱抗抗體。

第四十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日原理：將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測血清中的RF相遇時，即發(fā)生肉眼可見的凝集。參考值：正常人1：20稀釋血清為陰性。

類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

第五十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日臨床意義：1.約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽性。2.某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等。3.一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。

類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）

第五十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)。第五十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日ELISA主要有以下幾種類型：1.雙抗體夾心法測抗原（常用）2.雙抗原夾心法測抗體3.間接法測抗體（常用）4.競爭法測抗原5.競爭法測抗體6.捕獲包被法測抗體7.親和素-生物素ELISA法第五十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日包被特異性抗體加入待測樣品加酶標(biāo)特異性抗體底物顯色洗滌孵育洗滌孵育雙抗體夾心法測抗原第五十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第五十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日待測抗原須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，另一端與酶標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。此法適用于檢驗(yàn)各種二價或二價以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價抗原的測定。第五十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日雙抗原夾心法測抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定。乙肝標(biāo)志物中HBsAb的檢測常采用本法。關(guān)鍵在于根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同制備酶標(biāo)抗原。第五十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第五十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日間接法測抗體間接法是檢測抗體最常用的方法。原理：利用酶標(biāo)記的抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。

第五十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日操作步驟：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌。（2）加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，孵育洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，孵育洗滌。（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。第六十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日間接法的特點(diǎn)本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測相應(yīng)抗體。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。若抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?/p>

第六十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日競爭法測抗原第六十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日

操作步驟：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體洗滌。（2）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)，孵育洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。第六十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日競爭法測抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。

第六十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日捕獲包被法測抗體樣品中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。第六十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日操作步驟：

（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗

IgM，洗滌。（2）加入稀釋的待測標(biāo)本：孵育后樣品中的IgM抗體被、固相抗體捕獲，洗滌。（3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM

結(jié)合，洗滌。（4）加入針對抗原的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合，洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標(biāo)本中存在、特異性IgM抗體，是為陽性反應(yīng)。第六十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第六十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合。生物素（biotin）又稱維生素H，存在于蛋黃中?？膳c蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，形成一種極為穩(wěn)定的復(fù)合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。

第六十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第六十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日乙型肝炎血清學(xué)檢驗(yàn)臨床意義乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。傳播途徑：血液傳播、性接觸傳播和母嬰傳播第七十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HBV的抗原有3種：表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及檢測的主要標(biāo)志。核心抗原是乙肝病毒核心顆粒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白。由于它存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，被表面抗原覆蓋，故不易在血循環(huán)中檢出?？纱碳C(jī)體產(chǎn)生抗-HBc。e抗原為可溶性蛋白質(zhì)，在病理上認(rèn)為是HBV復(fù)制以具有強(qiáng)感染性的一個指標(biāo)?？?HBe的出現(xiàn)，是預(yù)后良好的征象。第七十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨床意義－－－－－過去和現(xiàn)在均未感染HBV－

－－－＋曾感染HBV，急性感染恢復(fù)期－－－＋＋過去和現(xiàn)在均已感染過HBV－＋－－－預(yù)防注射疫苗－＋－＋＋既往感染；急性HBV感染恢復(fù)期－＋－－＋既往感染；急性HBV感染已恢復(fù)＋－－－＋急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者第七十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HBsAg抗-HBsHBeAg抗HBe抗-HBc臨床意義＋－－＋＋急性HBV感染趨向恢復(fù)；慢性HBsAg

攜帶者，傳染性弱；長期持續(xù)易癌變

＋－＋－＋急性或慢性乙肝，傳染性極強(qiáng)

＋－－－－急性HBV感染早期，HBsAg攜帶者

＋－＋－－急性HBV感染早期，傳染性強(qiáng)

－－＋＋＋急性感染中期

＋－＋＋＋急性感染趨向恢復(fù)；慢性攜帶者

＋－－＋－急性感染趨向恢復(fù)

－－－＋－急性感染趨向恢復(fù)

第七十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

艾滋病是一種危害性極大的傳染病，由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細(xì)胞作為主要攻擊目標(biāo)，大量破壞該細(xì)胞，使人體喪失免疫功能，HIV在人體內(nèi)的潛伏期平均為8～9年。第七十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日艾滋病從感染到發(fā)病的一般過程感染分期臨床分期維持時間感染標(biāo)志物傳染性原發(fā)感染潛伏期潛伏期2-4周抗體陰性(窗口期)傳染危險性高原發(fā)感染癥狀期急性HIV感染1-2周傳染危險性高慢性感染潛伏期無癥狀HIV感染2－15年(平均8-10年)抗體陽性有傳染性臨床發(fā)病期艾滋病0－3年(平均1-2年)抗體陽性抗原陽性傳染性強(qiáng)第七十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日艾滋病檢測的方法檢驗(yàn)標(biāo)志物檢驗(yàn)?zāi)康臋z驗(yàn)方法HIV(1+2)抗體篩查試驗(yàn)金標(biāo)法、硒標(biāo)法快速診斷試驗(yàn)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)微孔板法酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）第三代：雙抗原夾心法第四代：增加檢測P24抗原確證試驗(yàn)免疫印跡法(WB)手工/儀器第七十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HIV抗體篩查試驗(yàn)第七十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日明膠顆粒凝集試驗(yàn)的操作和結(jié)果判斷第七十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日5

450/630nm下測定OD值混勻，加蓋，37℃溫育

洗板3

加入底物第二次特異性結(jié)合4

加入終止液1

加入樣品

洗板2

加入酶標(biāo)記物加蓋，37℃溫育加蓋，37℃溫育第一次特異性結(jié)合酶聯(lián)免疫分析ELISA

（雙抗原夾心、兩步法）第七十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HIV抗體檢測結(jié)果處理規(guī)范檢測方法檢測結(jié)果檢驗(yàn)報告處理篩查試驗(yàn)陰性HIV抗體陰性陰性告知陽性HIV抗體待復(fù)查上送確證確證試驗(yàn)陰性HIV抗體陰性（-）陰性告知陽性HIV抗體陽性（+）陽性告知，個案調(diào)查不確定HIV抗體不確定（±）告知，3個月后復(fù)查共2次第八十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日樣品初篩檢測陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)篩查試劑復(fù)查原有試劑加另一種篩選試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)報告陰性第八十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日HIV抗體確證試驗(yàn)WesternBlot免疫印跡法■針對各種病毒蛋白的特異抗體■區(qū)分ELISA真陽性與假陽性■檢測HIV-1和HIV-2第八十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日全自動免疫印跡儀第八十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日腫瘤標(biāo)志物檢測的臨床應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的定義腫瘤標(biāo)志物（tumormarker，TM）是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺等。可在腫瘤患者血液或體液中檢測到腫瘤標(biāo)志物。第八十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日腫瘤標(biāo)志物的分類癌胚抗原類標(biāo)志物糖類抗原標(biāo)記物酶類標(biāo)志物激素類標(biāo)志物蛋白類標(biāo)志物第八十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日胚胎抗原類標(biāo)志物1、甲胎蛋白AFP胎兒發(fā)育早期，由肝臟和卵黃囊合成的一種血清糖蛋白，電泳時位于白蛋白和α1球蛋白之間，胎兒出生后不久即逐漸消失。成人血清中含量甚微。參考值：AFP<25ug/L（ELISA）

第八十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日臨床意義（1）原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中AFP濃度明顯升高，約77.1%的患者AFP>300ng/mL，但也有18%的病人AFP并不升高。（2）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者AFP濃度有不同程度的升高，但其水平通常低于100ng/mL。其升高原因主要是由于受損傷的肝細(xì)胞再生而形成幼稚化細(xì)胞，幼稚化的肝細(xì)胞具有產(chǎn)生AFP的能力。但隨著受損肝細(xì)胞的修復(fù)，AFP逐漸恢復(fù)正常。（3）生殖腺胚胎性腫瘤患者血清中AFP濃度可見升高。（4）婦女妊娠3個月后，血清AFP濃度開始升高，7~8個月時達(dá)到高峰，一般在400μg/L以下，分娩后3周恢復(fù)正常。若孕婦血清中AFP異常升高，應(yīng)考慮胎兒神經(jīng)管缺損畸形的可能性。第八十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日2、癌胚抗原CEA

是一種可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟。胃腸道惡性腫瘤時可見血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他惡性腫瘤中也可出現(xiàn)表達(dá)，并分泌于體液中。

參考值：CEA<5ug/L（ELISA）

第八十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）血清CEA升高主要見于結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他惡性腫瘤也有不同程度的陽性率。（2）隨著臨床應(yīng)用的發(fā)展，CEA變得越來越廣譜。主要用于連續(xù)的隨訪檢測，可用于惡性腫瘤手術(shù)后的療效觀察及預(yù)后判斷，也可用于對化療病人的療效觀察。（3）某些良性疾病，如直腸息肉、結(jié)腸炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但陽性率較低。（4）98%的非吸煙者CEA<5ng/mL，吸煙者中約有3.9%的人CEA>5ng/mL臨床意義第八十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日糖類抗原腫瘤標(biāo)志物1、糖類抗原12-5（CA12-5）是卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標(biāo)志物分子量為20萬的糖蛋白可被單克隆抗體OC125所識別在卵巢腫瘤上皮和Mullerian副腎管來源的病理和正常組織中表達(dá)，其生物學(xué)功能不明。

參考值：CA12-5<3.5萬U/L（ELISA）

第九十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）卵巢癌病人血清中CA125水平明顯升高。手術(shù)和化療后期水平很快下降。當(dāng)復(fù)發(fā)時，在臨床確診前幾個月便可呈現(xiàn)CA125增高，尤其卵巢癌轉(zhuǎn)移患者的血清CA125更明顯高于正常參考值。（2）其他非卵巢惡性腫瘤也有一定陽性率，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，結(jié)腸直腸癌34.2%，其他婦科腫瘤43%。（3）非惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、卵巢囊腫、胰腺炎、肝炎、肝硬化等疾病也有不同程度升高，但陽性率較低，診斷時應(yīng)注意鑒別。（4）在許多良性和惡性胸腹水中發(fā)現(xiàn)有CA125升高，羊水中也能檢出較高濃度的CA125。（5）早期妊娠的頭3個月內(nèi)，也有CA125升高的可能。臨床意義第九十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日2、糖類抗原15-3（CA15-3）CA15-3是乳腺癌的最重要的特異性標(biāo)志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA15-3明顯升高，是乳腺癌患者診斷和監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、觀察療效的最佳指標(biāo)。參考值：CA12-5<2.5萬U/L（ELISA）第九十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性較低，約為60%，轉(zhuǎn)移性乳腺癌陽性率可達(dá)80%。CA15-3可以作為原發(fā)性乳腺癌的輔助診斷指標(biāo)，也可以作為手術(shù)后隨訪，監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。（2）其他惡性腫瘤，如肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、原發(fā)性肝癌等也有不同程度的陽性率。（3）肝臟、胃腸道、肺、乳腺、卵巢等非惡性腫瘤疾病，陽性率一般低于10%。

臨床意義第九十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日3、糖類抗原19-9（CA19-9）CA19-9是胰腺、胃、膽囊和腸癌的標(biāo)記物。參考值：CA19-9<3.7萬U/L（ELISA）第九十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）胰腺癌、膽囊癌、膽管壺腹癌患者血清CA19-9水平明顯升高，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA19-9濃度可達(dá)40萬U/mL，陽性率約為74.9%，是重要的輔助診斷指標(biāo)。（2）胃癌陽性率約為50%，結(jié)腸癌陽性率約為60%，肝癌陽性率約為64.6%。（3）急性胰腺炎、膽囊炎、膽汁淤積性膽管炎、肝硬化、肝炎等疾病，CA19-9也有不同程度的升高，應(yīng)注意鑒別。

臨床意義第九十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日酶類腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原（PSA）PSA是前列腺的特異性標(biāo)記物 屬于器官特異性抗原，不具備腫瘤特異性PSA屬于酶類腫瘤標(biāo)記物，具有糜蛋白酶樣和胰蛋酶的活性PSA在正常男性含量小于4g/L參考值：血清t-PSA<4.0ug/L（ELISA）f-PSA<0.8ug/Lt-PSA/f-PSA>0.2第九十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日（1）PSA是前列腺癌標(biāo)志物。隨著年齡的增大，血清PSA會逐漸增加。（2）前列腺肥大、前列腺炎、腎脹和泌尿生殖系統(tǒng)的疾病患者，也可見t-PSA和f-PSA水平輕度升高，必須結(jié)合其他檢查進(jìn)行鑒別。（3）單獨(dú)使用t-PSA和f-PSA升高來診斷前列腺癌時很難排除前列腺肥大對前列腺癌診斷的影響，特別是當(dāng)t-P