定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件

定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)測定技術

及其臨床應用衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)測定技術

及其臨床應用衛(wèi)生部臨1PCR?

PCR只是一個簡單的不起眼玩藝

——凱利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術，后者又上升成為新的概念。…

它最大的特點就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個簡單的不起眼玩藝2（KaryMullis)（KaryMullis)3什么是PCR?

我不認為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學革命)加以說明?！陌l(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進行基因操作，學術界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具?！獎P利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認為PCR能夠用兩種“4定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件5PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實驗）發(fā)明了PCR?！斑@種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時想出來的”。--KBMullis,ScientificAmerican,april1990PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Ce6PCR發(fā)明過程的簡單回顧PCR發(fā)明過程的簡單回顧7定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件8定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件9定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件10定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件11PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）關于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)1987KBMullisetal.”SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology155:335PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）12PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1987當年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術專利批準。1985年底成立的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個PCR試劑產(chǎn)品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應用于臨床診斷。RKSaiki,…KBMullisetal.(1988)”Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermo-stableDNApolymerase”,Science239:487PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1987當年7月Cet13TaqDNApolymeraseThermusaquaticusTaqDNApolymeraseThermusaqua14TaqDNApolymerase–AthermostableDNApolymerasefromThermusaquaticus.定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件15PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，1971年PCR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應當是公共產(chǎn)權。斯坦福大學Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認為，任何具備生物技術知識的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，197116PCR及有關技術的發(fā)展歷史（5）H.G.Khorana

美國MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主Studyonpolynucleotides:repairreplicationofshortsyntheticDNA’sascatalyzedby

DNApolymerases.JMolBiol,1971,56:341“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴增最早設想不能實現(xiàn)的原因:當時很難進行測序和合成寡核苷酸引物；當時(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能

PCR及有關技術的發(fā)展歷史（5）H.G.K17Thearticlefrom1971inwhichKleppeetal.describeRepairreplication–basicallythesameprincipleasPCR!J.Mol.Biol.(1971)56341-361定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件18PCR及有關技術的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科學家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。Cetus科學家H.Erlich和K.Mullis在德國臨床化學領域獲得生化分析獎。1991TaqMan技術發(fā)表。當年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進行RT-PCR技術，并用于臨床RNA病毒檢測。耐熱逆轉錄酶首次由Cetus科學家發(fā)現(xiàn)并報道。

PCR及有關技術的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科19實時熒光PCR技術1986年末RussHiguchi來到PCR的誕生地Cetus公司工作探討“閉管PCR”的可能“溴化乙錠”的使用光導纖維的使用實時熒光PCR技術1986年末RussHiguchi來到20PCR及有關技術的發(fā)展歷史（7）1992當年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標準試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（7）1992當年3月Ce21PCR及有關技術的發(fā)展歷史（8）

九十年代中期PCR臨床應用在國內(nèi)全面展開1998年實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測1999年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應用于血液篩查PCR及有關技術的發(fā)展歷史（8）九十年代中期PCR臨床22PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列23PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Pr24PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime25第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin第1個PCR循環(huán)完成后–

得到2630次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli27定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件28PCR擴增過程圖示PCR擴增過程圖示29PCR擴增的理論模式

PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴增過程即由指數(shù)擴增降低至穩(wěn)定的擴增速率，最終達到平臺，不再擴增.PCR擴增的理論模式PCR擴增為指數(shù)擴增，每30影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交31PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysisPCR和定量問題高濃度/高效率log-phaseana32定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別

定量PCR測定的測定點為PCR擴增的指數(shù)擴增期;而定性PCR測定的測定點則多為PCR擴增的平臺期。定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別33定性PCR測定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標等）PCR-膜上雜交PCR-ELISA定性PCR測定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標等）34定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力學方法和內(nèi)標共擴增方法定量還可分為絕對定量（即測定X的分子數(shù)量）和相對定量（即測定不同樣本中X的比率）

定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力35用外標準的定量PCR方法用外標準的定量PCR方法36使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建立；（2）使用雙孔重復測定，這種方法可得到非常準確的結果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點：（1）PCR反應體系中小的區(qū)別也會對測定造成較大的影響。由于最后在擴增效率上的差異，從而使得定量測定精密度和重復性不佳。因此，如果建立一個使用外標準的PCR定量方法，則必須進行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復性（批間變異）分析，以確定其應用的局限性。使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建37TaqMan實時熒光定量PCRTaqMan實時熒光定量PCR38定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件39分子信標實時熒光定量PCR分子信標實時熒光定量PCR40動力學定量PCR方法

第一步：確定PCR擴增的效率；第二步：根據(jù)相應的公式計算原始模板數(shù)。動力學定量PCR方法41擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常數(shù)，則可通過在PCR擴增的指數(shù)期的數(shù)個連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴增樣本，然后測定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來測定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴增效率保持恒定；換句話說，也就是PCR尚未達到擴增效率開始降低時的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測得E值；擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常42擴增效率的計算擴增效率的計算43擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（44X(原始模板數(shù))的計算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計算得到X。公式（4）來源于公式（2）的重新排列：X＝Yn/(1＋E)n（4）X(原始模板數(shù))的計算一旦效率確定后，根據(jù)公45X的另一種計算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對數(shù)形式，以所測定的Yn值的對數(shù)對函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當n＝0時，可在圖上讀出X值，或通過對公式（5）的線性回歸計算X值（圖2）。X的另一種計算方式(1)另一種方式是，根據(jù)公46定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件47動力學方法的特點

這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；（2）如果能測定PCR產(chǎn)物分子的絕對數(shù)量，則可得到待測樣本的不同的擴增效率（Ee)。動力學方法的特點這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；48使用非競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

非競爭性內(nèi)標準：（1）一般為與靶核酸無關的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無相同的引物結合位點和擴增序列。對于DNA的擴增，非競爭性內(nèi)標幾乎所有的基因都可應用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動蛋白的基因。而對RNA的擴增，則非競爭性內(nèi)標較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標應該在整個細胞周期中表達的水平變化不大，此外，其表達水平應接近于靶RNA，而且它們的擴增效率應相等，因此兩者擴增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來作為此種內(nèi)標，如HLA、β肌動蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。使用非競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法非競爭性內(nèi)標準：（1）一49以非競爭性內(nèi)標定量的主要優(yōu)點內(nèi)標的制備簡單復管測定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。以非競爭性內(nèi)標定量的主要優(yōu)點內(nèi)標的制備簡單50以非競爭性內(nèi)標定量的缺點內(nèi)標準和靶核酸的逆轉錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對的是相同的靶核酸逆轉錄效率也會有很大差異。因此，使用這種方法進行RNA的定量PCR測定極為困難。在擴增過程中的指數(shù)期測定可對原始模板相對定量，但如果沒有驗證在一定的擴增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標有相同的擴增效率，則不能進行絕對定量。以非競爭性內(nèi)標定量的缺點內(nèi)標準和靶核酸的逆轉錄的效率有可能不51使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

“競爭性”內(nèi)標：人為構建的可與原始靶核酸競爭酶、核苷酸和引物分子的核酸標準，其特點是，與靶核酸具有相同的引物結合位點、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴增產(chǎn)物在檢測時能夠很容易地通過諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對內(nèi)標準的修飾方法包括對野生型基因組的點突變、部份缺失或插入外來順序等，目前尚無通用的規(guī)則或程序來構建這種內(nèi)標準。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法“競爭性”內(nèi)標：人為構建的52使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標既可進行相對定量也可進行絕對定量。相對定量具有很好的精密度和重復性。而絕對定量，關鍵是要證明競爭性內(nèi)標和野生型靶核酸的擴增效率相同。亦可將競爭性內(nèi)標置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時擴增來評價。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標既可進行相對定53使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進行數(shù)管競爭性PCR測定，每管中靶核酸的量不變，但改變競爭性內(nèi)標的量，因為只有當待測靶核酸與競爭性內(nèi)標等摩爾量時才能有可靠的定量。由于競爭性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準確的PCR定量方法，適用于絕對定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進54定量和定性PCR測定的臨床應用及

應注意的問題為什么要做定量測定？定性和定量測定結果報告上的混淆。定量和定性PCR測定的臨床應用及

應注意的問題55為什么要做定量測定？用于已知病毒感染患者抗病毒治療效果的動態(tài)觀察及抗病毒藥物的臨床研究；用于基因表達方面的研究，如特定的mRNA的定量測定。為什么要做定量測定？56為什么要做定性測定？用于未知患者的確認用于血液篩檢突變檢測為什么要做定性測定？用于未知患者的確認57定量和定性測定的結果報告定量測定測定的是量的“多”或“少”；定性測定則是測定某種物質(zhì)的“有”或“無”，用于未知病人的確認診斷。定量測定結果報告：根據(jù)所使用的測定方法的測定范圍報告結果，如樣本測定結果高出此范圍，則可報告>多少，也可對樣本稀釋后再檢測；如低于此范圍，則報告<多少，如<103拷貝數(shù)/ml，而不能報告為0拷貝數(shù)/ml或陰性。定性測定結果報告:報告“陽性”或“陰性”,“檢出”或“未檢出”,“反應”或“未反應”定量和定性測定的結果報告定量測定測定的是量的“多”或“少”；58在感染性疾病病原體檢測中的應用病毒的檢測

定量定性基因型及基因突變細菌及其它微生物的檢測難培養(yǎng)菌耐藥基因寄生蟲的檢測在感染性疾病病原體檢測中的應用病毒的檢測59在遺傳病及其它基因相關疾病診斷中的應用α地貧β地貧血友病藥物性耳聾在遺傳病及其它基因相關疾病診斷中的應用α地貧60在親子鑒定中的應用每個人的遺傳物質(zhì)一半來自父親，另一半則來自母親。根據(jù)孟德爾遺傳分離和自由組合定律，親代基因型決定子代基因型，在沒有基因突變和分型錯誤的前提下，孩子不可能帶有雙親均沒有的等位基因。父系遺傳的Y染色體的標記，子代的分型必定與父親的相同，而且同一父系的所有個體的分型一致。母系遺傳的線粒體DNA，子代的分型與母親的分型一致，并且同一母系的所有個體的分型一致。

在親子鑒定中的應用每個人的遺傳物質(zhì)一半來自父親，另一半則來自61在個體鑒別中的應用基因指紋又稱DNA指紋，指的單基因座探針限制性片段長度多態(tài)性。DNA所含有的遺傳信息是由遺傳密碼字母A、C、G和T的序列決定的。人類含有總數(shù)約30億個這種字母，它們在人體每個細胞的染色體上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一個個體與另一個個體完全不同。個體間的親緣關系相距越遠，基因組的核苷酸字母排列差異就越大。相反，遺傳上相關的個體（如同胞、父子）相應地在其字母序列上有很大的相似性。

在個體鑒別中的應用基因指紋又稱DNA指紋，指的單基因座探針限62在惡性腫瘤診斷中的應用腫瘤診斷腫瘤療效觀察腫瘤的轉移在惡性腫瘤診斷中的應用腫瘤診斷63在血液篩檢中的應用HCV和HIV感染“窗口期”HBVDNAPCR檢測篩檢血液的意義在血液篩檢中的應用64其它Immuno-PCR其它Immuno-PCR65臨床PCR檢驗應用的發(fā)展趨勢核酸提取方法的簡便化和自動化項目的多樣化：從病原體、到基因疾病的診斷、多標志物同時檢測、疾病基因指紋不同原理的實時基因擴增儀的普遍應用擴增試劑的改進：標準化、防污染、有內(nèi)標陰性質(zhì)控臨床PCR實驗室質(zhì)量理念不斷進入增強臨床PCR檢驗應用的發(fā)展趨勢核酸提取方法的簡便化和自動化66總結1.定量測定重在定量，即如何改善擴增指數(shù)期的線性及其范圍。定性測定重在測定下限。2.定量測定的準確性較之測定下限要重要得多。3.非競爭性內(nèi)標和競爭性內(nèi)標對于使用內(nèi)標的定量測定方法極為關鍵。合適的非競爭性內(nèi)標應為在整個細胞周期中均勻表達的基因核酸，而競爭性內(nèi)標則應盡可能近似原始待測模板。4.定量測定應在擴增的指數(shù)期進行，因此，更重要的是要使涉及整個擴增過程的每個參數(shù)都理想化，以便控制整個擴增，避開擴增“平臺期”。定性既可在擴增的平臺期，也可在擴增的指數(shù)期測定?？偨Y1.定量測定重在定量，即如何改善擴增指數(shù)期的線性及其67總結5.由樣本制備（核酸提?。┓椒ㄋ鸬亩繙y定的差異應仔細研究加以避免。6.對于絕對定量，必須確定靶核酸和內(nèi)標（競爭的和非競爭的）的擴增效率，內(nèi)標應以相同的效率與靶核酸一起擴增。為增加測定結果在統(tǒng)計學上的可信性，建議重復多次測定?？偨Y5.由樣本制備（核酸提?。┓椒ㄋ鸬亩繙y定的差異68謝謝!謝謝!69定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)測定技術

及其臨床應用衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)測定技術

及其臨床應用衛(wèi)生部臨70PCR?

PCR只是一個簡單的不起眼玩藝

——凱利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個簡單的不起眼玩藝71（KaryMullis)（KaryMullis)72什么是PCR?

我不認為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學革命)加以說明?！陌l(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進行基因操作，學術界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具。——凱利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認為PCR能夠用兩種“73定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件74PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實驗）發(fā)明了PCR?！斑@種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時想出來的”。--KBMullis,ScientificAmerican,april1990PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Ce75PCR發(fā)明過程的簡單回顧PCR發(fā)明過程的簡單回顧76定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件77定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件78定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件79定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件80PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）關于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)1987KBMullisetal.”SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology155:335PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）81PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1987當年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術專利批準。1985年底成立的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個PCR試劑產(chǎn)品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應用于臨床診斷。RKSaiki,…KBMullisetal.(1988)”Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermo-stableDNApolymerase”,Science239:487PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1987當年7月Cet82TaqDNApolymeraseThermusaquaticusTaqDNApolymeraseThermusaqua83TaqDNApolymerase–AthermostableDNApolymerasefromThermusaquaticus.定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件84PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，1971年PCR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應當是公共產(chǎn)權。斯坦福大學Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認為，任何具備生物技術知識的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，197185PCR及有關技術的發(fā)展歷史（5）H.G.Khorana

美國MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主Studyonpolynucleotides:repairreplicationofshortsyntheticDNA’sascatalyzedby

DNApolymerases.JMolBiol,1971,56:341“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴增最早設想不能實現(xiàn)的原因:當時很難進行測序和合成寡核苷酸引物；當時(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能

PCR及有關技術的發(fā)展歷史（5）H.G.K86Thearticlefrom1971inwhichKleppeetal.describeRepairreplication–basicallythesameprincipleasPCR!J.Mol.Biol.(1971)56341-361定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件87PCR及有關技術的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科學家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。Cetus科學家H.Erlich和K.Mullis在德國臨床化學領域獲得生化分析獎。1991TaqMan技術發(fā)表。當年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進行RT-PCR技術，并用于臨床RNA病毒檢測。耐熱逆轉錄酶首次由Cetus科學家發(fā)現(xiàn)并報道。

PCR及有關技術的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科88實時熒光PCR技術1986年末RussHiguchi來到PCR的誕生地Cetus公司工作探討“閉管PCR”的可能“溴化乙錠”的使用光導纖維的使用實時熒光PCR技術1986年末RussHiguchi來到89PCR及有關技術的發(fā)展歷史（7）1992當年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標準試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（7）1992當年3月Ce90PCR及有關技術的發(fā)展歷史（8）

九十年代中期PCR臨床應用在國內(nèi)全面展開1998年實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測1999年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應用于血液篩查PCR及有關技術的發(fā)展歷史（8）九十年代中期PCR臨床91PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列92PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Pr93PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime94第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin第1個PCR循環(huán)完成后–

得到9530次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli96定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件97PCR擴增過程圖示PCR擴增過程圖示98PCR擴增的理論模式

PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴增過程即由指數(shù)擴增降低至穩(wěn)定的擴增速率，最終達到平臺，不再擴增.PCR擴增的理論模式PCR擴增為指數(shù)擴增，每99影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交100PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysisPCR和定量問題高濃度/高效率log-phaseana101定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別

定量PCR測定的測定點為PCR擴增的指數(shù)擴增期;而定性PCR測定的測定點則多為PCR擴增的平臺期。定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別102定性PCR測定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標等）PCR-膜上雜交PCR-ELISA定性PCR測定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標等）103定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力學方法和內(nèi)標共擴增方法定量還可分為絕對定量（即測定X的分子數(shù)量）和相對定量（即測定不同樣本中X的比率）

定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力104用外標準的定量PCR方法用外標準的定量PCR方法105使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建立；（2）使用雙孔重復測定，這種方法可得到非常準確的結果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點：（1）PCR反應體系中小的區(qū)別也會對測定造成較大的影響。由于最后在擴增效率上的差異，從而使得定量測定精密度和重復性不佳。因此，如果建立一個使用外標準的PCR定量方法，則必須進行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復性（批間變異）分析，以確定其應用的局限性。使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建106TaqMan實時熒光定量PCRTaqMan實時熒光定量PCR107定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件108分子信標實時熒光定量PCR分子信標實時熒光定量PCR109動力學定量PCR方法

第一步：確定PCR擴增的效率；第二步：根據(jù)相應的公式計算原始模板數(shù)。動力學定量PCR方法110擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常數(shù)，則可通過在PCR擴增的指數(shù)期的數(shù)個連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴增樣本，然后測定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來測定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴增效率保持恒定；換句話說，也就是PCR尚未達到擴增效率開始降低時的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測得E值；擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常111擴增效率的計算擴增效率的計算112擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（113X(原始模板數(shù))的計算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計算得到X。公式（4）來源于公式（2）的重新排列：X＝Yn/(1＋E)n（4）X(原始模板數(shù))的計算一旦效率確定后，根據(jù)公114X的另一種計算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對數(shù)形式，以所測定的Yn值的對數(shù)對函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當n＝0時，可在圖上讀出X值，或通過對公式（5）的線性回歸計算X值（圖2）。X的另一種計算方式(1)另一種方式是，根據(jù)公115定量聚合酶鏈反應PCR測定技術山東臨床檢驗中心課件116動力學方法的特點

這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；（2）如果能測定PCR產(chǎn)物分子的絕對數(shù)量，則可得到待測樣本的不同的擴增效率（Ee)。動力學方法的特點這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；117使用非競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

非競爭性內(nèi)標準：（1）一般為與靶核酸無關的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無相同的引物結合位點和擴增序列。對于DNA的擴增，非競爭性內(nèi)標幾乎所有的基因都可應用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動蛋白的基因。而對RNA的擴增，則非競爭性內(nèi)標較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標應該在整個細胞周期中表達的水平變化不大，此外，其表達水平應接近于靶RNA，而且它們的擴增效率應相等，因此兩者擴增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來作為此種內(nèi)標，如HLA、β肌動蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。使用非競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法非競爭性內(nèi)標準：（1）一118以非競爭性內(nèi)標定量的主要優(yōu)點內(nèi)標的制備簡單復管測定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。以非競爭性內(nèi)標定量的主要優(yōu)點內(nèi)標的制備簡單119以非競爭性內(nèi)標定量的缺點內(nèi)標準和靶核酸的逆轉錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對的是相同的靶核酸逆轉錄效率也會有很大差異。因此，使用這種方法進行RNA的定量PCR測定極為困難。在擴增過程中的指數(shù)期測定可對原始模板相對定量，但如果沒有驗證在一定的擴增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標有相同的擴增效率，則不能進行絕對定量。以非競爭性內(nèi)標定量的缺點內(nèi)標準和靶核酸的逆轉錄的效率有可能不120使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

“競爭性”內(nèi)標：人為構建的可與原始靶核酸競爭酶、核苷酸和引物分子的核酸標準，其特點是，與靶核酸具有相同的引物結合位點、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴增產(chǎn)物在檢測時能夠很容易地通過諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對內(nèi)標準的修飾方法包括對野生型基因組的點突變、部份缺失或插入外來順序等，目前尚無通用的規(guī)則或程序來構建這種內(nèi)標準。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法“競爭性”內(nèi)標：人為構建的121使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標既可進行相對定量也可進行絕對定量。相對定量具有很好的精密度和重復性。而絕對定量，關鍵是要證明競爭性內(nèi)標和野生型靶核酸的擴增效率相同。亦可將競爭性內(nèi)標置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時擴增來評價。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標既可進行相對定122使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進行數(shù)管競爭性PCR測定，每管中靶核酸的量不變，但改變競爭性內(nèi)標的量，因為只有當待測靶核酸與競爭性內(nèi)標等摩爾量時才能有可靠的定量。由于競爭性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準確的PCR定量方法，適用于絕對定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

使