及譯文-2010級(jí)第四組設(shè)計(jì)

封面書(shū)脊論文題目姓名北京航空航天大學(xué)封面書(shū)脊論文題目姓名北京航空航天大學(xué)北京航空航天大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（任務(wù)書(shū)Ⅰ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）題目：納米TiO2影響成骨細(xì)胞礦化成研究Ⅱ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：掌握細(xì)胞系傳代培養(yǎng)技術(shù)及相關(guān)溶液的配制及高壓滅菌方法，光學(xué)顯微鏡、分光光度計(jì)等基本儀器的使用，熟悉細(xì)胞樣品的收集、保存方法，根據(jù)染色操作步驟及相關(guān)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)和分析，掌握相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析軟件等。Ⅲ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）工作內(nèi)容：2萬(wàn)字。并在寒假期間完成，主要是為了熟悉課題相關(guān)內(nèi)容，進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì); 2、2014.3.4-2014.3.15：北京航空航天大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（任務(wù)書(shū)Ⅰ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）題目：納米TiO2影響成骨細(xì)胞礦化成研究Ⅱ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：掌握細(xì)胞系傳代培養(yǎng)技術(shù)及相關(guān)溶液的配制及高壓滅菌方法，光學(xué)顯微鏡、分光光度計(jì)等基本儀器的使用，熟悉細(xì)胞樣品的收集、保存方法，根據(jù)染色操作步驟及相關(guān)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)和分析，掌握相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析軟件等。Ⅲ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（）工作內(nèi)容：2萬(wàn)字。并在寒假期間完成，主要是為了熟悉課題相關(guān)內(nèi)容，進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì); 2、2014.3.4-2014.3.15：MEM培養(yǎng)基和相關(guān)試劑的配置以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的前期工作； 況。細(xì)胞與納米TiO2材料共培養(yǎng)； TiO2材料對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶的影響； 5、2014.5.23-2014.5.24:數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并撰寫(xiě) 。Ⅳ、主要參考資料：5、2014.5.23-2014.5.24:數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并撰寫(xiě) 。Ⅳ、主要參考資料：formingabilityandphotocatalyticactivityonatitaniumsubstrateformedbyplasmaelectrolyticoxidation.MaterSciEngCMaterBiolAppl.2013Dec1;33(8):4871-4875.[2]VictoriaFr?jd,PaulaLinderb?ck,AnnWennerberg,etal.EffectofnanoporousTiO2coatingandCa2+modificationoftitaniumsurfacesonearlymicrobialbiofilmformation.BMCOralHealth11:8[3]Yao,CPerlaV,McKenzieJL,etal.AnodizedTiandTi6Al4Vpossessingnanometersurfacefeaturesenhancesosteoblastadhesion.JournalofBiomedicalNanotechnology,2005,1(1):68-73[4]SatoM,AslaniA,SambitoMA,etal;Nanocrystallinehydroxyapatite/titaniacoatingsontitaniumimprovesosteoblastadhesion.JournalofBiomedicalMaterialsResearchA,2008,84A(1):265-272[5]BrammerKS,OhS,CobbCJ,etal.Improvedbone-formingfunctionalityondiameter-controlledTiO2nanotubesurface.ActaBiomaterialia,2009,5(8):3215-3223[6]ZhaoX,WangG,ZhengH,etal.DelicaterefinementofsurfacenanotopographybyadjustingTiO2coatingchemicalcompositionforenhancedinterfacial201328;5(16):8203-8209.ApplMaterInterfaces.生物與醫(yī)學(xué) 學(xué)院（系）生物工程專(zhuān)業(yè)類(lèi)101011班吳文毅畢業(yè)設(shè)計(jì)（）時(shí)間：年月日至年月日答辯時(shí)間：年月日成績(jī)：指導(dǎo)教師：教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分：生物與醫(yī)學(xué) 學(xué)院（系）生物工程專(zhuān)業(yè)類(lèi)101011班吳文毅畢業(yè)設(shè)計(jì)（）時(shí)間：年月日至年月日答辯時(shí)間：年月日成績(jī)：指導(dǎo)教師：教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分：系（教研室）（簽字：本人我及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的，在完成時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。作者：簽字：時(shí)間：2014年6月本人我及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的，在完成時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。作者：簽字：時(shí)間：2014年6月納米TiO2影響成骨細(xì)胞礦化成研究學(xué)生：吳文毅指導(dǎo)老師：王江雪摘要骨組織較匹配以及優(yōu)良的耐腐蝕性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的生物醫(yī)用金屬材料，常用作人工骨、人工關(guān)節(jié)、效果。因此，可對(duì)鈦合金植入體進(jìn)行表面改性來(lái)改善其表面理化性質(zhì)，改善植入效果。涂層是常用的表面改性。成骨細(xì)胞在骨形成的過(guò)程中發(fā)揮、納米TiO2影響成骨細(xì)胞礦化成研究學(xué)生：吳文毅指導(dǎo)老師：王江雪摘要骨組織較匹配以及優(yōu)良的耐腐蝕性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的生物醫(yī)用金屬材料，常用作人工骨、人工關(guān)節(jié)、效果。因此，可對(duì)鈦合金植入體進(jìn)行表面改性來(lái)改善其表面理化性質(zhì)，改善植入效果。涂層是常用的表面改性。成骨細(xì)胞在骨形成的過(guò)程中發(fā)揮、與骨組織相互作用的一部分，是有MC3T3-E1細(xì)胞系作為體外研究骨細(xì)胞增殖和礦材料進(jìn)行一段BCIP/NBTTiO2材料對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶的影響；材料對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響。：成骨細(xì)胞，鈦，二氧化鈦，礦化Theresearchaboutnano-titaniumdioxideaffectTheresearchaboutnano-titaniumdioxideaffectosteoblastmineralizationmatureTutor:JiangXueWangAbstractTitaniumanditsalloyshaveasmallproportionoftheelasticmodulusascomparedwithhumanbonetissuematchingandexcellentcorrosionresistanceandpatibility,etc.,iscurrentlythemostwidelyusedbiomedicalmetallicmaterials,commonlyusedforbone,artificialjoints,dentalimplants,andothertypesoforthopediccomponents.Butrelativelyspeakinghumantissue,titaniumimplantmaterialremainsoutsidethebody,thehumanbodycannotbefullyaccepteditsbiologicallyinert,formingametalionreleaseandabrasive,willaffectthenormaluseoftheeffectoftheimplant.Thus,thesurfaceoftitaniumimplantsurfacemodifiedtoimproveitsphysicochemicalproperties,theeffectofimprovingtheimplantation.TiO2coatingsontitaniumalloysurfacemodificationisacommonmeansofsurfacemodification.Osteoblastcellsplayintheprocessofboneformationinanimportantroleinboneformationisamajorfunctionofthecellsresponsibleforbonematrixsynthesis,secretionandmineralization.Therefore,toexploretheimpactofTiO2onintomatureosteoblastsmineralizationaspartofTiO2andexploretheinteractionofbonetissue,ismeaningful.MouseosteoblasticcelllineMC3T3-E1hasexcellentosteogenicdifferentiationpotential,serumandascorbicacidtostimulatetheirdifferentiationintoosteoblasts.So,thisexperimentMC3T3-E1celllineasamodelforinvitrocellproliferationandmineralization,withdifferentiationmediumwillthenco-culturedcellsandnano-TiO2materialovertimein24-wellplatesor6-wellplates,usingtheBCIP/NBTassaynanoTiO2materialscellalkalinephosphatase;usingalizarinRedstainingonosteoblastmineralizationnoduleswerenoduleswerestainedforcountingunderanopticalmicroscopeanalysis.TheresultsareusedtoassesstheimpactofTiO2materialsonosteoblastmineralization.Keywords:Osteoblasts,titanium,titaniumdioxide,mineralization目錄摘要 IAbstract II1緒論 1課題背景 1植入體與骨組織相接觸 1成骨細(xì)胞在骨形成中的主要作用與特性 2課題的研究目的及意義 3課題研究現(xiàn)狀 4實(shí)驗(yàn)材料和方法 6MEM培養(yǎng)基和相關(guān)試劑的配置 6MEM培養(yǎng)基配置 6目錄摘要 IAbstract II1緒論 1課題背景 1植入體與骨組織相接觸 1成骨細(xì)胞在骨形成中的主要作用與特性 2課題的研究目的及意義 3課題研究現(xiàn)狀 4實(shí)驗(yàn)材料和方法 6MEM培養(yǎng)基和相關(guān)試劑的配置 6MEM培養(yǎng)基配置 6含血清的MEM培養(yǎng)基配置 6分化培養(yǎng)基配置 6PBS緩沖液 6含EDTA的0.25%胰酶的配制 622.1.64%多聚的配置 6細(xì)胞復(fù)蘇 7細(xì)胞傳代 72.4納米TiO2懸液....................................................................................................................................................72.5細(xì)胞接種 82.6納米TiO2材料懸液的........................................................................................................................................82.7納米TiO2材料與細(xì)胞共培養(yǎng) 8堿性磷酸酶染色 9實(shí)驗(yàn)原理 9實(shí)驗(yàn)步驟 9茜素紅染色法對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行染色 9實(shí)驗(yàn)原理 9實(shí)驗(yàn)步驟 10結(jié)果與討論 11實(shí)驗(yàn)結(jié)果 11細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的情況 11堿性磷酸酶染 況 1133.1.3茜素紅染況 133.2實(shí)驗(yàn)討論 143.2.1情況一： 143.2.2情況二： 143.2.3綜合討論： 15實(shí)驗(yàn)結(jié)論 16456致謝 1756致謝 17參考文獻(xiàn) 181 緒論1.1課題背景骨組織較匹配以及優(yōu)良的耐腐蝕性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的生物醫(yī)用金屬材料，常用作人工骨、人工關(guān)節(jié)、種植牙、矯形組件等。據(jù)介紹,全球每年有超過(guò)1000噸的鈦被用在各種醫(yī)療設(shè)備中，并植入患者體內(nèi)，這是因?yàn)獒t(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為鈦合金設(shè)備較耐腐蝕,是植入體內(nèi)的良好材料。但相對(duì)金屬離子的伯明翰大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究的植入效果及使用。在鈦基底上一種多功能多孔二氧化鈦（TiO2）涂層的方法。這種高結(jié)晶性的TiO2表面-凝膠納米1 緒論1.1課題背景骨組織較匹配以及優(yōu)良的耐腐蝕性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的生物醫(yī)用金屬材料，常用作人工骨、人工關(guān)節(jié)、種植牙、矯形組件等。據(jù)介紹,全球每年有超過(guò)1000噸的鈦被用在各種醫(yī)療設(shè)備中，并植入患者體內(nèi)，這是因?yàn)獒t(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為鈦合金設(shè)備較耐腐蝕,是植入體內(nèi)的良好材料。但相對(duì)金屬離子的伯明翰大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究的植入效果及使用。在鈦基底上一種多功能多孔二氧化鈦（TiO2）涂層的方法。這種高結(jié)晶性的TiO2表面-凝膠納米TiO2涂層可以以提高 軟組織的附著，但他們對(duì)口腔細(xì)菌的粘附和生物膜形成的[2]。1.1.1植入體與骨組織相接觸植入體植入后與周?chē)M織發(fā)生反應(yīng)，最終形成植入體-骨界面，產(chǎn)生結(jié)合。植入體的成功主要取決于植入體-骨界面的形成。在植入體-骨界面形成的過(guò)程中，周?chē)M織中的細(xì)胞遷移、貼附并生長(zhǎng)到植入體表面對(duì)界面的形成。因此，納米TiO2研究小組發(fā)現(xiàn)將成骨細(xì)胞接種在TiO2納米管處理的鈦箔表面比處理的鈦箔表面生堿性磷酸酶和膠原"促進(jìn)鈣沉積[3-4]。長(zhǎng)的成骨細(xì)胞更容易黏附。鋪展"并Brammer等發(fā)現(xiàn)植入體表面的管狀納米TiO2的管徑越大（100nm左右），成骨細(xì)胞的鋪展能力越強(qiáng)，堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,ALP）的活性也越高。通過(guò)調(diào)整二氧TiO2涂層中加入適增殖[5]。在β-磷酸三鈣（β-TCP）和二氧化鈦（TiO2）構(gòu)建的陶瓷骨支架處，成骨標(biāo)志接觸的的組織/細(xì)胞造成[16]。1.1.2Brammer等發(fā)現(xiàn)植入體表面的管狀納米TiO2的管徑越大（100nm左右），成骨細(xì)胞的鋪展能力越強(qiáng)，堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,ALP）的活性也越高。通過(guò)調(diào)整二氧TiO2涂層中加入適增殖[5]。在β-磷酸三鈣（β-TCP）和二氧化鈦（TiO2）構(gòu)建的陶瓷骨支架處，成骨標(biāo)志接觸的的組織/細(xì)胞造成[16]。1.1.2成骨細(xì)胞在骨形成中的主要作用與特性、和礦化。骨不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過(guò)程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，移行至被吸收部位，持正常骨量的關(guān)鍵。成骨細(xì)胞于多能的骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞，在骨形成過(guò)程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增、Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結(jié)節(jié)。骨基質(zhì)（主要成分為I型膠原、糖蛋白、成骨細(xì)胞幾乎所有骨基質(zhì)成分，并的堿性磷酸酶20～24小時(shí)。抑制與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的會(huì)導(dǎo)致增殖的停止。MC3T3-E1，MC3T3-E1具有極好的成骨分化潛能，血清、β磷酸甘油和抗壞血酸即可刺激其向骨細(xì)胞分化[7]。此細(xì)胞系可長(zhǎng)個(gè)非常方便的體外研究骨細(xì)胞增殖和礦化的細(xì)胞模型。1.2課題的研究目的及意義量子前景，在諸如靶向[8]MC3T3-E1，MC3T3-E1具有極好的成骨分化潛能，血清、β磷酸甘油和抗壞血酸即可刺激其向骨細(xì)胞分化[7]。此細(xì)胞系可長(zhǎng)個(gè)非常方便的體外研究骨細(xì)胞增殖和礦化的細(xì)胞模型。1.2課題的研究目的及意義量子前景，在諸如靶向[8]。、據(jù)介紹,全球每年有超過(guò)1000噸的鈦被用在各種醫(yī)療設(shè)備中,并植入患者體內(nèi)。這是因?yàn)獒t(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為鈦合金設(shè)備較耐腐蝕,易在組織/內(nèi)沉積，而不易被巨噬細(xì)胞清除，從而對(duì)植入?yún)^(qū)域周?chē)慕M織/細(xì)胞造成效應(yīng)并可能隨體液循環(huán)分布至全身其他部位,進(jìn)一步對(duì)各功能組織 功能帶來(lái)不良影響。鈦及鈦氧化物材料作為植入體對(duì)于所產(chǎn)生的影響不容忽視。骨組織是關(guān)[9]。MC3T3-E1BCIP/NBTTiO2材TiO2對(duì)成骨細(xì)胞礦化成TiO2在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的合理安全應(yīng)用提供依據(jù)。影響進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步1.3課題研究現(xiàn)狀MC3T3-E1細(xì)胞的寸[10]BCIP/NBTTiO2材TiO2對(duì)成骨細(xì)胞礦化成TiO2在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的合理安全應(yīng)用提供依據(jù)。影響進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步1.3課題研究現(xiàn)狀MC3T3-E1細(xì)胞的寸[10],MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、成骨分化及其礦化功能的影響有所不同：20nm的金納細(xì)胞的狀態(tài)有影響[11]TiO2材料進(jìn)行了研究：納米iO2容易進(jìn)入生物體并且與生物體的組織(等相互作用，從而造成細(xì)胞和組織的功能異常，進(jìn)而影響生物體健康[12]TiO2一直被的20nmTiO2TiO2更為嚴(yán)等[13]20nm200nmTiO2顆粒做了大鼠亞慢性吸入等[14]研究表明陶瓷骨支架材料制成的β-磷酸三鈣（β-TCP）和二氧化鈦（TiO2）構(gòu)建的支架——支架具有作為成骨活性的和促進(jìn)形成新的骨組織，從而可以成為一種非常有前途的對(duì)長(zhǎng)骨再生的仿生支架材料。TiO2的羥基磷灰石的TiO25TiO2TiO2的羥基磷灰石的TiO25TiO2納米天內(nèi)先管陣列，而不是那些沒(méi)有預(yù)先羥基磷灰石羥基磷灰石的能力有所提高。但是，對(duì)成骨細(xì)胞礦化機(jī)制影響的研究卻不多。22.1MEM培養(yǎng)基和相關(guān)試劑的配置2.1.1MEM培養(yǎng)基配置NaHCO32.2g、Hepes2g0.066g0.154gMEM培養(yǎng)基（Gibco）干粉加入燒杯中，加入22.1MEM培養(yǎng)基和相關(guān)試劑的配置2.1.1MEM培養(yǎng)基配置NaHCO32.2g、Hepes2g0.066g0.154gMEM培養(yǎng)基（Gibco）干粉加入燒杯中，加入1000mL去離子水，磁力攪拌至完全溶解。使0.22μm濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基，過(guò)濾后的培養(yǎng)基裝入試劑瓶，用。4℃儲(chǔ)存?zhèn)?.1.2MEM培養(yǎng)基配置加入體的胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)MEM培養(yǎng)基中混勻。2.1.3分化培養(yǎng)基配置MEM培養(yǎng)基（MEM+10%FBS）1ml1mol/Lβ甘油磷酸鈉(Sigma-Flua0.1mlVc（抗壞血酸，并將整系充分混勻。2.1.4PBS緩沖液、KCl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g900mL去離子12620min，取出放入無(wú)菌操作臺(tái)冷卻至室溫，以 膜封好瓶蓋后放入冰箱4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｅ浞剑?00mlPBS，0.25g胰酶，EDTA100mlPBS中，在冰浴中期保存，或4℃短期內(nèi)用完。2.1.64%多聚的配置1）20.0g多聚粉末。亮為止。pH7.2~7.4。PBS亮為止。pH7.2~7.4。PBS500ml。2.2細(xì)胞復(fù)蘇1)37C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（MEM+10%FS2)3)4)5)37C水浴快速解凍（解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，800-1000rpm5min；棄上清，加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻；6）第二天，用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng)2.3細(xì)胞傳代37C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（MEM+10%FS2-5mlPBS1ml胰酶消化細(xì)胞；3)5ml（MEM+10%FBS）終止消化；4)5)6)用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散；800rpm5min；15-20ml的培養(yǎng)基（含血清）T75培養(yǎng)瓶中或按7)要進(jìn)行換液的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)平均每3天換液一次。10mg50mL離心管中，高壓滅菌。牛血清白蛋白(BSA)40mLPBS緩沖液，渦旋溶解。0.22μm的濾器過(guò)濾。TiO20.22μm的濾器過(guò)濾。TiO2懸液。2.5細(xì)胞接種1）將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基用移液槍吸出，在培養(yǎng)瓶中加入適量胰酶進(jìn)行消化，大約半分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞基本變圓而不再貼壁時(shí)，37℃培養(yǎng)箱中適當(dāng)孵育幾分鐘。2）用移液槍將消化好的細(xì)胞吸出放在15ml離心管中，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分細(xì)胞已經(jīng)在新培養(yǎng)基中充分分散。3）10-50倍，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算出離心管中細(xì)胞的總數(shù)。4）24孔板上接種的細(xì)胞密度為：3×104細(xì)胞/孔，6孔板上接種的細(xì)胞密度為：2×105細(xì)胞/孔。在細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿孔板底部的時(shí)候，才可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。材料：1號(hào)材料10.1mg；2號(hào)材料10.3mg；4號(hào)材（BSA）PBS1mg/mlTiO240:1。50246孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿TiO2材料懸細(xì)胞狀態(tài)并7天。堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)原理BCIP/NBT法進(jìn)行堿性磷酸酶染CIP/NBT是堿性磷酸酯酶的常用底物。在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會(huì)被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深以對(duì)細(xì)胞是否了堿性磷酸酶做一個(gè)初步的定性判斷。2.8.2實(shí)驗(yàn)步驟1）本試劑盒是從北京碧云天生物技術(shù)，按照如下比例依次加入各溶液，混勻后即配制成BCIP/NBT染色工作液：堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)原理BCIP/NBT法進(jìn)行堿性磷酸酶染CIP/NBT是堿性磷酸酯酶的常用底物。在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會(huì)被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深以對(duì)細(xì)胞是否了堿性磷酸酶做一個(gè)初步的定性判斷。2.8.2實(shí)驗(yàn)步驟1）本試劑盒是從北京碧云天生物技術(shù)，按照如下比例依次加入各溶液，混勻后即配制成BCIP/NBT染色工作液：PBS4%多聚溶液固定，然后把孔板放入4℃冰箱保存。PBS3次。3)最后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。4)室溫避光孵育5-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí))，直至顯色至預(yù)期深淺。BCIP/NBT1-2次即可終止顯色反應(yīng)。6)將染色后的孔板放在顯微鏡下觀察，并拍照。初步評(píng)判堿性磷酸酶細(xì)胞的個(gè)數(shù)以及整個(gè)孔板中堿性磷酸酶的量。茜素紅染色法對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞茜素紅（AlizarinredS）鈣染色試劑是一種旨在通過(guò)鰲和技術(shù)，使鈣離子和茜技術(shù)方法。堿性磷酸酯酶顯色緩沖液10mlBCIP溶液(300X)33μlNBT溶液(150X)66μlBCIP/NBT染色工作液10.1ml（Anthraquinone）衍生物：9,10-二氫-3,4-二羥基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸單鈉鹽，又稱(chēng)媒介紅3（MordantRed3;）或茜素磺酸鈉（Sodiumaliariesulonate（Anthraquinone）衍生物：9,10-二氫-3,4-二羥基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸單鈉鹽，又稱(chēng)媒介紅3（MordantRed3;）或茜素磺酸鈉（Sodiumaliariesulonate量為342.25。茜素紅和鈣離子以鰲和擾，比如Mg2+就是一種常見(jiàn)的干擾。有兩種常見(jiàn)的茜素紅染液的配置方法：茜素紅粉末加入0.1M的Tris-HCL100ml中配制 pH8.32)40mM茜素紅染液，茜素紅粉末用去離子水配制后用氫氧化銨調(diào)制 pH4.1-4.3的染色比如性的染色液會(huì)使鈣質(zhì)溶解，導(dǎo)致染色效果差甚至假，所以一般采用堿性的染色液，此外，堿性的染色液通?？梢栽黾尤旧珪r(shí)間，長(zhǎng)的甚至可以達(dá)1h以上，以此來(lái)獲得比果。本實(shí)驗(yàn)采用第一種染液，1%茜素紅染液，pH8.3。2.9.2實(shí)驗(yàn)步驟6孔板中將細(xì)胞與納米TiO2材料共培養(yǎng)21天將待染細(xì)胞的孔板用PBS2遍，4%多聚溶液固定細(xì)胞，固定后的細(xì)胞放入4℃的冰箱中。固定完畢后取出孔孔板放至顯微鏡下觀察。3結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的情況在細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的過(guò)程中，我根據(jù)文獻(xiàn)中提到的“三天更換一次分化培養(yǎng)基”每隔三天給細(xì)胞換液。但是，前期的兩批實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞都在第6、7天了。細(xì)胞現(xiàn)象比較像缺乏營(yíng)養(yǎng)的，情狀為：1.培養(yǎng)基顏色變黃，比較像營(yíng)養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基。2.細(xì)胞主要從邊緣開(kāi)始成片的脫落；少數(shù)孔中也有中間細(xì)胞成片脫落的。3.細(xì)胞體積變小，由以前的梭4.基也無(wú)法增殖，而是逐漸。第三批實(shí)驗(yàn)還是選用“三天更換一次分化培養(yǎng)基”的方法，這次1、3結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的情況在細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的過(guò)程中，我根據(jù)文獻(xiàn)中提到的“三天更換一次分化培養(yǎng)基”每隔三天給細(xì)胞換液。但是，前期的兩批實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞都在第6、7天了。細(xì)胞現(xiàn)象比較像缺乏營(yíng)養(yǎng)的，情狀為：1.培養(yǎng)基顏色變黃，比較像營(yíng)養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基。2.細(xì)胞主要從邊緣開(kāi)始成片的脫落；少數(shù)孔中也有中間細(xì)胞成片脫落的。3.細(xì)胞體積變小，由以前的梭4.基也無(wú)法增殖，而是逐漸。第三批實(shí)驗(yàn)還是選用“三天更換一次分化培養(yǎng)基”的方法，這次1、2、6號(hào)材料與細(xì)胞共培養(yǎng)的孔板中的細(xì)胞全部部分細(xì)胞，于是選擇暫時(shí)用這一批孔板的4號(hào)材料與細(xì)胞共培養(yǎng)的孔來(lái)進(jìn)行堿性磷酸酶染色，以得到一個(gè)初期的結(jié)果。3.1.2堿性磷酸酶染況4號(hào)材料（實(shí)驗(yàn)組）未加材料（對(duì)照組）40倍100倍200倍圖中部分基本為細(xì)明有輪廓的部分為未是堿性磷酸酶的量太少或細(xì)胞破損使堿性磷酸酶流出等原因，染色不明顯。100倍200倍圖中部分基本為細(xì)明有輪廓的部分為未是堿性磷酸酶的量太少或細(xì)胞破損使堿性磷酸酶流出等原因，染色不明顯。3.1.3茜素紅染況4號(hào)材料（實(shí)驗(yàn)組）未加材料（對(duì)照組）40倍200倍3.1.3茜素紅染況4號(hào)材料（實(shí)驗(yàn)組）未加材料（對(duì)照組）40倍200倍實(shí)驗(yàn)組中染成紅色的結(jié)節(jié)要略多于對(duì)照組。圖中還有一些不平整的小突起，但卻沒(méi)有明螯 紅色物質(zhì)并沉積，也可以和其它陽(yáng)離子結(jié)合，比如Mg2+，但是在成骨細(xì)胞的分染色后的顏色相比，其它離子的染色顏色會(huì)較為不明顯。實(shí)驗(yàn)還對(duì)同一批次，4個(gè)6孔板中的添加4號(hào)材料組和未添加材料組的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行了計(jì)數(shù)分析：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組的平均礦化結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)要多于對(duì)照組，但是由于同組實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)差距比較大，而且每組實(shí)驗(yàn)一共只有4個(gè)數(shù)據(jù)，所以數(shù)據(jù)的性不高。實(shí)驗(yàn)討論情況一：從MC3T3-E1細(xì)胞系在向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，是需要早進(jìn)入后的下一次換液，所以細(xì)胞大部分都由于營(yíng)養(yǎng)不良而。而4號(hào)納米TiO2材料對(duì)細(xì)胞系向成骨細(xì)胞分化有抑制作用，但對(duì)細(xì)胞的健康并沒(méi)有多大害處，不太設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)量梯度，以此來(lái)判定是否猜想正確（如果營(yíng)養(yǎng)足夠充分，那么1、2、6號(hào)材料與細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞能存堿性磷酸酶的細(xì)胞會(huì)比不加材料的孔板中堿性磷酸酶的細(xì)胞數(shù)量多，染色后顯微鏡下能觀察到行了計(jì)數(shù)分析：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組的平均礦化結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)要多于對(duì)照組，但是由于同組實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)差距比較大，而且每組實(shí)驗(yàn)一共只有4個(gè)數(shù)據(jù)，所以數(shù)據(jù)的性不高。實(shí)驗(yàn)討論情況一：從MC3T3-E1細(xì)胞系在向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，是需要早進(jìn)入后的下一次換液，所以細(xì)胞大部分都由于營(yíng)養(yǎng)不良而。而4號(hào)納米TiO2材料對(duì)細(xì)胞系向成骨細(xì)胞分化有抑制作用，但對(duì)細(xì)胞的健康并沒(méi)有多大害處，不太設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)量梯度，以此來(lái)判定是否猜想正確（如果營(yíng)養(yǎng)足夠充分，那么1、2、6號(hào)材料與細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞能存堿性磷酸酶的細(xì)胞會(huì)比不加材料的孔板中堿性磷酸酶的細(xì)胞數(shù)量多，染色后顯微鏡下能觀察到細(xì)胞。3.2.2情況二：細(xì)菌生長(zhǎng)（已知：低濃度的環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)胞的毒性很小，但仍然對(duì)細(xì)菌有抑制效果，養(yǎng)分，對(duì)細(xì)胞形成了競(jìng)爭(zhēng)性抑制，導(dǎo)致細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)不良而。細(xì)胞個(gè)數(shù)/個(gè)平均/個(gè)未添加材料（對(duì)照組）551467.54號(hào)材料（實(shí)驗(yàn)組）918121012.253.2.3綜合討論：TiO2材料共培養(yǎng)后，極大可能是因?yàn)槿狈I(yíng)前批細(xì)胞全部染菌的概率應(yīng)該是很小的。其次，第三批細(xì)胞染菌后4號(hào)材料所在的4號(hào)材料是抑制其向成骨細(xì)胞方向分化的。根據(jù)之前的文獻(xiàn)調(diào)研我發(fā)現(xiàn)：納米3.2.3綜合討論：TiO2材料共培養(yǎng)后，極大可能是因?yàn)槿狈I(yíng)前批細(xì)胞全部染菌的概率應(yīng)該是很小的。其次，第三批細(xì)胞染菌后4號(hào)材料所在的4號(hào)材料是抑制其向成骨細(xì)胞方向分化的。根據(jù)之前的文獻(xiàn)調(diào)研我發(fā)現(xiàn)：納米TiO2材料有時(shí)對(duì)TiO2材料能MC3T3細(xì)胞系向成骨細(xì)胞方向分化的胞系向成骨細(xì)胞方向分化的iO2猜想正確的可能性比較大。值得我們探究了。我將在接下來(lái)的時(shí)間中盡量探明這個(gè)問(wèn)題。（目前實(shí)驗(yàn)還沒(méi)有全部做完，以上只是）4照組）比與4號(hào)材料共培養(yǎng)的細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）4號(hào)材料刺激的細(xì)胞只有較為少數(shù)的細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。而茜素紅染色試驗(yàn)中，4照組）比與4號(hào)材料共培養(yǎng)的細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）4號(hào)材料刺激的細(xì)胞只有較為少數(shù)的細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。而茜素紅染色試驗(yàn)中，Ca2+以外的其它離子的干擾；對(duì)礦化結(jié)節(jié)的計(jì)數(shù)分析由于數(shù)據(jù)差距較大且整體數(shù)據(jù)量較小，所以度不高。根據(jù)上述結(jié)果與分析我得出結(jié)論：MC3T3-E1細(xì)胞系向成骨細(xì)胞方向分化的能力。材料有利于成骨細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)的形成。材料對(duì)成骨細(xì)胞的整個(gè)礦化成熟過(guò)程來(lái)說(shuō)，起抑制作用。5致謝在本次實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，指導(dǎo)老師王江雪給我提供了很大的幫助，不僅是從學(xué)術(shù)指導(dǎo)上，而且在實(shí)驗(yàn)的操作以及實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備過(guò)程中，都悉心教導(dǎo)，傳授經(jīng)驗(yàn)；并且這個(gè)課題的來(lái)源也是王老師辛苦調(diào)研文獻(xiàn)所得，在此我要向她表達(dá)衷心的感謝。還有北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)給我提供的幫助，實(shí)驗(yàn)的場(chǎng)地、儀器以及一切經(jīng)費(fèi)均由此承擔(dān)，沒(méi)有學(xué)校的支持我完成不了實(shí)驗(yàn)，在此也要送上我衷心的感謝。5致謝在本次實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，指導(dǎo)老師王江雪給我提供了很大的幫助，不僅是從學(xué)術(shù)指導(dǎo)上，而且在實(shí)驗(yàn)的操作以及實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備過(guò)程中，都悉心教導(dǎo)，傳授經(jīng)驗(yàn)；并且這個(gè)課題的來(lái)源也是王老師辛苦調(diào)研文獻(xiàn)所得，在此我要向她表達(dá)衷心的感謝。還有北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)給我提供的幫助，實(shí)驗(yàn)的場(chǎng)地、儀器以及一切經(jīng)費(fèi)均由此承擔(dān)，沒(méi)有學(xué)校的支持我完成不了實(shí)驗(yàn)，在此也要送上我衷心的感謝。66formingabilityandphotocatalyticactivityonatitaniumsubstrateformedbyplasmaelectrolyticoxidation.MaterSciEngCMaterBiolAppl.20131;33(8):4871-4875.anodizedCa2+modificationoftitaniumsurfacesonearlymicrobialbiofilmformation.BMCOralHealth2011,11:8.[3]Yao,CPerlaV,McKenzieJL,etal.AnodizedTiandTi6Al4Vpossessingnanometersurfacefeaturesenhancesosteoblastadhesion.JBN,2005,1(1):68-73.SatoM,AslaniA,SambitoMA,etal;Nanocrystallinehydroxyapatite/titaniacoatingsontitaniumosteoblastadhesion.JBiomedMaterResA,2008,84A(1)