免疫學技術和臨床-課件

免疫學技術和臨床免疫學技術和臨床內(nèi)容摘要什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫分析的基本概念如何去設計一個免疫分析試劑免疫分析對臨床意義的改變Access2介紹內(nèi)容摘要什么是免疫分析的表現(xiàn)什么是免疫分析的表現(xiàn)什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫檢測的分析表現(xiàn)準確性精密度靈敏度特異性檢測線性范圍試劑穩(wěn)定性定標周期開瓶效期免疫檢測的分析表現(xiàn)準確性檢測線性范圍免疫分析檢測的臨床表現(xiàn)臨床靈敏度和特異性是分析結果準確性的臨床表現(xiàn):理想狀態(tài)健康人群疾病人群靈敏度100%特異性~60%特異性100%靈敏度~50%靈敏度增加特異性增加假陰性假陽性Cut-off設置cutoff值在此處用于篩查分析設置cutoff值在此處減少錯誤診斷帶來的高花費設置cutoff值在此處為了最少化錯誤結果免疫分析檢測的臨床表現(xiàn)臨床靈敏度和特異性是分析結果準確性的臨關于分析試劑的檢測靈敏度的定義分析及功能靈敏度分析靈敏度(AnalyticalSensitivity)使用A點標準品分析內(nèi)的測試最低可辨別0值的功能分析試劑的理論上的極限功能靈敏度(FunctionalSensitivity)一系列不同厚度的標準品分析間的測試,用<20%的CV值來分用來描述分析的臨床表現(xiàn)用人血清分析多于20天,且用多個試劑批號和儀器關于分析試劑的檢測靈敏度的定義分析及功能靈敏度分析表現(xiàn)特點:

正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）分析表現(xiàn)特點:

正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）免疫分析的基本概念免疫分析的基本概念免疫分析的經(jīng)典定義免疫分析（Immunoassay）是一種技術用于檢測和/或定量Y抗體（Antibody）通過一個特殊的只能和被分析物結合的抗體抗原（Antigen）免疫分析的經(jīng)典定義免疫分析（Immunoassay）是一免疫學測定的中心問題作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關鍵如何選擇好一個抗體去檢測一個被檢物質(zhì)，而不與非常相似結構的其它物質(zhì)有交叉反應，或漏掉須反應的物質(zhì)，這是分析設計的重中之重抗體的量必須恰當，過多會引起復合物的溶解免疫學測定的中心問題作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分關于抗體的親合力抗體除了要求純度外（單價特異性）還必須要求親合力，效價指抗體的量，親合力指抗體的質(zhì)在非競爭免疫反應的方式中抗體親和力比標記物的最低檢測極限更能影響分析的靈敏度在競爭法免疫反應的方式中抗體親和力直接關系到競爭的結果對于樣品中的干擾物質(zhì),親合力影響分析的抗干擾的能力關于抗體的親合力抗體除了要求純度外（單價特異性）還必須要求親免疫分析的工作定義免疫分析(Immunoassay)是一種測試方式,使用特殊的抗體與被檢測物質(zhì)的結合,此被檢測物質(zhì)不能通過簡單的化學方法所容易檢測到的.

通常在檢測系統(tǒng)中會使用到一種叫標記物（labeling）的物質(zhì),常標記在抗體上通常會有一個分離（separation）的過程在最后讀取信號前總是需要去仔細關注一下分析的方式（format）免疫分析的工作定義免疫分析(Immunoassay)是一種Access的技術免疫分析-“what＂檢測技術化學發(fā)光分離技術磁性顆粒分析方式靈活-“how＂}分析方式檢測技術分離技術Access的技術免疫分析-“what＂-“how＂檢測技術免疫分析檢測技術(Detection)有許多可用的方法應用一些“標記物＂所產(chǎn)生的一些能量進行測定標記物可以或可以不被激活而產(chǎn)生能量通過一些相應的檢測器對標記物產(chǎn)生的能量進行測定分離技術分析方式檢測技術免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay)優(yōu)勢優(yōu)秀的靈敏度較寬的檢測線性范圍局限性標記物的半衰期短試劑效期短檢測結果的重現(xiàn)性差每次檢測都要做標準曲線分析的反應時間長，半天~2天發(fā)射性污染有害很難實現(xiàn)自動化檢測放射免疫分析(Radioimmunoassay)優(yōu)勢熒光熒光素(Fluorophores)FIA，DELFIA原理熒光底物,4-MUP，或熒光標記物，鑭系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+吸收光為一個短波長的光，而發(fā)射光為一個長波長的光通過熒光計檢測優(yōu)勢與RIA具有相似的靈敏度和檢測線性范圍避免了RIA對危害污染物處理的麻煩和半衰期短的問題局限性可能會有來自樣品中的一些自身熒光物質(zhì)或短壽命的熒光物質(zhì)的干擾需用空白對照，速率法或推遲讀數(shù)來克服熒光熒光素(Fluorophores)FIA，DEL酵-顏色的變化酵(Enzymes)-EIA

原理在免疫分析結束后通過催化所加入的酵底物典型的催化反應包括顏色的變化,用分光光度計進行檢測優(yōu)勢非常容易使用的技術用于一些定性的分析局限性對定量分析所要求的靈敏度和寬線性難以實現(xiàn)ELISA技術必須每次定標試劑部分成分要復溶重組反應時間較長酵-顏色的變化酵(Enzymes)-EIA

化學發(fā)光化學發(fā)光物質(zhì)-CLEIA

原理不穩(wěn)定的分子通過加入一些化學基團變得很穩(wěn)定,而移去這些起穩(wěn)定作用的化學基團后,分子結構變得不穩(wěn)定發(fā)出光（pH的改變，酵切作用，電激發(fā)等）優(yōu)勢具備RIA所擁有的優(yōu)勢(靈敏度和寬線性),但排除其缺點用一個簡單的光度計讀數(shù)非常低的背景干擾類型閃爍(flash),持續(xù)(glow)發(fā)光發(fā)光物質(zhì)的穩(wěn)定性水溶液中的穩(wěn)定性化學發(fā)光化學發(fā)光物質(zhì)-CLEIA

化學發(fā)光物質(zhì)AMPPD,Dioxetane(Lumi-Phos530TM)-最穩(wěn)定的化學發(fā)光物質(zhì)（第三代）第一代：魯米那第二代：丫啶酯類，三聯(lián)啶釕代表性分析系統(tǒng)貝克曼庫爾特-Access/Access2/DxI800終點讀數(shù),更穩(wěn)定RLU00510

時間(分鐘)5560化學發(fā)光物質(zhì)AMPPD,Dioxetane(Lumi-PACCESS化學發(fā)光標記物的特點很寬的檢測線性范圍可檢測到6個數(shù)量級(例如:1-100,000units)

極高的靈敏度可檢測到小到10-21摩爾/升

很底的背景干擾對于一些超敏分析項目,有相當接近零值的背景信號

更超強的試劑穩(wěn)定性試劑效期開瓶效期定標周期ACCESS化學發(fā)光標記物的特點很寬的檢測線性范圍分離技術免疫分析檢測技術分離技術(Separation)有很多方式典型的是,特異性結合的分析物被保留而未結合物質(zhì)和無用的反應物被清除分析方式分離技術免疫分析技術的創(chuàng)新微粒子包被珠包被微孔包被管包被技術的創(chuàng)新微粒子包被珠包被微孔包被管包被磁顆粒包被技術磁顆?？贵w包被技術磁顆粒均勻的懸浮于整個反應體系分析物在磁顆粒表面捕獲磁顆粒在磁場中被清洗磁顆粒重新懸浮十分容易

優(yōu)勢快速的反應動力學較少的樣品量提高檢測的靈敏度極好的批內(nèi)重顯性可以探針取放，實現(xiàn)自動化磁顆粒包被技術磁顆?？贵w包被技術分析方式免疫分析檢測技術分離技術分析方式-有很多種方式可定義為分析的“處方＂設置一個最優(yōu)化的方式(可變量)去最優(yōu)化項目的臨床應用分析方式免疫分析分析方式可變量夾心法(Sandwich)vs.競爭法(competitive)標記物的放置同步(Simultaneous)vs.分步(sequential)試劑/樣品加入的順序孵育的次數(shù)(步驟)清洗分離的次數(shù)(步驟)試劑/樣品的體積/厚度孵育的時間孵育的溫度分析方式可變量Access的分析方式基本分析方式夾心法(Sandwich)競爭結合(Competitivebinding)試劑的加入，孵育和清洗同步(Simultaneous)(1步,1次清洗)分步(Sequential)(2步,2次清洗)“Piggyback＂(2步,1次清洗)Access的分析方式基本分析方式夾心法分析方式捕捉抗體(Captureantibody)和標記抗體(labeledantibody)每個不同的抗體可以針對不同的抗原決定簇，或二個在同一個抗原決定簇分析更特異因為二個抗體同時反應適合于檢測大分子物質(zhì)

bhCG TSH IgE ProlactinFSH LH Ferritin HBsAg夾心法分析方式捕捉抗體(Captureantibody)和競爭法分析方式只有捕捉抗體

主要針對小分子物質(zhì)檢測沒有足夠表面積的分析物去符合“夾心法＂要求T3 FT3B12DigoxinProgesteroneT4FT4FolateCortisol Estradiol競爭法分析方式只有捕捉抗體

T3 FT3B12如何去設計一個免疫分析試劑如何去設計一個免疫分析試劑一個免疫分析項目的誕生里程碑(Milestones)

市場調(diào)研確定需求項目的詳細特點要求確定分析方式研發(fā)和優(yōu)化證明分析表現(xiàn)符合項目的詳細特點要求(betasites,clinicalstudies)提交注冊一個免疫分析項目的誕生里程碑(Milestones)

項目臨床應用的要求臨床應用(claims)篩查（Screening）檢測（Detection）診斷（Diagnosis）分層（Staging）預后（Prognosis）監(jiān)測（Monitoring）項目臨床應用的要求臨床應用(claims)項目的臨床應用與分析表現(xiàn)必須到達的分析表現(xiàn)特徵靈敏度（Sensitivity）特異性（Specificity）精密度（Precision）線性范圍（Dynamicrange）其它項目的臨床應用與分析表現(xiàn)必須到達的分析表現(xiàn)特徵分析方式的選擇需考慮的因素

分析物的特徵體積（競爭法還是夾心法）厚度（一步法，二步法，反應時間等）潛在的“鉤狀效應＂（hookeffect）-假陰性解決的方法可以使用2步法方式樣品量和試劑量的平衡抗干擾能力儀器的能力／局限性預處理的要求分析方式的選擇需考慮的因素

試劑原材料的選擇原材料

抗體標準品封閉試劑（稀釋液）清洗緩沖液YYYYY試劑原材料的選擇原材料

YYYYY抗體的選擇單克隆(Monoclonal)和多克隆(polyclonal)

選擇的標準(criteria)特異性(Specificity)靈敏度(Sensitivity)供應能力(Supply)相關性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花費(Cost)抗體的選擇單克隆(Monoclonal)和多克隆(pol多克隆抗體(PolyclonalAntibodies)免疫動物獲得,如羊或兔時間長,復雜的制作流程注射,監(jiān)測滴度(可能反覆注射)周期性的抽血獲得特徵化(Characterization)和純化(purification)生產(chǎn)出＂雞尾酒＂式的抗體,針對所有抗原決定簇適合對臨床靈敏度要求較高分析測試YYYYYYYYYYYYYYYYYYYY多克隆抗體(PolyclonalAntibodies)免疫單克隆抗體(Monoclonalantibodies)YYYYYYYYYYYYY克隆的結果

抗體的產(chǎn)生具有高度的同源性和特異性并針對一個抗原決定簇可以選擇最好的抗體在大量生產(chǎn)時可以確保持續(xù)的供應適合對臨床特異性和批間一致性要求較高的分析測試單克隆抗體(Monoclonalantibodies)YY抗體的選擇篩選

抗體需經(jīng)過靈敏度，特異性和穩(wěn)定性的評價許多的抗原決定簇并非一種分子所獨有被測抗原的穩(wěn)定性不同被測抗原的游離和結合方式抗體的選擇篩選

案例:hLH抗原位點圖BetaAlphaB-D1hTSHhCGB-D2hCGA-D1hCGhFSHhTSHB-D3A-D3A-D2hCGhFSHhTSH案例:hLH抗原位點圖BetaAlphaB-D1B-D案例:Troponin-I抗原位點圖肌鈣蛋白-I穩(wěn)定性的問題氧化的問題磷酸化的問題 N-terminalC-terminal0102030405060708090100110120130140150160170180190200POO__

__Access1stGen31-3458-70(cross-react)157-160PMP

Detect

AccessAccuTnI

_______24-4041-49PMPDetect案例:Troponin-I抗原位點圖肌鈣蛋白-IN-抗體的選擇等分子(Equimolar)vs.非等分子(non-equimolar)分析依賴于特異性抗體的選擇結合方式-一些位點被隱藏游離方式-所有位點都暴露PSAACTPSA抗體的選擇等分子(Equimolar)vs.非等分子(n嗜異性抗體(HeterophileAntibody)病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對動物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)

來源于暴露于這些動物或接受過動物血清的治療分析的干擾可以在雙單克隆夾心法分析方式中引起假陽性可以在單克隆/多克隆分析方式中出現(xiàn)假陰性嗜異性抗體(HeterophileAntibody)病人樣嗜異性抗體反應假陽性較多見嗜異性抗體在捕捉抗體和檢測抗體中搭橋,出現(xiàn)在雙單克隆夾心法方式中嗜異性抗體反應假陽性較多見嗜異性抗體反應假陰性較少見嗜異性抗體爭奪捕捉或檢測抗體的抗原結合位點,出現(xiàn)在單克隆/多克隆分析方式中嗜異性抗體反應假陰性較少見稀釋液封閉劑（稀釋液）可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)動物蛋白（鼠，兔，羊等）各個廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會不同程度的受到任何一個病人血清的影響！稀釋液封閉劑（稀釋液）可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)定標程序廠家產(chǎn)生的主定標曲線感覺節(jié)省的校正型2點定標會增加定標的頻率對非線性的標準曲線可能會有問題(大多數(shù)的免疫分析產(chǎn)生的是非線性的標準曲線)多點定標曲線定量典型的是6個水平,定性典型的是2個水平可以達到最大的靈敏度,準確性和精密度可以有更長的定標周期間隔定標程序廠家產(chǎn)生的主定標曲線標準品參比物參比物純化蛋白(Purifiedprotein)通常制作較便宜相對較短的穩(wěn)定時間,需特殊的存放條件一般需要凍干存貯可能會有批間的不一致性重組(Recombinant)相對昂貴很長的研發(fā)時間更穩(wěn)定和可靠可以以液體的方式供應標準品參比物參比物分析清洗液清洗液使用的類型和量，在清洗步驟結束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗殘留的有效去除能力等，都會影響到分析表現(xiàn)清洗液中加入適當?shù)谋砻婊钚詣┛梢匀コ恍枰纳锘钚晕镔|(zhì)(干擾物質(zhì))免疫反應中不能用水進行分析內(nèi)的清洗分離!!!分析清洗液清洗液使用的類型和量，在清洗步驟結束后分析物提供的試劑的優(yōu)化需優(yōu)化參數(shù)時間程序步驟各類試劑厚度pH/離子強度

需優(yōu)化的內(nèi)容擴散的速率結合的速率復合物的穩(wěn)定性優(yōu)化后達到的表現(xiàn)靈敏度(Sensitivity)精密度(Precision)線性范圍(Dynamicrange)準確性(Accuracy)相關性(Correlation)試劑的優(yōu)化需優(yōu)化參數(shù)優(yōu)化后達到的表現(xiàn)試驗設計選擇對臨床檢測結果的影響臨床試驗結果反映了試驗過程中各種條件的優(yōu)化試驗設計選擇對臨床檢測結果的影響臨床試驗結果反映了試驗過程中免疫分析設計及優(yōu)化開發(fā)免疫分析試劑盒的過程就是選擇并優(yōu)化各種實驗條件，達到預期結果并能準確反應臨床真實情況的過程抗原/抗體分析方式分離技術檢測技術總體分析表現(xiàn)免疫分析設計及優(yōu)化開發(fā)免疫分析試劑盒的過程就是選擇并優(yōu)化各種BeckmanAccessAccuTn-I符合NABC/IFCC/ESC/ACC的導則要求最好的<10%CV值與>99%分位值的比值沒有嗜異性抗體,HAMA和RF的干擾對樣品沒有抗凝劑（肝素）的要求周轉(zhuǎn)時間(TAT)小于30分鐘(12分鐘)最寬的檢測線性范圍最長的定標穩(wěn)定時間最多的臨床應用診斷危險分層（高靈敏度和精密度）治療監(jiān)測為什么貝克曼有如此好的結果表現(xiàn)呢？BeckmanAccessAccuTn-I符合NABC/心肌鈣蛋白和心臟疾病cTnI的水平已用于AMI的診斷,但隨著診斷檢測技術的提高cTnI可對病人的短期和長期的心血管事件的風險進行預期心肌鈣蛋白和心臟疾病cTnI的水平已用于AMI的診斷,但隨免疫分析的未來過去癥狀的處理沒有標準的準則現(xiàn)在標準化的診斷和治療的步驟減少操作的可變性和不依從性著重單個個體明天人群疾病的花費和因果關系確認一些醫(yī)學措施所帶來的益處風險評估教育項目預防發(fā)病率展望控制發(fā)病率(控制你因某病而死亡)緊急監(jiān)護疾病管理人群健康管理更有效合理的管理疾病的有效管理已成為衛(wèi)生保健系統(tǒng)機制改變的基石，同樣的將推動所有的決定和因此而產(chǎn)生的行動。免疫分析的未來過去現(xiàn)在明天展望緊急監(jiān)護疾病管理人群健康管理更Access2R免疫分析系統(tǒng)產(chǎn)品特點和優(yōu)勢Access2R免疫分析系統(tǒng)產(chǎn)品特點和優(yōu)勢產(chǎn)品特點連續(xù)，隨機和急診運行方式機上冰箱，即用型試劑，覆膜技術24個試劑位/1200測試60樣品位(原試管或樣品杯)檢測速度最高可達100測試/小時最高可達56天上機/定標穩(wěn)定時間3小時離機時間出結果時間最快為12分鐘吸樣針超聲波液面感應，清洗和混勻自動跟蹤試劑盒消耗品用量第三代化學發(fā)光免疫分析技術靈活的免疫分析方式3步旋轉(zhuǎn)緩沖液沖洗微粒子進行分離中文操作系統(tǒng)產(chǎn)品特點連續(xù)，隨機和急診運行方式謝謝謝謝免疫學技術和臨床免疫學技術和臨床內(nèi)容摘要什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫分析的基本概念如何去設計一個免疫分析試劑免疫分析對臨床意義的改變Access2介紹內(nèi)容摘要什么是免疫分析的表現(xiàn)什么是免疫分析的表現(xiàn)什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫檢測的分析表現(xiàn)準確性精密度靈敏度特異性檢測線性范圍試劑穩(wěn)定性定標周期開瓶效期免疫檢測的分析表現(xiàn)準確性檢測線性范圍免疫分析檢測的臨床表現(xiàn)臨床靈敏度和特異性是分析結果準確性的臨床表現(xiàn):理想狀態(tài)健康人群疾病人群靈敏度100%特異性~60%特異性100%靈敏度~50%靈敏度增加特異性增加假陰性假陽性Cut-off設置cutoff值在此處用于篩查分析設置cutoff值在此處減少錯誤診斷帶來的高花費設置cutoff值在此處為了最少化錯誤結果免疫分析檢測的臨床表現(xiàn)臨床靈敏度和特異性是分析結果準確性的臨關于分析試劑的檢測靈敏度的定義分析及功能靈敏度分析靈敏度(AnalyticalSensitivity)使用A點標準品分析內(nèi)的測試最低可辨別0值的功能分析試劑的理論上的極限功能靈敏度(FunctionalSensitivity)一系列不同厚度的標準品分析間的測試,用<20%的CV值來分用來描述分析的臨床表現(xiàn)用人血清分析多于20天,且用多個試劑批號和儀器關于分析試劑的檢測靈敏度的定義分析及功能靈敏度分析表現(xiàn)特點:

正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）分析表現(xiàn)特點:

正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）免疫分析的基本概念免疫分析的基本概念免疫分析的經(jīng)典定義免疫分析（Immunoassay）是一種技術用于檢測和/或定量Y抗體（Antibody）通過一個特殊的只能和被分析物結合的抗體抗原（Antigen）免疫分析的經(jīng)典定義免疫分析（Immunoassay）是一免疫學測定的中心問題作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關鍵如何選擇好一個抗體去檢測一個被檢物質(zhì)，而不與非常相似結構的其它物質(zhì)有交叉反應，或漏掉須反應的物質(zhì)，這是分析設計的重中之重抗體的量必須恰當，過多會引起復合物的溶解免疫學測定的中心問題作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分關于抗體的親合力抗體除了要求純度外（單價特異性）還必須要求親合力，效價指抗體的量，親合力指抗體的質(zhì)在非競爭免疫反應的方式中抗體親和力比標記物的最低檢測極限更能影響分析的靈敏度在競爭法免疫反應的方式中抗體親和力直接關系到競爭的結果對于樣品中的干擾物質(zhì),親合力影響分析的抗干擾的能力關于抗體的親合力抗體除了要求純度外（單價特異性）還必須要求親免疫分析的工作定義免疫分析(Immunoassay)是一種測試方式,使用特殊的抗體與被檢測物質(zhì)的結合,此被檢測物質(zhì)不能通過簡單的化學方法所容易檢測到的.

通常在檢測系統(tǒng)中會使用到一種叫標記物（labeling）的物質(zhì),常標記在抗體上通常會有一個分離（separation）的過程在最后讀取信號前總是需要去仔細關注一下分析的方式（format）免疫分析的工作定義免疫分析(Immunoassay)是一種Access的技術免疫分析-“what＂檢測技術化學發(fā)光分離技術磁性顆粒分析方式靈活-“how＂}分析方式檢測技術分離技術Access的技術免疫分析-“what＂-“how＂檢測技術免疫分析檢測技術(Detection)有許多可用的方法應用一些“標記物＂所產(chǎn)生的一些能量進行測定標記物可以或可以不被激活而產(chǎn)生能量通過一些相應的檢測器對標記物產(chǎn)生的能量進行測定分離技術分析方式檢測技術免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay)優(yōu)勢優(yōu)秀的靈敏度較寬的檢測線性范圍局限性標記物的半衰期短試劑效期短檢測結果的重現(xiàn)性差每次檢測都要做標準曲線分析的反應時間長，半天~2天發(fā)射性污染有害很難實現(xiàn)自動化檢測放射免疫分析(Radioimmunoassay)優(yōu)勢熒光熒光素(Fluorophores)FIA，DELFIA原理熒光底物,4-MUP，或熒光標記物，鑭系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+吸收光為一個短波長的光，而發(fā)射光為一個長波長的光通過熒光計檢測優(yōu)勢與RIA具有相似的靈敏度和檢測線性范圍避免了RIA對危害污染物處理的麻煩和半衰期短的問題局限性可能會有來自樣品中的一些自身熒光物質(zhì)或短壽命的熒光物質(zhì)的干擾需用空白對照，速率法或推遲讀數(shù)來克服熒光熒光素(Fluorophores)FIA，DEL酵-顏色的變化酵(Enzymes)-EIA

原理在免疫分析結束后通過催化所加入的酵底物典型的催化反應包括顏色的變化,用分光光度計進行檢測優(yōu)勢非常容易使用的技術用于一些定性的分析局限性對定量分析所要求的靈敏度和寬線性難以實現(xiàn)ELISA技術必須每次定標試劑部分成分要復溶重組反應時間較長酵-顏色的變化酵(Enzymes)-EIA

化學發(fā)光化學發(fā)光物質(zhì)-CLEIA

原理不穩(wěn)定的分子通過加入一些化學基團變得很穩(wěn)定,而移去這些起穩(wěn)定作用的化學基團后,分子結構變得不穩(wěn)定發(fā)出光（pH的改變，酵切作用，電激發(fā)等）優(yōu)勢具備RIA所擁有的優(yōu)勢(靈敏度和寬線性),但排除其缺點用一個簡單的光度計讀數(shù)非常低的背景干擾類型閃爍(flash),持續(xù)(glow)發(fā)光發(fā)光物質(zhì)的穩(wěn)定性水溶液中的穩(wěn)定性化學發(fā)光化學發(fā)光物質(zhì)-CLEIA

化學發(fā)光物質(zhì)AMPPD,Dioxetane(Lumi-Phos530TM)-最穩(wěn)定的化學發(fā)光物質(zhì)（第三代）第一代：魯米那第二代：丫啶酯類，三聯(lián)啶釕代表性分析系統(tǒng)貝克曼庫爾特-Access/Access2/DxI800終點讀數(shù),更穩(wěn)定RLU00510

時間(分鐘)5560化學發(fā)光物質(zhì)AMPPD,Dioxetane(Lumi-PACCESS化學發(fā)光標記物的特點很寬的檢測線性范圍可檢測到6個數(shù)量級(例如:1-100,000units)

極高的靈敏度可檢測到小到10-21摩爾/升

很底的背景干擾對于一些超敏分析項目,有相當接近零值的背景信號

更超強的試劑穩(wěn)定性試劑效期開瓶效期定標周期ACCESS化學發(fā)光標記物的特點很寬的檢測線性范圍分離技術免疫分析檢測技術分離技術(Separation)有很多方式典型的是,特異性結合的分析物被保留而未結合物質(zhì)和無用的反應物被清除分析方式分離技術免疫分析技術的創(chuàng)新微粒子包被珠包被微孔包被管包被技術的創(chuàng)新微粒子包被珠包被微孔包被管包被磁顆粒包被技術磁顆粒抗體包被技術磁顆粒均勻的懸浮于整個反應體系分析物在磁顆粒表面捕獲磁顆粒在磁場中被清洗磁顆粒重新懸浮十分容易

優(yōu)勢快速的反應動力學較少的樣品量提高檢測的靈敏度極好的批內(nèi)重顯性可以探針取放，實現(xiàn)自動化磁顆粒包被技術磁顆?？贵w包被技術分析方式免疫分析檢測技術分離技術分析方式-有很多種方式可定義為分析的“處方＂設置一個最優(yōu)化的方式(可變量)去最優(yōu)化項目的臨床應用分析方式免疫分析分析方式可變量夾心法(Sandwich)vs.競爭法(competitive)標記物的放置同步(Simultaneous)vs.分步(sequential)試劑/樣品加入的順序孵育的次數(shù)(步驟)清洗分離的次數(shù)(步驟)試劑/樣品的體積/厚度孵育的時間孵育的溫度分析方式可變量Access的分析方式基本分析方式夾心法(Sandwich)競爭結合(Competitivebinding)試劑的加入，孵育和清洗同步(Simultaneous)(1步,1次清洗)分步(Sequential)(2步,2次清洗)“Piggyback＂(2步,1次清洗)Access的分析方式基本分析方式夾心法分析方式捕捉抗體(Captureantibody)和標記抗體(labeledantibody)每個不同的抗體可以針對不同的抗原決定簇，或二個在同一個抗原決定簇分析更特異因為二個抗體同時反應適合于檢測大分子物質(zhì)

bhCG TSH IgE ProlactinFSH LH Ferritin HBsAg夾心法分析方式捕捉抗體(Captureantibody)和競爭法分析方式只有捕捉抗體

主要針對小分子物質(zhì)檢測沒有足夠表面積的分析物去符合“夾心法＂要求T3 FT3B12DigoxinProgesteroneT4FT4FolateCortisol Estradiol競爭法分析方式只有捕捉抗體

T3 FT3B12如何去設計一個免疫分析試劑如何去設計一個免疫分析試劑一個免疫分析項目的誕生里程碑(Milestones)

市場調(diào)研確定需求項目的詳細特點要求確定分析方式研發(fā)和優(yōu)化證明分析表現(xiàn)符合項目的詳細特點要求(betasites,clinicalstudies)提交注冊一個免疫分析項目的誕生里程碑(Milestones)

項目臨床應用的要求臨床應用(claims)篩查（Screening）檢測（Detection）診斷（Diagnosis）分層（Staging）預后（Prognosis）監(jiān)測（Monitoring）項目臨床應用的要求臨床應用(claims)項目的臨床應用與分析表現(xiàn)必須到達的分析表現(xiàn)特徵靈敏度（Sensitivity）特異性（Specificity）精密度（Precision）線性范圍（Dynamicrange）其它項目的臨床應用與分析表現(xiàn)必須到達的分析表現(xiàn)特徵分析方式的選擇需考慮的因素

分析物的特徵體積（競爭法還是夾心法）厚度（一步法，二步法，反應時間等）潛在的“鉤狀效應＂（hookeffect）-假陰性解決的方法可以使用2步法方式樣品量和試劑量的平衡抗干擾能力儀器的能力／局限性預處理的要求分析方式的選擇需考慮的因素

試劑原材料的選擇原材料

抗體標準品封閉試劑（稀釋液）清洗緩沖液YYYYY試劑原材料的選擇原材料

YYYYY抗體的選擇單克隆(Monoclonal)和多克隆(polyclonal)

選擇的標準(criteria)特異性(Specificity)靈敏度(Sensitivity)供應能力(Supply)相關性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花費(Cost)抗體的選擇單克隆(Monoclonal)和多克隆(pol多克隆抗體(PolyclonalAntibodies)免疫動物獲得,如羊或兔時間長,復雜的制作流程注射,監(jiān)測滴度(可能反覆注射)周期性的抽血獲得特徵化(Characterization)和純化(purification)生產(chǎn)出＂雞尾酒＂式的抗體,針對所有抗原決定簇適合對臨床靈敏度要求較高分析測試YYYYYYYYYYYYYYYYYYYY多克隆抗體(PolyclonalAntibodies)免疫單克隆抗體(Monoclonalantibodies)YYYYYYYYYYYYY克隆的結果

抗體的產(chǎn)生具有高度的同源性和特異性并針對一個抗原決定簇可以選擇最好的抗體在大量生產(chǎn)時可以確保持續(xù)的供應適合對臨床特異性和批間一致性要求較高的分析測試單克隆抗體(Monoclonalantibodies)YY抗體的選擇篩選

抗體需經(jīng)過靈敏度，特異性和穩(wěn)定性的評價許多的抗原決定簇并非一種分子所獨有被測抗原的穩(wěn)定性不同被測抗原的游離和結合方式抗體的選擇篩選

案例:hLH抗原位點圖BetaAlphaB-D1hTSHhCGB-D2hCGA-D1hCGhFSHhTSHB-D3A-D3A-D2hCGhFSHhTSH案例:hLH抗原位點圖BetaAlphaB-D1B-D案例:Troponin-I抗原位點圖肌鈣蛋白-I穩(wěn)定性的問題氧化的問題磷酸化的問題 N-terminalC-terminal0102030405060708090100110120130140150160170180190200POO__

__Access1stGen31-3458-70(cross-react)157-160PMP

Detect

AccessAccuTnI

_______24-4041-49PMPDetect案例:Troponin-I抗原位點圖肌鈣蛋白-IN-抗體的選擇等分子(Equimolar)vs.非等分子(non-equimolar)分析依賴于特異性抗體的選擇結合方式-一些位點被隱藏游離方式-所有位點都暴露PSAACTPSA抗體的選擇等分子(Equimolar)vs.非等分子(n嗜異性抗體(HeterophileAntibody)病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對動物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)

來源于暴露于這些動物或接受過動物血清的治療分析的干擾可以在雙單克隆夾心法分析方式中引起假陽性可以在單克隆/多克隆分析方式中出現(xiàn)假陰性嗜異性抗體(HeterophileAntibody)病人樣嗜異性抗體反應假陽性較多見嗜異性抗體在捕捉抗體和檢測抗體中搭橋,出現(xiàn)在雙單克隆夾心法方式中嗜異性抗體反應假陽性較多見嗜異性抗體反應假陰性較少見嗜異性抗體爭奪捕捉或檢測抗體的抗原結合位點,出現(xiàn)在單克隆/多克隆分析方式中嗜異性抗體反應假陰性較少見稀釋液封閉劑（稀釋液）可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)動物蛋白（鼠，兔，羊等）各個廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會不同程度的受到任何一個病人血清的影響！稀釋液封閉劑（稀釋液）可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)定標程序廠家產(chǎn)生的主定標曲線感覺節(jié)省的校正型2點定標會增加定標的頻率對非線性的標準曲線可能會有問題(大多數(shù)的免疫分析產(chǎn)生的是非線性的標準曲線)多點定標曲線定量典型的是