氨基酸代謝控制發(fā)酵機制及育種策略課件

氨基酸代謝控制發(fā)酵機制

及育種策略

徐慶陽中國氨基酸技術服務中心氨基酸代謝控制發(fā)酵機制

及育種策略

徐慶陽中國氨基酸技術服務1目錄Chapter1代謝機制理論基礎Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-纈氨酸Chapter5L-異亮氨酸目錄Chapter1代謝機制理論基礎2Chapter1代謝機制理論基礎Chapter1代謝機制理論基礎3氨基酸發(fā)酵機制在一般情況下，微生物細胞只合成本身需要的中間代謝產(chǎn)物，嚴格防止氨基酸、核苷酸等中間物質的大量積累。當氨基酸或核苷酸等物質進入細胞后，微生物細胞立即停止該物質的合成，一直到所供應的養(yǎng)料消耗到很低濃度，微生物細胞才能重新開始進行該物質的合成。微生物細胞中這種調節(jié)控制作用主要靠兩個因素，即參與調節(jié)的有關酶的活性和酶量氨基酸發(fā)酵機制在一般情況下，微生物細胞只合成本身需要的中間4代謝控制機制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制。一方面，從DNA的分子水平上闡明了酶生物合成的控制機制，酶的合成像普通蛋白質的合成一樣，受到結構基因的控制，由結構基因決定形成酶分子的一級結構；另一方面,酶的生物合成還受代謝物（酶反應的底物、產(chǎn)物及其類似物）的控制和調節(jié)。當有誘導物存在時，酶的生成量可以幾倍乃至幾百倍的數(shù)量增加。相反，某些酶促反應的產(chǎn)物，特別是終產(chǎn)物，又能產(chǎn)生阻遏作用，使酶的合成量大大減少。代謝控制機制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重5參與氨基酸生物合成的關鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鳥氨酸轉氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高絲氨酸脫氫酶；⑦蘇氨酸脫水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸變位酶；11預苯酸脫水酶；12預苯酸脫氫酶。參與氨基酸生物合成的關鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸6一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點有關系的分支點酶（branchingenzyme）可以成為關鍵酶，但關鍵酶并不都是分支點酶。關鍵酶的關鍵效果也只是在特定的氨基酸生物合成過程中成立，而在其他氨基酸的生物合成過程中則不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在纈氨酸生物合成途徑中起主導性的關鍵酶作用，但在異亮氨酸的生物合成中，起主導性關鍵作用的卻是蘇氨酸脫水酶。該酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一階段，并且不是分支點酶。一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點有關系的分支點酶（br7反饋控制與優(yōu)先合成氨基酸生物合成的基本調節(jié)機制有反饋控制（反饋阻遏與反饋抑制）和在合成途徑分支點處的優(yōu)先合成如圖所示的反饋控制，由催化合成途徑最初反應A→B的初始酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋抑制和合成途徑上各種酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋阻遏組成。反饋控制與優(yōu)先合成8優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的酶活性遠遠大于b酶的酶活性，結果優(yōu)先合成E。E合成達到一定濃度時，就會抑制a酶，使代謝轉向合成G。G合成達到一定濃度時就會對c酶產(chǎn)生抑制作用優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶9平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E與G，由于a酶的酶活性遠遠大于b酶，結果優(yōu)先合成E。E過量后就會抑制a酶，使代謝轉向合成G。G過量后，就會拮抗或逆轉E的反饋抑制作用，結果代謝流又轉向合成E，如此循環(huán)平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分10微生物體內代謝過程的各種生物化學反應，都是由各種酶來催化的。按各種酶在代謝調節(jié)中作用的不同，又可將酶分為以下三類調節(jié)酶（常稱關鍵酶，與代謝調節(jié)關系密切）變構酶：通過酶分子構象的變化來改變酶活性的一類酶同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子結構不同的一類酶多功能酶：能夠催化兩種以上不同反應的一類酶靜態(tài)酶一般與代謝調節(jié)關系不大的一類酶潛在酶指酶原、非活性型或與抑制劑結合的酶微生物體內代謝過程的各種生物化學反應，都是由各種酶來催化的。11同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G過量時，酶Ⅱ停止活動，C也不能經(jīng)過F到G與此同時，酶I活力不受影響，A可以順利地到E，從而使G過量，但并不干擾E的合成同功酶12反饋抑制與反饋阻遏的比較項目類型反饋阻遏反饋抑制控制對象酶的生物合成酶的活性控制量終產(chǎn)物濃度終產(chǎn)物濃度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的構象變化控制裝置終產(chǎn)物與阻遏蛋白的親和力終產(chǎn)物與變構部位的親和力控制裝置的動作阻遏蛋白與操縱基因結合，通過變構效應，酶的結構發(fā)生變化不能合成mRNA形成的控制開、關控制控制酶活性大小反應遲緩、粗的控制迅速、精確的控制代謝途徑無定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點等無定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點等細胞經(jīng)濟高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反應生成物)反饋抑制與反饋阻遏的比較項目反饋阻遏反饋抑制控制對象酶的生物13協(xié)同反饋抑制或稱多價反饋抑制當一條代謝途徑中有兩個以上終產(chǎn)物時，任何一個終產(chǎn)物都不能單獨抑制途徑第一個共同的酶促反應，但當兩者同時過剩時，它們協(xié)同抑制第一個酶反應協(xié)同反饋抑制或稱多價反饋抑制14合作反饋抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反饋抑制也可稱為增效反饋抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。這種反饋抑制不同于協(xié)同反饋抑制，也不同于積累反饋抑制當任何一個終產(chǎn)物單獨過剩時，只部分地反饋抑制第一個酶的活性，只有當G、E兩個終產(chǎn)物同時過剩存在時，才能引起強烈抑制，其抑制程度大于各自單獨存在的和合作反饋抑制（Cooperativefeedbackin15積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在積累反饋抑制中，每一個最終產(chǎn)物只單獨地、部分地抑制共同步驟的第一個酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響。所以幾個最終產(chǎn)物同時存在時，它們的抑制作用是積累的積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinh16順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinhibition)順序反饋抑制的過程是：F積累，停止D→E反應，減少F的進一步合成，更多的D轉到G，再由G合成I或K；I積累，抑制G→H的反應；K積累，抑制G→J的反應，結果造成G的積累，引起G對A→B的反饋抑制，使整個途徑停止假反饋抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反饋抑制是指結構類似物引起的反饋抑制順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinh17Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸18谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸生物合成的理想途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應19谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途徑）戊糖磷酸途徑（pentosephosphatepathway，HMP途徑）三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反應）等谷氨酸的生物合成包括20生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應轉氨酶（AT）催化的轉氨反應生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基21谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應22轉氨酶（AT）催化的轉氨反應轉氨酶（AT）催化的轉氨反應23谷氨酸合成酶（GS）催化的反應生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸合成酶（GS）催化的反應生成谷氨酸的主要酶反應24谷氨酸合成酶（GS）催化的反應谷氨酸合成酶（GS）催化的反應25由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑26

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途徑C6H12O6+NH3+3/2O227由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩爾葡萄糖可以生成1摩爾的谷氨酸，因此理論糖酸轉化率為81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的28谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑29葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個途徑生成丙酮酸。其中以EMP途徑為主，生物素充足時HMP所占比例是38%，控制生物素亞適量，發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例約為26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應生成草酰乙酸或蘋果酸，催化CO2固定反應的酶有丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經(jīng)還原氨基化反應生成谷氨酸谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個途徑生成丙酮酸。其中以EMP途30控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脫氫酶活力微弱谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。喪失α-酮戊二酸脫氫酶的重要性已經(jīng)用要求生物素和不分泌谷氨酸的大腸桿菌得以證明。甚至發(fā)現(xiàn)不要求生物素的一株喪失α-酮戊二酸脫氫酶的突變株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其親株卻什么也不分泌。谷氨酸產(chǎn)生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏條件下，三羧酸循環(huán)到達α-酮戊二酸時，即受到阻擋。把糖代謝流阻止在α-酮戊二酸的堰上，對導向谷氨酸形成具有重要意義。在銨離子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脫氫酶的催化作用，經(jīng)還原氨基化反應生成谷氨酸。谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑31谷氨酸脫氫酶活性強谷氨酸脫氫酶活性強32細胞膜對谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低細胞內產(chǎn)物的濃度，消除了谷氨酸轉化成其它代謝物的可能，減低了對谷氨酸脫氫酶的抑制，并使谷氨酸的生成途徑暢通。由生物素亞適量可造成細胞膜對產(chǎn)物的高通透性。生物素改變細胞膜通透性的機制與影響細胞膜磷脂的含量及成分有關。還可通過添加表面活性劑、高級飽和脂肪酸，或青霉素等控制細胞膜對谷氨酸的通透性。通過選育溫度敏感突變株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突變株也可控制細胞膜對谷氨酸的通透性。細胞膜對谷氨酸的通透性高33CO2固定酶系活力強Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力強乙醛酸循環(huán)弱異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力強Citratesynthase,Ac34乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補給途徑在菌體生長期之后，進入谷氨酸生成期，為了大量生成、積累谷氨酸，最好沒有異檸檬酸裂解酶催化反應，封閉乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧35谷氨酸生物合成的調節(jié)機制優(yōu)先合成與反饋調節(jié)糖代謝的調節(jié)氮代謝的調節(jié)谷氨酸生物合成的調節(jié)機制優(yōu)先合成與反饋調節(jié)36優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強，故優(yōu)先合成谷氨酸。優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制α-酮戊二酸合成后由37反饋調節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-檸檬酸合成酶3-異檸檬酸脫氫酶4-α-酮戊二酸脫氫酶5-谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制1-磷酸烯醇式丙酮酸38優(yōu)先合成

谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調節(jié)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反應的關鍵酶，受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏優(yōu)先合成與反饋調節(jié)優(yōu)先合成優(yōu)先合成與反饋調節(jié)39檸檬酸合成酶的調節(jié)

檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，除受能荷調節(jié)外，還受谷氨酸的反饋阻遏和烏頭酸的反饋抑制異檸檬酸脫氫酶的調節(jié)

細胞內α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當α-酮戊二酸過量時對異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成α-酮戊二酸優(yōu)先合成與反饋調節(jié)檸檬酸合成酶的調節(jié)優(yōu)先合成與反饋調節(jié)40α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié)

在谷氨酸產(chǎn)生菌中，α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱谷氨酸脫氫酶的調節(jié)

谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋阻遏谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強，故優(yōu)先合成谷氨酸優(yōu)先合成與反饋調節(jié)α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié)優(yōu)先合成與反饋調節(jié)41糖代謝的調節(jié)能荷細胞所處的能量狀態(tài)用ATP、ADP和AMP之間的關系來表示，稱為能荷（energycharge）能荷值在0和1之間變動。已知大多數(shù)細胞的能荷處于0.80到0.95之間，處于一種動態(tài)平衡）糖代謝的調節(jié)能荷能荷值在0和1之間變動。已知大多數(shù)細胞的42糖代謝的調節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調節(jié)如圖所示，當生物體內即能荷降低，就會激活某些催化糖類分解的酶或解除ATP對這些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），從而加速糖酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過氧化磷酸化作用生成ATP。當能荷高時，就會抑制糖元降解、糖酵解和TCA循環(huán)的關鍵酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶，并激活糖類合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，從而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-檸檬酸合成酶4-異檸檬酸脫氫酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代謝的調節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調節(jié)如圖所示，當生物體內43糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝速率的影響

生物素對糖代謝速率的影響，主要是影響糖降解速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提高，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，因而會引起乳酸的溢出生物素對CO2固定反應的影響生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應，據(jù)報道，生物素大過量時（100g/L以上），CO2固定反應可提高30%糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)44糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)生物素對乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導形成的異檸檬酸裂解酶就很少由于異檸檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的合成，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)45氮代謝的調節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉化成其它氨基酸和參與蛋白質的合成在生物素亞適量時，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應停滯，同時又由于完全氧化降低的結果，使ATP形成量減少，導致蛋白質合成活動停滯，在銨離子適量存在下，使得菌體生成積累谷氨酸生成的谷氨酸也不通過轉氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質在生物素充足條件下，異檸檬酸裂解酶活力增強，琥珀酸氧化力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酸乙酸、蘋果酸脫羧反應增強，蛋白質合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代謝的調節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成能力46谷氨酸細胞膜滲透性的控制細胞膜的結構控制細胞膜滲透性的方法谷氨酸細胞膜滲透性的控制細胞膜的結構47氨基酸代謝控制發(fā)酵機制及育種策略課件48細胞膜的脂質主要是磷脂，每一個磷脂分子由一個帶正電荷且能溶于水的極性頭和一個不帶電荷、不溶于水的非極性尾所構成,極性頭朝向膜的內外兩個表面，呈親水性；而非極性的疏水尾則埋藏在膜的內層，從而形成一個磷脂雙分子層。膜內的蛋白質有的是酶，有的是攜帶胞外物質進入細胞的載體蛋白，鑲嵌或埋在脂質雙層內或附著在它的表面，主要分為嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖鏈主要朝向外表面。細胞膜是一個選擇性半滲透性膜，它的重要生理功能是控制細胞內外物質的運送和交換，是細胞同外界環(huán)境進行物質交換和信息交流的接觸面。通過改變細胞膜的組成成分可改變膜的滲透性。細胞膜的脂質主要是磷脂，每一個磷脂分子由一個帶正電荷且能溶于49控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成作用機制：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成。當磷脂合成減少到正常量的一半左右時，細胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成50控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性劑使用生物素過量的原料（如糖蜜等）發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過添加表面活性劑（如吐溫60）或是高級飽和脂肪酸（C16～18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透障礙物，大量積累谷氨酸作用機制：表面活性劑、高級飽和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通過拮抗脂肪酸的生物合成，導致磷脂合成不足，結果形成磷脂不足的細胞膜，提高了細胞膜對谷氨酸的滲透性控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成51控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酸培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成。作用機制：由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細胞膜的滲透性；通過控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸分泌于細胞外控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成52控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成作用機制：甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失α-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長。在甘油限量供應下，由于控制了細胞膜中與滲透性有直接關系的磷脂含量，從而使谷氨酸得以積累控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成53控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成溫度敏感突變株溫度敏感突變株是通過誘變得到的在低溫下生長，而在高溫下卻不能生長繁殖的突變株。利用溫度敏感突變株進行谷氨酸發(fā)酵時，由于僅控制溫度就能實現(xiàn)谷氨酸生產(chǎn)，所以又把這種新工藝稱為物理控制方法。作用機制：溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜的結構基因上，發(fā)生堿基的轉換或顛換，這樣為基因所指導譯出的酶，在高溫時失活，導致細胞膜某些結構的改變控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成54控制細胞壁的合成通過控制細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜，間接控制細胞膜通透性。這可以通過在發(fā)酵對數(shù)生長期的早期，添加青霉素或頭孢霉素C等抗生素來實現(xiàn)。作用機制：添加青霉素是抑制谷氨酸產(chǎn)生菌細胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉肽酶，影響細胞壁糖肽的生物合成控制細胞壁的合成通過控制細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進55日常菌種工作定期分純

一般1～2個月分純—次，把產(chǎn)酸高、生長快、無噬菌體感染的菌株挑選出來小劑量誘變刺激用紫外線(10～20s)、通電、激光等輕微處理，可以淘汰生長微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑選出來的菌是產(chǎn)酸高、生長旺盛、無噬菌體感染的優(yōu)良菌株高產(chǎn)菌制做安瓿管通過誘變育種或分純挑出來的高產(chǎn)菌株，要馬上做安瓿管，防止菌種變異日常菌種工作定期分純56谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略（進通節(jié)堵出）選育耐高滲透壓菌種選育不分解利用谷氨酸的突變株選育細胞膜滲透性好的突變株選育強化CO2固定反應的突變株選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株選育強化能量代謝的突變株選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略（進通節(jié)堵出）選育耐高滲透壓菌種57選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株選育在含20％～30％葡萄糖的平板上生長好的突變株耐高谷氨酸突變株選育在含15％～20％味精的平板上生長好的突變株耐高糖、高谷氨酸突變株選育在含20％葡萄糖和15％味精的平板上生長好的突變株選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株58選育不分解利用谷氨酸的突變株谷氨酸發(fā)酵，目的是積累谷氨酸如果菌種一邊合成谷氨酸，一邊分解利用谷氨酸，就達不到積累谷氨酸的目的所以必須使菌種不能分解利用谷氨酸，切斷-酮戊二酸繼續(xù)向下氧化的反應，即選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株選育不分解利用谷氨酸的突變株谷氨酸發(fā)酵，目的是積累谷氨酸59選育細胞膜滲透性好的突變株

谷氨酸產(chǎn)生菌細胞膜滲透性的改變是發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的關鍵抗Vp類衍生物

據(jù)有關資料報道，抗Vp類衍生物如香豆素、蘆丁等能遺傳性地改變細胞膜的滲透性選育溶菌酶敏感性突變株選育二氨基庚二酸缺陷突變株選育溫度敏感突變株選育細胞膜滲透性好的突變株谷氨酸產(chǎn)生菌細胞膜滲透性的改60選育強化CO2固定反應的突變株選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長快、大的菌株以琥珀酸為唯一碳源，菌體要想生長，碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應。菌休生長越快，四碳二羧酸的脫羧反應越強，而四碳二羧酸的脫羧反應與二氧化碳固定反應是相同酶所催化的，所以以琥珀酸為唯一碳源，菌體長得越好，二氧化碳固定反應越強選育氟丙酮酸敏感性突變株氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，菌種對氟丙酮酸越敏感，說明菌種丙酮酸向乙酰CoA的轉化反應越弱，相對地CO2固定反應比例也就越大選育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突變株克隆丙酮酸羧化酶基因選育強化CO2固定反應的突變株選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基61選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育琥珀酸敏感型突變株琥珀酸是乙醛酸循環(huán)關鍵酶異檸檬酸裂解酶的阻遏物，菌種對琥珀酸越敏感，異檸檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循環(huán)就越弱

選育不利用乙酸的突變株利用基因工程技術，使異檸檬酸裂解酶活力降低選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育琥珀酸敏感型突變株62選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育檸檬酸合成酶強的突變株檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，強化該酶能加強谷氨酸的生物合成

選育抗氟乙酸、氟化鈉、氮絲氨酸和氟檸檬酸等突變株抗氟乙酸、氟化鈉、氮絲氨酸和氟檸檬酸都是烏頭酸酶的抑制劑，抗這些物質的突變株，可強化烏頭酸酶的活力

選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育檸63選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株選育耐高谷氨酸的突變株選育谷氨酸結構類似物抗性突變株，如谷氨酸氧肟酸鹽抗性突變株選育谷氨酰胺抗性突變株選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株選育耐高谷氨酸的64選育強化能量代謝的突變株

谷氨酸高產(chǎn)菌的兩個顯著持點：-酮戊二酸繼續(xù)向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循環(huán)弱，使能量代謝受阻；TCA循環(huán)前一階段的代謝減慢。強化能量代謝，可補救上述兩點不足，使TCA循環(huán)前一段代謝加強，谷氨酸合成的速度加快

選育呼吸抑制劑抗性突變株可選育丙二酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株

選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株可選育2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株

選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株

選育強化能量代謝的突變株65選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進生長的突變株選育抗嘌呤、嘧啶類似物的突變株選育抗核苷酸類抗生素突變抹，如德夸菌素、狹雷素C抗性突變株選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株選育莽草酸缺陷型或添加芳66Chapter3L-亮氨酸

Chapter3L-亮氨酸

67L-亮氨酸生物合成的代謝調節(jié)機制L-亮氨酸生物合成的代謝調節(jié)機制68丙酮酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物，α-酮基異戊酸是合成L-纈氨酸的直接前體物，又是合成L-亮氨酸間接前體物。催化丙酮酸生成α-酮基異戊酸的酶系，與催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，這些酶的合成均受到三種支鏈氨基酸的協(xié)同反饋阻遏。其中的乙酰羥基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基異戊酸的關鍵（限速）酶，還受到L-纈氨酸的反饋抑制。在由α-酮基異戊酸合成L-亮氨酸過程中，α-異丙基蘋果酸合成酶是關鍵（限速）酶，受到L-亮氨酸的反饋抑制和阻遏。乙酰羥基酸合成酶對α-酮基丁酸的親和力比對丙酮酸的高。α-異丙基蘋果酸合成酶對α-酮基異戊酸的親和力比支鏈氨基酸轉氨酶對α-酮基異戊酸的親和力約高十倍。所以，三種支鏈氨基酸生物合成的優(yōu)先順序為異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸。據(jù)此可知，在α-酮基丁酸之前減弱或切斷異亮氨酸的代謝流，對亮氨酸的優(yōu)先合成有重要作用。丙酮酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物，α-酮基異戊69L-亮氨酸產(chǎn)生菌的育種策略出發(fā)菌株的選擇目前棒桿菌屬、短桿菌屬的L-亮氨酸生物合成途徑及其調節(jié)機制已弄清，以鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）、粘質賽氏桿菌（Serratiamarcescens）、乳糖發(fā)酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum）、鈍齒棒桿菌（Corynebacteriumcrenatum）、黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum）為出發(fā)菌株，均有選育出L-亮氨酸高產(chǎn)菌的文獻報道

L-亮氨酸產(chǎn)生菌的育種策略出發(fā)菌株的選擇70切斷進一步代謝途徑要大量積累L-亮氨酸，需切斷或減弱亮氨酸進一步向下代謝的途徑，使合成的亮氨酸不再被消耗，如選育以L-亮氨酸為唯一碳源不能生長或生長微弱的突變株切斷進一步代謝途徑71解除反饋抑制與阻遏解除三種支鏈氨基酸對生物合成途徑上的乙酰羥基酸合成酶等3個共用酶的協(xié)同反饋阻遏作用解除L-纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用解除L-亮氨酸對α-異丙基蘋果酸合成酶的反饋抑制和阻遏作用以上可通過使菌體帶上L-亮氨酸和L-纈氨酸結構類似物抗性標記(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr等遺傳標記)來實現(xiàn)解除反饋抑制與阻遏解除三種支鏈氨基酸對生物合成途徑上的乙酰72減弱或切斷支路代謝，并增加前體物的合成選育異亮氨酸缺陷突變株來解除3個共用酶受所到的反饋阻遏選育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力減弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突變株，可增大L-亮氨酸生物合成代謝流，節(jié)約碳源，從而有利于L-亮氨酸產(chǎn)量的提高。選育以琥珀酸為唯一碳源生長微弱的突變株，即可獲得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力減弱的突變株減弱或切斷支路代謝，并增加前體物的合成選育異亮氨酸缺陷突變73改變菌體的正常代謝篩選磺胺胍抗性標記（SGr）菌株，在氨基酸產(chǎn)生菌選育上具有普遍提高產(chǎn)酸能力的作用，關于其詳細機制，尚未見到令人信服的報道。一般認為，磺胺胍是細菌的生長因子-對氨基苯甲酸（PAPA）的結構類似物，而PAPA是葉酸的一個組分，不少細菌要求外界提供PAPA以合成其代謝中必不可少的輔酶-四氫葉酸，因而二者起競爭性拮抗作用。一旦菌株帶有磺胺胍抗性標記，菌體的正常代謝發(fā)生改變，從而導致像氨基酸這樣的代謝產(chǎn)物大量的積累改變菌體的正常代謝篩選磺胺胍抗性標記（SGr）菌株，在氨基酸74改變菌體的正常代謝篩選利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸產(chǎn)量提高，其機制尚不清楚，可能是通過改變菌體的正常代謝，使像氨基酸這類的代謝產(chǎn)物大量的積累。利福平為半合成廣譜抗菌素，對革蘭氏陽性和陰性細菌以及結核分支桿菌均有明顯抗菌效應。抗菌機理是：通過與細菌RNA聚合酶的β亞基結合，抑制細菌RNA聚合酶的活性，妨礙細菌RNA轉錄的啟始。但是RNA轉錄一旦開始，利福平則不起作用改變菌體的正常代謝篩選利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮75利用基因工程技術構建L-亮氨酸工程菌基因工程技術主要通過目的基因擴增，增加生物合成途徑中的限速酶，以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。從L-亮氨酸生物合成途徑及代謝調節(jié)機制可知，α-異丙基蘋果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途徑中真正意義上的限速酶，將編碼該酶的基因克隆到L-亮氨酸產(chǎn)生菌中，增加該酶的數(shù)量，以解除其“瓶頸”的限速作用，從而提高L-亮氨酸的產(chǎn)量利用基因工程技術構建L-亮氨酸工程菌76綜合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高產(chǎn)菌可以帶有的遺傳標記為天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、異亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；結構類似物抗性，如：2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羥基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸鹽抗性（LeuHxr）或纈氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等綜合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高產(chǎn)菌可以帶有的遺傳標記為77氨基酸代謝控制發(fā)酵機制及育種策略課件78Chapter4L-纈氨酸Chapter4L-纈氨酸79L-纈氨酸的生物合成途徑L-纈氨酸的生物合成途徑80代謝調節(jié)機制丙酮酸是L-纈氨酸的直接前體物，催化丙酮酸生成α-乙酰異戊酸的酶系，與催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的。這些酶的合成均受到三種分支鏈氨基酸的協(xié)同阻遏。其中α-乙酰乳酸合成酶是L-纈氨酸生物合成途徑中的關鍵酶，受到L-纈氨酸的反饋抑制。L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸生物合成途徑中的最后一步轉氨反應都是由同一種轉氨酶催化完成的。代謝調節(jié)機制81L-纈氨酸高產(chǎn)菌株的育種思路出發(fā)菌株的選擇:目前，世界上利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的出發(fā)菌株有北京棒桿菌（Corynebacteriumpekineise），谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutacium），乳糖發(fā)酵短桿菌[34](Brevibacteriumlactofermentum)，大腸桿菌（Escherichiacoli），黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum），粘質賽氏桿菌（Serratiamarcescens），芽孢桿菌屬（Bacillus）和埃希氏菌屬（Escherichia）的菌株等，這些菌株均可以作為選育L-纈氨酸生產(chǎn)菌的出發(fā)菌株L-纈氨酸高產(chǎn)菌株的育種思路出發(fā)菌株的選擇:目前，世界上82切斷或改變平行代謝途徑L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑是平行進行的，L-纈氨酸、L-亮氨酸與L-異亮氨酸的生物合成途徑中共用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構還原酶和二羥基脫水酶。選育L-亮氨酸、L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的共用酶系完全用于L-纈氨酸的生物合成，進而提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。α-酮基異戊酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物。切斷L-亮氨酸的合成途徑不僅可以節(jié)省碳源而且解除了菌體生成L-纈氨酸酶系的反饋抑制和多價阻遏，使α-異丙基蘋果酸合成酶脫敏，顯著提高L-纈氨酸的產(chǎn)量切斷或改變平行代謝途徑L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途83解除菌體自身的反饋調節(jié)L-纈氨酸合成中的第一個限速酶—乙酰乳酸合成酶受L-纈氨酸的反饋抑制，同時L-纈氨酸和L-異亮氨酸的合成酶系受三個末端：即L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的多價阻遏。如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸生物酶系的多價阻遏，必將大大提高L-纈氨酸的積累?？蛇x育L-纈氨酸結構類似物抗性突變株來解除L-纈氨酸的反饋調節(jié)。常用的L-纈氨酸結構類似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、正L-纈氨酸等解除菌體自身的反饋調節(jié)L-纈氨酸合成中的第一個限速酶—乙酰乳84增加前體物質的合成L-纈氨酸生物合成的前體物質是丙酮酸，為了積累更多的L-纈氨酸，必須提高丙酮酸的產(chǎn)量，可以選育以琥珀酸為唯一碳源生長慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突變株來達到目的增加前體物質的合成L-纈氨酸生物合成的前體物質是丙酮酸，為85切斷進一步代謝途徑要積累大量L-纈氨酸，需切斷或減弱L-纈氨酸進一步向下的代謝途徑，使積累的L-纈氨酸不再消耗，可通過選育不能以L-纈氨酸為唯一碳源生長，即喪失L-纈氨酸分解能力的突變株來實現(xiàn)切斷進一步代謝途徑86選育營養(yǎng)缺陷型回復突變株當一個菌株由于突變而失去某一遺傳性狀之后，經(jīng)過回復突變可以再回復其原有遺傳性狀，這是因為當某一結構基因發(fā)生突變后，結構基因所編碼的酶就因結構的改變而失活。而經(jīng)過第二次回復突變后，該酶的活性中心結構就可以復原，而調節(jié)部位結構常常并沒有回復，結果是酶恢復了活性，但是反饋抑制卻已解除或并不怎么嚴重因此可以利用選育營養(yǎng)缺陷型回復突變株來提高發(fā)酵目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，例如選育α-乙酰乳酸合成酶缺陷突變株的回復突變株可以解除L-纈氨酸的反饋抑制以及L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸引起的多價阻遏選育營養(yǎng)缺陷型回復突變株當一個菌株由于突變而失去某一遺傳性87利用基因工程技術構建L-纈氨酸工程菌

Hoechst和Marquardt等將來源于大腸桿菌ATCC11303的ilvE基因片段克隆到pBR322質粒中，ilvE基因主要編碼L-纈氨酸轉氨基酶，將重組質粒轉化到大腸桿菌DG30中，所構建的工程菌株可以高產(chǎn)L-纈氨酸。Mitsubishi與味之素公司的科研人員等將棒桿菌中編碼乙酰氧肟酸基因的一段特殊的DNA序列插入到質粒載體中，再將構建的重組質粒轉化到棒桿菌中，所構建的工程菌可以高產(chǎn)L-纈氨酸利用基因工程技術構建L-纈氨酸工程菌

Hoechst和Mar88育種標記育種目的備注Leu-切斷L-亮氨酸的支路代謝。Ile-切斷L-異亮氨酸的支路代謝。2-TAr解除L-纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用；2-TA是L-亮氨酸和L-纈氨酸的結構類似物。α-ABr解除L-纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用。α-AB是L-纈氨酸的結構類似物。SGr增強菌體必需生長因子四氫葉酸的生物合成，從而促進氨基酸的生物合成。SG是對氨基苯甲酸的結構類似物。育種標記育種目的備注Leu-切斷L-亮氨酸的支路代謝89Chapter5L-異亮氨酸Chapter5L-異亮氨酸90L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調節(jié)機制

L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調節(jié)機制

91L-異亮氨酸的生物合成途徑

葡萄糖經(jīng)酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)二氧化碳固定反應生成四碳二羧酸，經(jīng)氨基化反應生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高絲氨酸脫氫酶的催化下生成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸激酶的催化下生成蘇氨酸，蘇氨酸經(jīng)蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥基酸合成酶和支鏈氨基酸谷氨酸轉氨酶的催化作用，生成L-異亮氨酸。L-異亮氨酸的生物合成途徑

葡萄糖經(jīng)酵解途徑生成磷酸烯醇式丙92L-異亮氨酸的反饋調節(jié)機制微生物合成L-異亮氨酸由于有正常的反饋調節(jié)機制，故不能過量合成，正常的反饋調節(jié)包括：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制天冬氨酸激酶受蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制高絲氨酸脫氫酶受蘇氨酸的反饋抑制和蛋氨酸的反饋阻遏蘇氨酸脫氨酶受L-異亮氨酸的反饋抑制乙酰羥基酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制分支鏈氨基酸合成酶受三種支鏈氨基酸（L-異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）的多價阻遏細胞內蘇氨酸水平的調節(jié)作用等。L-異亮氨酸的反饋調節(jié)機制微生物合成L-異亮氨酸由于有正常的93L-異亮氨酸產(chǎn)生菌常規(guī)育種思路

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌應具備的生化特征根據(jù)L-異亮氨酸生物合成途徑及代謝調節(jié)機制，L-異亮氨酸高產(chǎn)菌應具備以下生化特征：CO2固定反應能力強天冬氨酸合成酶能力強天冬氨酸激酶活力強高絲氨酸脫氫酶活力強蘇氨酸脫氨酶活力強乙酰羥基酸合成酶活力強二氫吡啶-2，6-二羧酸合成酶活力微弱或喪失琥珀酰高絲氨酸轉琥珀酰酶活力微弱或喪失谷氨酸脫氫酶活力弱。L-異亮氨酸產(chǎn)生菌常規(guī)育種思路

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌應具備的94切斷或減弱支路代謝

切斷或減弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比蘇氨酸優(yōu)先合成，蛋氨酸合成過量后才使代謝轉向合成蘇氨酸，進一步合成L-異亮氨酸，因此切斷或減弱蛋氨酸的合成支路有利于高產(chǎn)L-異亮氨酸?？蛇x育蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型Met-或MetL(滲漏突變)切斷或減弱支路代謝

切斷或減弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比蘇氨95切斷或削弱賴氨酸合成支路。由圖可以看出，選育賴氨酸缺陷型或滲漏突變株，即切斷或減弱由天冬氨酸半醛（ASA）向賴氨酸的合成支路。一方面可以起到節(jié)省碳源的作用，另一方面可以解除其對天冬氨酸激酶(AK)的反饋抑制，使代謝流更加流暢，造成異亮氨酸的前體物蘇氨酸大量積累，從而使異亮氨酸的積累量提高切斷或削弱賴氨酸合成支路。由圖可以看出，選育賴氨酸缺陷型或滲96切斷或減弱亮氨酸合成支路。選育亮氨酸缺陷或滲漏突變株，既可以解除亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸對分支鏈氨基酸生物合成酶系的多價阻遏，又可以避免不利于異亮氨酸精制操作的副產(chǎn)物氨基酸—正纈氨酸和高異亮氨酸的生成，從而有利于目的產(chǎn)物異亮氨酸的積累。這些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸經(jīng)亮氨酸生物合成途徑生成，為亮氨酸所調節(jié)。所以，對于異亮氨酸生產(chǎn)菌株來說，如能增加亮氨酸缺陷這一遺傳標記，就可以不生成正纈氨酸和高異亮氨酸，從而達到改良生產(chǎn)菌株的目的切斷或減弱亮氨酸合成支路。選育亮氨酸缺陷或滲漏突變株，既可以97解除菌體自身反饋調節(jié)

a.選育抗結構類似物突變株選育蘇氨酸結構類似物抗性突變株，如α-氨基-β-羥基戊酸（AHV）抗性、蘇氨酸氧肟酸鹽（ThrHx）抗性突變株，可解除蘇氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制。選育賴氨酸結構類似物抗性突變株，如S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突變株，可解除賴氨酸和蘇氨酸對天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制。選育異亮氨酸結構類似物抗性突變株。蘇氨酸脫氨酶是異亮氨酸生物合成途經(jīng)中的關鍵酶，受異亮氨酸的反饋抑制。選育α-氨基丁酸抗性（α-ABr）、異亮氨酸氧肟酸鹽抗性(IleHxr)、硫代異亮氨酸抗性(S-Iler)、三氟代亮氨酸抗性(TFLr)、α-噻唑丙氨酸抗性(α-TAr)、鄰甲基-L-蘇氨酸抗性(OMTr)、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)、α-溴丁酸抗性及D-蘇氨酸抗性突變株，可以遺傳性地解除異亮氨酸對蘇氨酸脫氨酶的反饋調節(jié)，從而有利于異亮氨酸的積累。選育蛋氨酸的結構類似物抗性突變株，如乙硫氨酸（Eth）抗性突變株，可解除蛋氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋阻遏作用。選育纈氨酸結構類似物抗性突變株，可解除支鏈氨基酸對乙酰羥基酸合成酶的協(xié)同反饋阻遏和纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制。解除菌體自身反饋調節(jié)

a.選育抗結構類似物突變株98增加前體物的合成增加前體物蘇氨酸的合成增加天冬氨酸的合成增加前體物的合成增加前體物蘇氨酸的合成99切斷進一步代謝途徑要大量積累異亮氨酸，需要切斷或減弱異亮氨酸進一步向下代謝的途徑，使積累的異亮氨酸不再被消耗。據(jù)報道，選育不能以異亮氨酸為唯一碳源生長，即喪失異亮氨酸分解能力的突變株，有助于異亮氨酸的大量積累。切斷進一步代謝途徑100謝謝謝謝101氨基酸代謝控制發(fā)酵機制

及育種策略

徐慶陽中國氨基酸技術服務中心氨基酸代謝控制發(fā)酵機制

及育種策略

徐慶陽中國氨基酸技術服務102目錄Chapter1代謝機制理論基礎Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-纈氨酸Chapter5L-異亮氨酸目錄Chapter1代謝機制理論基礎103Chapter1代謝機制理論基礎Chapter1代謝機制理論基礎104氨基酸發(fā)酵機制在一般情況下，微生物細胞只合成本身需要的中間代謝產(chǎn)物，嚴格防止氨基酸、核苷酸等中間物質的大量積累。當氨基酸或核苷酸等物質進入細胞后，微生物細胞立即停止該物質的合成，一直到所供應的養(yǎng)料消耗到很低濃度，微生物細胞才能重新開始進行該物質的合成。微生物細胞中這種調節(jié)控制作用主要靠兩個因素，即參與調節(jié)的有關酶的活性和酶量氨基酸發(fā)酵機制在一般情況下，微生物細胞只合成本身需要的中間105代謝控制機制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制。一方面，從DNA的分子水平上闡明了酶生物合成的控制機制，酶的合成像普通蛋白質的合成一樣，受到結構基因的控制，由結構基因決定形成酶分子的一級結構；另一方面,酶的生物合成還受代謝物（酶反應的底物、產(chǎn)物及其類似物）的控制和調節(jié)。當有誘導物存在時，酶的生成量可以幾倍乃至幾百倍的數(shù)量增加。相反，某些酶促反應的產(chǎn)物，特別是終產(chǎn)物，又能產(chǎn)生阻遏作用，使酶的合成量大大減少。代謝控制機制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重106參與氨基酸生物合成的關鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鳥氨酸轉氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高絲氨酸脫氫酶；⑦蘇氨酸脫水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸變位酶；11預苯酸脫水酶；12預苯酸脫氫酶。參與氨基酸生物合成的關鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸107一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點有關系的分支點酶（branchingenzyme）可以成為關鍵酶，但關鍵酶并不都是分支點酶。關鍵酶的關鍵效果也只是在特定的氨基酸生物合成過程中成立，而在其他氨基酸的生物合成過程中則不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在纈氨酸生物合成途徑中起主導性的關鍵酶作用，但在異亮氨酸的生物合成中，起主導性關鍵作用的卻是蘇氨酸脫水酶。該酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一階段，并且不是分支點酶。一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點有關系的分支點酶（br108反饋控制與優(yōu)先合成氨基酸生物合成的基本調節(jié)機制有反饋控制（反饋阻遏與反饋抑制）和在合成途徑分支點處的優(yōu)先合成如圖所示的反饋控制，由催化合成途徑最初反應A→B的初始酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋抑制和合成途徑上各種酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋阻遏組成。反饋控制與優(yōu)先合成109優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的酶活性遠遠大于b酶的酶活性，結果優(yōu)先合成E。E合成達到一定濃度時，就會抑制a酶，使代謝轉向合成G。G合成達到一定濃度時就會對c酶產(chǎn)生抑制作用優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶110平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E與G，由于a酶的酶活性遠遠大于b酶，結果優(yōu)先合成E。E過量后就會抑制a酶，使代謝轉向合成G。G過量后，就會拮抗或逆轉E的反饋抑制作用，結果代謝流又轉向合成E，如此循環(huán)平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分111微生物體內代謝過程的各種生物化學反應，都是由各種酶來催化的。按各種酶在代謝調節(jié)中作用的不同，又可將酶分為以下三類調節(jié)酶（常稱關鍵酶，與代謝調節(jié)關系密切）變構酶：通過酶分子構象的變化來改變酶活性的一類酶同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子結構不同的一類酶多功能酶：能夠催化兩種以上不同反應的一類酶靜態(tài)酶一般與代謝調節(jié)關系不大的一類酶潛在酶指酶原、非活性型或與抑制劑結合的酶微生物體內代謝過程的各種生物化學反應，都是由各種酶來催化的。112同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G過量時，酶Ⅱ停止活動，C也不能經(jīng)過F到G與此同時，酶I活力不受影響，A可以順利地到E，從而使G過量，但并不干擾E的合成同功酶113反饋抑制與反饋阻遏的比較項目類型反饋阻遏反饋抑制控制對象酶的生物合成酶的活性控制量終產(chǎn)物濃度終產(chǎn)物濃度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的構象變化控制裝置終產(chǎn)物與阻遏蛋白的親和力終產(chǎn)物與變構部位的親和力控制裝置的動作阻遏蛋白與操縱基因結合，通過變構效應，酶的結構發(fā)生變化不能合成mRNA形成的控制開、關控制控制酶活性大小反應遲緩、粗的控制迅速、精確的控制代謝途徑無定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點等無定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點等細胞經(jīng)濟高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反應生成物)反饋抑制與反饋阻遏的比較項目反饋阻遏反饋抑制控制對象酶的生物114協(xié)同反饋抑制或稱多價反饋抑制當一條代謝途徑中有兩個以上終產(chǎn)物時，任何一個終產(chǎn)物都不能單獨抑制途徑第一個共同的酶促反應，但當兩者同時過剩時，它們協(xié)同抑制第一個酶反應協(xié)同反饋抑制或稱多價反饋抑制115合作反饋抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反饋抑制也可稱為增效反饋抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。這種反饋抑制不同于協(xié)同反饋抑制，也不同于積累反饋抑制當任何一個終產(chǎn)物單獨過剩時，只部分地反饋抑制第一個酶的活性，只有當G、E兩個終產(chǎn)物同時過剩存在時，才能引起強烈抑制，其抑制程度大于各自單獨存在的和合作反饋抑制（Cooperativefeedbackin116積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在積累反饋抑制中，每一個最終產(chǎn)物只單獨地、部分地抑制共同步驟的第一個酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響。所以幾個最終產(chǎn)物同時存在時，它們的抑制作用是積累的積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinh117順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinhibition)順序反饋抑制的過程是：F積累，停止D→E反應，減少F的進一步合成，更多的D轉到G，再由G合成I或K；I積累，抑制G→H的反應；K積累，抑制G→J的反應，結果造成G的積累，引起G對A→B的反饋抑制，使整個途徑停止假反饋抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反饋抑制是指結構類似物引起的反饋抑制順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinh118Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸119谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸生物合成的理想途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應120谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途徑）戊糖磷酸途徑（pentosephosphatepathway，HMP途徑）三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反應）等谷氨酸的生物合成包括121生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應轉氨酶（AT）催化的轉氨反應生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基122谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應123轉氨酶（AT）催化的轉氨反應轉氨酶（AT）催化的轉氨反應124谷氨酸合成酶（GS）催化的反應生成谷氨酸的主要酶反應谷氨酸合成酶（GS）催化的反應生成谷氨酸的主要酶反應125谷氨酸合成酶（GS）催化的反應谷氨酸合成酶（GS）催化的反應126由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑127

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途徑C6H12O6+NH3+3/2O2128由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩爾葡萄糖可以生成1摩爾的谷氨酸，因此理論糖酸轉化率為81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的129谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑130葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個途徑生成丙酮酸。其中以EMP途徑為主，生物素充足時HMP所占比例是38%，控制生物素亞適量，發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例約為26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應生成草酰乙酸或蘋果酸，催化CO2固定反應的酶有丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經(jīng)還原氨基化反應生成谷氨酸谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個途徑生成丙酮酸。其中以EMP途131控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脫氫酶活力微弱谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。喪失α-酮戊二酸脫氫酶的重要性已經(jīng)用要求生物素和不分泌谷氨酸的大腸桿菌得以證明。甚至發(fā)現(xiàn)不要求生物素的一株喪失α-酮戊二酸脫氫酶的突變株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其親株卻什么也不分泌。谷氨酸產(chǎn)生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏條件下，三羧酸循環(huán)到達α-酮戊二酸時，即受到阻擋。把糖代謝流阻止在α-酮戊二酸的堰上，對導向谷氨酸形成具有重要意義。在銨離子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脫氫酶的催化作用，經(jīng)還原氨基化反應生成谷氨酸。谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑132谷氨酸脫氫酶活性強谷氨酸脫氫酶活性強133細胞膜對谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低細胞內產(chǎn)物的濃度，消除了谷氨酸轉化成其它代謝物的可能，減低了對谷氨酸脫氫酶的抑制，并使谷氨酸的生成途徑暢通。由生物素亞適量可造成細胞膜對產(chǎn)物的高通透性。生物素改變細胞膜通透性的機制與影響細胞膜磷脂的含量及成分有關。還可通過添加表面活性劑、高級飽和脂肪酸，或青霉素等控制細胞膜對谷氨酸的通透性。通過選育溫度敏感突變株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突變株也可控制細胞膜對谷氨酸的通透性。細胞膜對谷氨酸的通透性高134CO2固定酶系活力強Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力強乙醛酸循環(huán)弱異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力強Citratesynthase,Ac135乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補給途徑在菌體生長期之后，進入谷氨酸生成期，為了大量生成、積累谷氨酸，最好沒有異檸檬酸裂解酶催化反應，封閉乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧136谷氨酸生物合成的調節(jié)機制優(yōu)先合成與反饋調節(jié)糖代謝的調節(jié)氮代謝的調節(jié)谷氨酸生物合成的調節(jié)機制優(yōu)先合成與反饋調節(jié)137優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強，故優(yōu)先合成谷氨酸。優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制α-酮戊二酸合成后由138反饋調節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-檸檬酸合成酶3-異檸檬酸脫氫酶4-α-酮戊二酸脫氫酶5-谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調節(jié)機制1-磷酸烯醇式丙酮酸139優(yōu)先合成

谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調節(jié)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反應的關鍵酶，受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏優(yōu)先合成與反饋調節(jié)優(yōu)先合成優(yōu)先合成與反饋調節(jié)140檸檬酸合成酶的調節(jié)

檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，除受能荷調節(jié)外，還受谷氨酸的反饋阻遏和烏頭酸的反饋抑制異檸檬酸脫氫酶的調節(jié)

細胞內α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當α-酮戊二酸過量時對異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成α-酮戊二酸優(yōu)先合成與反饋調節(jié)檸檬酸合成酶的調節(jié)優(yōu)先合成與反饋調節(jié)141α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié)

在谷氨酸產(chǎn)生菌中，α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱谷氨酸脫氫酶的調節(jié)

谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋阻遏谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強，故優(yōu)先合成谷氨酸優(yōu)先合成與反饋調節(jié)α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié)優(yōu)先合成與反饋調節(jié)142糖代謝的調節(jié)能荷細胞所處的能量狀態(tài)用ATP、ADP和AMP之間的關系來表示，稱為能荷（energycharge）能荷值在0和1之間變動。已知大多數(shù)細胞的能荷處于0.80到0.95之間，處于一種動態(tài)平衡）糖代謝的調節(jié)能荷能荷值在0和1之間變動。已知大多數(shù)細胞的143糖代謝的調節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調節(jié)如圖所示，當生物體內即能荷降低，就會激活某些催化糖類分解的酶或解除ATP對這些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），從而加速糖酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過氧化磷酸化作用生成ATP。當能荷高時，就會抑制糖元降解、糖酵解和TCA循環(huán)的關鍵酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶，并激活糖類合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，從而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-檸檬酸合成酶4-異檸檬酸脫氫酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代謝的調節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調節(jié)如圖所示，當生物體內144糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝速率的影響

生物素對糖代謝速率的影響，主要是影響糖降解速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提高，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，因而會引起乳酸的溢出生物素對CO2固定反應的影響生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應，據(jù)報道，生物素大過量時（100g/L以上），CO2固定反應可提高30%糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)145糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)生物素對乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導形成的異檸檬酸裂解酶就很少由于異檸檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的合成，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動糖代謝的調節(jié)生物素對糖代謝的調節(jié)146氮代謝的調節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉化成其它氨基酸和參與蛋白質的合成在生物素亞適量時，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應停滯，同時又由于完全氧化降低的結果，使ATP形成量減少，導致蛋白質合成活動停滯，在銨離子適量存在下，使得菌體生成積累谷氨酸生成的谷氨酸也不通過轉氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質在生物素充足條件下，異檸檬酸裂解酶活力增強，琥珀酸氧化力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酸乙酸、蘋果酸脫羧反應增強，蛋白質合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代謝的調節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成能力147谷氨酸細胞膜滲透性的控制細胞膜的結構控制細胞膜滲透性的方法谷氨酸細胞膜滲透性的控制細胞膜的結構148氨基酸代謝控制發(fā)酵機制及育種策略課件149細胞膜的脂質主要是磷脂，每一個磷脂分子由一個帶正電荷且能溶于水的極性頭和一個不帶電荷、不溶于水的非極性尾所構成,極性頭朝向膜的內外兩個表面，呈親水性；而非極性的疏水尾則埋藏在膜的內層，從而形成一個磷脂雙分子層。膜內的蛋白質有的是酶，有的是攜帶胞外物質進入細胞的載體蛋白，鑲嵌或埋在脂質雙層內或附著在它的表面，主要分為嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖鏈主要朝向外表面。細胞膜是一個選擇性半滲透性膜，它的重要生理功能是控制細胞內外物質的運送和交換，是細胞同外界環(huán)境進行物質交換和信息交流的接觸面。通過改變細胞膜的組成成分可改變膜的滲透性。細胞膜的脂質主要是磷脂，每一個磷脂分子由一個帶正電荷且能溶于150控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成作用機制：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成。當磷脂合成減少到正常量的一半左右時，細胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成151控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性劑使用生物素過量的原料（如糖蜜等）發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過添加表面活性劑（如吐溫60）或是高級飽和脂肪酸（C16～18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透障礙物，大量積累谷氨酸作用機制：表面活性劑、高級飽和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通過拮抗脂肪酸的生物合成，導致磷脂合成不足，結果形成磷脂不足的細胞膜，提高了細胞膜對谷氨酸的滲透性控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成152控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酸培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成。作用機制：由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細胞膜的滲透性；通過控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸分泌于細胞外控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成153控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成作用機制：甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失α-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長。在甘油限量供應下，由于控制了細胞膜中與滲透性有直接關系的磷脂含量，從而使谷氨酸得以積累控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成154控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成溫度敏感突變株溫度敏感突變株是通過誘變得到的在低溫下生長，而在高溫下卻不能生長繁殖的突變株。利用溫度敏感突變株進行谷氨酸發(fā)酵時，由于僅控制溫度就能實現(xiàn)谷氨酸生產(chǎn)，所以又把這種新工藝稱為物理控制方法。作用機制：溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜的結構基因上，發(fā)生堿基的轉換或顛換，這樣為基因所指導譯出的酶，在高溫時失活，導致細胞膜某些結構的改變控制細胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成155控制細胞壁的合成通過控制細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜，間接控制細胞膜通透性。這可以通過在發(fā)酵對數(shù)生長期的早期，添加青霉素或頭孢霉素C等抗生素來實現(xiàn)。作用機制：添加青霉素是抑制谷氨酸產(chǎn)生菌細胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉肽酶，影響細胞壁糖肽的生物合成控制細胞壁的合成通過控制細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進156日常菌種工作定期分純

一般1～2個月分純—次，把產(chǎn)酸高、生長快、無噬菌體感染的菌株挑選出來小劑量誘變刺激用紫外線(10～20s)、通電、激光等輕微處理，可以淘汰生長微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑選出來的菌是產(chǎn)酸高、生長旺盛、無噬菌體感染的優(yōu)良菌株高產(chǎn)菌制做安瓿管通過誘變育種或分純挑出