雙水相系統(tǒng)課件

19雙水相萃取19雙水相萃取119.1雙水相的形成親水性的聚合物溶液熵增——混合——自發(fā)分子間作用力------隨著Mr的增加,而增大.聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象.相圖:相平衡時(shí)物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系.19.1雙水相的形成親水性的聚合物溶液219.1雙水相的形成雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)1、Pro如何分布2、影響因素3、應(yīng)用19.1雙水相的形成雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-319.2 ATPS相圖雙節(jié)線(bi-nodal)：

圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS。

系線(tieline)：

雙節(jié)線上兩點(diǎn)的直線。系線反映的信息A杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則B性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對(duì)差別的尺度,系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.C 臨界點(diǎn)(criticalpoint)：當(dāng)系線長度趨于零時(shí),兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如K點(diǎn)。

19.2 ATPS相圖雙節(jié)線(bi-nodal)：419.3 蛋白質(zhì)的分配平衡

1)分配系數(shù)m2)m貢獻(xiàn)因子me、mb和ma分別為靜電、疏水和親和作用對(duì)溶質(zhì)m的貢獻(xiàn).

19.3 蛋白質(zhì)的分配平衡1)分配系數(shù)m53)、靜電作用非電解質(zhì)型溶質(zhì):電中性蛋白質(zhì)的m0：

式中,M:溶質(zhì)分子量;:溶質(zhì)在上下兩相表面自由能的差,J/mol。意義：A 不受靜電作用的影響(因不帶電);B一般>0，不同溶質(zhì)lnm隨M而；C ATPS不同,同一溶質(zhì)的也就不同，m隨ATPS不同而改變。圖是不同pro在pH為各pro的pI的ATPS中的m,3)、靜電作用6道南電位(,Donnanpotential)實(shí)際ATPS中有電解質(zhì),當(dāng)這些離子在兩相中m1),將兩相間產(chǎn)生電位差

帶電pro的m:意義：A 荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.B 由于同一ATPS中添加不同的鹽產(chǎn)生的不同,故m與Zpro的關(guān)系因鹽而異。道南電位(,Donnanpotential)74)疏水作用相間疏水因子(HF,hydrophobicfactor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性較大,相間的疏水性差用HF表示.HF可通過測(cè)定疏水性已知的aa在其pI處的maa測(cè)算:RH-aa相對(duì)疏水性(relativehydrophobicity).是通過測(cè)定aa在水和已醇中溶解度的差別確定的,并設(shè)疏水性最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B為:mGly為Gly分配系數(shù).所以,pH=pL時(shí)aa在ATPS中的分配系數(shù)與其RH值呈線性關(guān)系,直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的HF值.圖為測(cè)定實(shí)例.雙水相系統(tǒng)課件8Pro表面疏水性(HFS,HFofsurface)利用上式可確定不同ATPS的HF值.如在pH=pI的ATPS中,pro的m0與HF值之間呈線性關(guān)系,則直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)的HFS圖為蛋白質(zhì)的m0與HF的實(shí)測(cè)關(guān)系圖。圖的結(jié)果示：pro的HFS隨NaCl濃度的增大而增大。將鹽對(duì)pro的HF影響上式得：其中HFSsalt為鹽增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式

Pro表面疏水性(HFS,HFofsurface)919.4影響蛋白質(zhì)m的綜合因素1)成相聚合物濃度和分子量分子量M:若降低聚合物的M，則pro分配于富含該聚合物的相中。如PEG/DX系統(tǒng)，若降低DX的M，則m減小。這一規(guī)律具有普遍意義。成相系統(tǒng)的總濃度：增大時(shí),系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn),系線長度增加,兩相性質(zhì)的差別(疏水性等)增大,蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)將偏離臨界點(diǎn)處的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物質(zhì)的總濃度越高,系線越長,蛋白質(zhì)越容易分配于其中的某一相..19.4影響蛋白質(zhì)m的綜合因素1)成相聚合物濃度和分子量10存在問題：當(dāng)系線長度增加時(shí),系統(tǒng)的表面張力增大,可能導(dǎo)致溶質(zhì)在界面上的吸附.這種現(xiàn)象在處理含細(xì)胞和固體微粒的料液時(shí)尤為嚴(yán)重,細(xì)胞或固體微粒容易集中在界面上,給萃取操作帶來因難,.但對(duì)于可溶性蛋白質(zhì).這種界面吸附現(xiàn)象很少發(fā)生,一般可不考慮。存在問題：當(dāng)系線長度增加時(shí),系統(tǒng)的表面張力增大,可能導(dǎo)致溶質(zhì)112)鹽：圖為各種離子在PEF/DX系統(tǒng)中的m.圖示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)離子在PEG/DX系統(tǒng)的m小,因此利用pH>7的磷酸鹽buffer很容易改變,使帶負(fù)電pro有較高的m.HFS：鹽的種類和濃度影響pro的HFS,從而影響pro的m。當(dāng)鹽的濃度很大時(shí)(如>1mol/dm3),由于強(qiáng)烈的鹽析，蛋白質(zhì)的溶解度達(dá)到極限，表現(xiàn)分配系數(shù)增大，此時(shí)m與pro濃度有關(guān)。利用這一特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)ATPS鹽濃度，可選擇性萃取不同的pro。不良影響：改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。如PEG/Kpi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重組)的PEG和磷鉀濃度。2)鹽123)、pHvalueA(pH–pI)valuepro(Z)lnm(pH–pI)valuepro(Z)lnm13B交錯(cuò)分配法(crosspartitioning):當(dāng)加入不同種類的鹽時(shí)，由于相間電位不同，lnm–pH關(guān)系曲線也不一樣。但在pro的pI處，由于Z=0，m應(yīng)相同，即兩條關(guān)系曲線交于一點(diǎn)。所以,通過測(cè)定不同鹽類存在下lnm–pH曲線的交點(diǎn),可測(cè)定蛋白質(zhì)\細(xì)胞器以及微粒的pI。C pH影響磷酸鹽解離：即影響PEG/Kpi系統(tǒng)的相間電位和蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。對(duì)某些pro,pH的很小變化會(huì)使m改變2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。雙水相系統(tǒng)課件144)溫度溫度影響小,一般溫度改變不影響產(chǎn)物的萃取。大規(guī)模操作一般在室溫下進(jìn)行,不需冷卻。這是基于： (1)成相聚合物PEG對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用,常溫下蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生變性; (2)常溫下溶液粘度較低,容易相分離; (3)常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用.4)溫度15體系的選擇和優(yōu)化1）體系選擇的原則：基本公式：根據(jù)目標(biāo)pro和共存雜質(zhì)的HFS\M\pI\Z等的差別,綜合利用靜電、疏水和添加適當(dāng)種類和濃度的鹽，可選擇性萃取目標(biāo)產(chǎn)物。若目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的表面疏水性HFS相差較大，充分發(fā)揮鹽析作用；提高成相系統(tǒng)的濃度(系線長度)，增大ATPS的HF，也是選擇性萃取的重要手段。體系的選擇和優(yōu)化1）體系選擇的原則：16改變系線長度還可以使細(xì)胞碎片選擇性分配與于PEG/鹽系統(tǒng)的下相；采用M較大的PEG可降低pro的m，使萃取到PEG相的pro總量減少，從而提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性。例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系統(tǒng),可從細(xì)胞勻漿液中將半乳酸糖苷提純12倍,而使用低分子量PEG時(shí),萃取的選擇性降低[17].此外,在磷酸鹽存在下于pH7的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)pH也可提高目標(biāo)產(chǎn)物的萃取選擇性.改變系線長度還可以使細(xì)胞碎片選擇性分配與于PEG/鹽系統(tǒng)的下17在上述理論基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn),可確定最佳萃取系統(tǒng).雙水相萃取放大容易:一般10ml離心管的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接放大到工業(yè)規(guī)模.因此,常利用多組10ml刻度離心管,進(jìn)行分配平衡實(shí)驗(yàn).具體實(shí)驗(yàn)步驟如下.(1)配制一系列不同濃度、pH及離子強(qiáng)度的雙水相,每個(gè)雙水相改變一個(gè)參數(shù).其中pH通常用磷酸鹽緩沖液或氨酸調(diào)節(jié).(2)加入料液,再加水使整個(gè)系統(tǒng)質(zhì)量達(dá)到5~10g.離心管封口后充分混合;(3)在1800~2000g下離心3~5min,使兩相完全分離;(4)小心地用吸管或移液管將上相和下相分別吸出,測(cè)定上、下相中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度或生物活性,計(jì)算分配系數(shù).上、下兩相中目標(biāo)產(chǎn)物的總量應(yīng)與加入量對(duì)比，以檢驗(yàn)是否存在沉淀或界面吸附現(xiàn)象，并可確認(rèn)濃度或活性測(cè)定中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

在上述理論基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn),可確定最佳萃取系統(tǒng).雙水1819.5應(yīng)用1)蛋白質(zhì)、酶的純化2)多肽的分離純化19.5應(yīng)用1)蛋白質(zhì)、酶的純化193)核酸的分離純化3)核酸的分離純化204)、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器的分離4)、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器的分離21

反膠束萃取

（反膠團(tuán)萃?。┓茨z束萃221 基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨[S]增大而下降。當(dāng)[S]達(dá)到一定值后，S締合形成水溶性膠束,溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低。膠團(tuán)形成均是S分子自聚集的結(jié)果，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。自組裝(self-assembly):

自動(dòng)有序聚集的過程臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentration,CMC):S在水溶劑中形成膠束的最低濃度。1 基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑23反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中加入一定濃度S，在有機(jī)溶劑中所會(huì)形成膠束。當(dāng)形成反膠束時(shí)，水在有機(jī)相中的溶解隨[S]線性增大。因此，可通過測(cè)定有機(jī)相中平衡水濃度的變化，確定形成反膠團(tuán)的最低表面活性劑濃度。反膠束的形態(tài)：球形或近似球形，也呈柱狀。極性核(polarcore):S分子的自組裝形成了極性核。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中24雙水相系統(tǒng)課件252 基本性質(zhì)內(nèi)水池直徑d：反膠束的大小與溶劑和S的種類與濃度、溫度、I等因素有關(guān)，一般為5-20nm，d用下式計(jì)算：

W0-有機(jī)相中水與S的摩爾比，又稱為含水率(watercontent)；M-水分子質(zhì)量；asurf-界面處一個(gè)S的面積；N-阿弗加德羅常數(shù)。內(nèi)水的性質(zhì)：當(dāng)W0較低(如S=AOT,W0=6-8)時(shí),微水相的水分子受S親水基團(tuán)的強(qiáng)烈束縛,表觀粘度上升50倍,疏水性也極高。隨W0的增大,這些現(xiàn)象逐漸減弱,當(dāng)W0>16時(shí),微水相的水與正常的水接近,反膠團(tuán)內(nèi)可形成雙電層。但即使當(dāng)W0值很大,水池內(nèi)水的理化性質(zhì)也不能與正常的水完全相同,特別是在接近S親水頭的區(qū)域內(nèi)。2 基本性質(zhì)26AOT反膠團(tuán)直徑dAOT:常用于制備反膠束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉,商品名為AerosolOT,即AOT。其在異辛烷中形成反膠團(tuán)dAOT:

第1項(xiàng)為水核直徑，第二項(xiàng)(2*1.2nm)為二倍AOT分子長度.一般反膠團(tuán)的W0不超過40.因此,依據(jù)上式,利用ATO形成的水核直徑一般不超過12nm,大致可容納一個(gè)直徑為5-10nm的pro分子.當(dāng)pro分子比與反膠團(tuán)直徑相比大得多時(shí)(如,當(dāng)M>100-200kD),難于溶解到反膠團(tuán)中.AOT反膠團(tuán)直徑dAOT:常用于制備反膠束的S是二-(2-273 反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用： 反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。3 反膠束的溶解作用28蛋白質(zhì)溶解模型：

a、水殼模型：蛋白質(zhì)位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠團(tuán)壁隔開；

b、半島模型：pro表面存在強(qiáng)烈疏水區(qū)，該區(qū)直接與有機(jī)相接觸； c、pro吸附于反膠團(tuán)內(nèi)壁； d、pro疏水區(qū)與幾個(gè)反膠團(tuán)的S疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個(gè)小反膠團(tuán)所“溶解”。蛋白質(zhì)溶解模型：293 反膠束的溶解作用溶解推動(dòng)力A 靜電作用：

理論上,當(dāng)溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時(shí),由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團(tuán),溶解率或分配系數(shù)較大,反之,則不能溶解到反膠團(tuán)相中,左圖為pH值對(duì)不同蛋白質(zhì)的溶解率急劇變化,當(dāng)pH,即在帶正電荷的pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃取起決定性作用。3 反膠束的溶解作用溶解推動(dòng)力303 反膠束的溶解作用B 空間相互作用

鹽濃度增大對(duì)反膠團(tuán)相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團(tuán)直徑減小,空間排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與I-0.5成正比。圖中W0與NaCl濃度關(guān)系為:圖還示：AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與AOT濃度無關(guān),這是多數(shù)反膠團(tuán)系統(tǒng)的共性.3 反膠束的溶解作用B 空間相互作用31在各pro的pI處(排除了靜電相互作用的影響)，反膠團(tuán)萃取實(shí)驗(yàn)研究表明:隨著M增大,pro的分配系數(shù)(m,溶解率)下降。當(dāng)M>20KD時(shí),m很小.表明隨M增大,空間排阻作用增大,pro的溶解率降低.圖的結(jié)果還表明,要據(jù)pro間M的差別可以選擇性對(duì)pro進(jìn)行萃取分離。C 疏水性相互作用aa的疏水性各不相同,研究表明,除pH和I外,aa或肽的m隨aa疏水性的增大而增大[39].蛋白質(zhì)的疏水性影響其在反膠團(tuán)中的溶解形式,因而影響其分配系數(shù).疏水性較大的pro可能以“半島式”形式溶解。D 分配系數(shù)m(orK):在各pro的pI處(排除了靜電相互作用的影響)，反膠團(tuán)萃取實(shí)324 反膠束萃取的操作A 萃取的基本方法B 反萃取.

C分級(jí)萃取4 反膠束萃取的操作C分級(jí)萃取335 反膠束萃取的影響因素1)pHvalueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉。5 反膠束萃取的影響因素1)pHvalue342)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性2)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性353)、鹽離子的種類3)、鹽離子的種類364)蛋白質(zhì)分子量M4)蛋白質(zhì)分子量M375)、表面活性劑SA 種類B [S]5)、表面活性劑S386)助表面活性劑6)助表面活性劑396 應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離6 應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離406 應(yīng)用2)胞內(nèi)酶的提取3)蛋白質(zhì)復(fù)性(proteinrefolding)6 應(yīng)用2)胞內(nèi)酶的提取3)蛋白質(zhì)復(fù)性(protein41思考題思考題4219雙水相萃取19雙水相萃取4319.1雙水相的形成親水性的聚合物溶液熵增——混合——自發(fā)分子間作用力------隨著Mr的增加,而增大.聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象.相圖:相平衡時(shí)物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系.19.1雙水相的形成親水性的聚合物溶液4419.1雙水相的形成雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)1、Pro如何分布2、影響因素3、應(yīng)用19.1雙水相的形成雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-4519.2 ATPS相圖雙節(jié)線(bi-nodal)：

圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS。

系線(tieline)：

雙節(jié)線上兩點(diǎn)的直線。系線反映的信息A杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則B性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對(duì)差別的尺度,系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.C 臨界點(diǎn)(criticalpoint)：當(dāng)系線長度趨于零時(shí),兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如K點(diǎn)。

19.2 ATPS相圖雙節(jié)線(bi-nodal)：4619.3 蛋白質(zhì)的分配平衡

1)分配系數(shù)m2)m貢獻(xiàn)因子me、mb和ma分別為靜電、疏水和親和作用對(duì)溶質(zhì)m的貢獻(xiàn).

19.3 蛋白質(zhì)的分配平衡1)分配系數(shù)m473)、靜電作用非電解質(zhì)型溶質(zhì):電中性蛋白質(zhì)的m0：

式中,M:溶質(zhì)分子量;:溶質(zhì)在上下兩相表面自由能的差,J/mol。意義：A 不受靜電作用的影響(因不帶電);B一般>0，不同溶質(zhì)lnm隨M而；C ATPS不同,同一溶質(zhì)的也就不同，m隨ATPS不同而改變。圖是不同pro在pH為各pro的pI的ATPS中的m,3)、靜電作用48道南電位(,Donnanpotential)實(shí)際ATPS中有電解質(zhì),當(dāng)這些離子在兩相中m1),將兩相間產(chǎn)生電位差

帶電pro的m:意義：A 荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.B 由于同一ATPS中添加不同的鹽產(chǎn)生的不同,故m與Zpro的關(guān)系因鹽而異。道南電位(,Donnanpotential)494)疏水作用相間疏水因子(HF,hydrophobicfactor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性較大,相間的疏水性差用HF表示.HF可通過測(cè)定疏水性已知的aa在其pI處的maa測(cè)算:RH-aa相對(duì)疏水性(relativehydrophobicity).是通過測(cè)定aa在水和已醇中溶解度的差別確定的,并設(shè)疏水性最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B為:mGly為Gly分配系數(shù).所以,pH=pL時(shí)aa在ATPS中的分配系數(shù)與其RH值呈線性關(guān)系,直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的HF值.圖為測(cè)定實(shí)例.雙水相系統(tǒng)課件50Pro表面疏水性(HFS,HFofsurface)利用上式可確定不同ATPS的HF值.如在pH=pI的ATPS中,pro的m0與HF值之間呈線性關(guān)系,則直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)的HFS圖為蛋白質(zhì)的m0與HF的實(shí)測(cè)關(guān)系圖。圖的結(jié)果示：pro的HFS隨NaCl濃度的增大而增大。將鹽對(duì)pro的HF影響上式得：其中HFSsalt為鹽增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式

Pro表面疏水性(HFS,HFofsurface)5119.4影響蛋白質(zhì)m的綜合因素1)成相聚合物濃度和分子量分子量M:若降低聚合物的M，則pro分配于富含該聚合物的相中。如PEG/DX系統(tǒng)，若降低DX的M，則m減小。這一規(guī)律具有普遍意義。成相系統(tǒng)的總濃度：增大時(shí),系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn),系線長度增加,兩相性質(zhì)的差別(疏水性等)增大,蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)將偏離臨界點(diǎn)處的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物質(zhì)的總濃度越高,系線越長,蛋白質(zhì)越容易分配于其中的某一相..19.4影響蛋白質(zhì)m的綜合因素1)成相聚合物濃度和分子量52存在問題：當(dāng)系線長度增加時(shí),系統(tǒng)的表面張力增大,可能導(dǎo)致溶質(zhì)在界面上的吸附.這種現(xiàn)象在處理含細(xì)胞和固體微粒的料液時(shí)尤為嚴(yán)重,細(xì)胞或固體微粒容易集中在界面上,給萃取操作帶來因難,.但對(duì)于可溶性蛋白質(zhì).這種界面吸附現(xiàn)象很少發(fā)生,一般可不考慮。存在問題：當(dāng)系線長度增加時(shí),系統(tǒng)的表面張力增大,可能導(dǎo)致溶質(zhì)532)鹽：圖為各種離子在PEF/DX系統(tǒng)中的m.圖示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)離子在PEG/DX系統(tǒng)的m小,因此利用pH>7的磷酸鹽buffer很容易改變,使帶負(fù)電pro有較高的m.HFS：鹽的種類和濃度影響pro的HFS,從而影響pro的m。當(dāng)鹽的濃度很大時(shí)(如>1mol/dm3),由于強(qiáng)烈的鹽析，蛋白質(zhì)的溶解度達(dá)到極限，表現(xiàn)分配系數(shù)增大，此時(shí)m與pro濃度有關(guān)。利用這一特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)ATPS鹽濃度，可選擇性萃取不同的pro。不良影響：改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。如PEG/Kpi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重組)的PEG和磷鉀濃度。2)鹽543)、pHvalueA(pH–pI)valuepro(Z)lnm(pH–pI)valuepro(Z)lnm55B交錯(cuò)分配法(crosspartitioning):當(dāng)加入不同種類的鹽時(shí)，由于相間電位不同，lnm–pH關(guān)系曲線也不一樣。但在pro的pI處，由于Z=0，m應(yīng)相同，即兩條關(guān)系曲線交于一點(diǎn)。所以,通過測(cè)定不同鹽類存在下lnm–pH曲線的交點(diǎn),可測(cè)定蛋白質(zhì)\細(xì)胞器以及微粒的pI。C pH影響磷酸鹽解離：即影響PEG/Kpi系統(tǒng)的相間電位和蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。對(duì)某些pro,pH的很小變化會(huì)使m改變2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。雙水相系統(tǒng)課件564)溫度溫度影響小,一般溫度改變不影響產(chǎn)物的萃取。大規(guī)模操作一般在室溫下進(jìn)行,不需冷卻。這是基于： (1)成相聚合物PEG對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用,常溫下蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生變性; (2)常溫下溶液粘度較低,容易相分離; (3)常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用.4)溫度57體系的選擇和優(yōu)化1）體系選擇的原則：基本公式：根據(jù)目標(biāo)pro和共存雜質(zhì)的HFS\M\pI\Z等的差別,綜合利用靜電、疏水和添加適當(dāng)種類和濃度的鹽，可選擇性萃取目標(biāo)產(chǎn)物。若目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的表面疏水性HFS相差較大，充分發(fā)揮鹽析作用；提高成相系統(tǒng)的濃度(系線長度)，增大ATPS的HF，也是選擇性萃取的重要手段。體系的選擇和優(yōu)化1）體系選擇的原則：58改變系線長度還可以使細(xì)胞碎片選擇性分配與于PEG/鹽系統(tǒng)的下相；采用M較大的PEG可降低pro的m，使萃取到PEG相的pro總量減少，從而提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性。例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系統(tǒng),可從細(xì)胞勻漿液中將半乳酸糖苷提純12倍,而使用低分子量PEG時(shí),萃取的選擇性降低[17].此外,在磷酸鹽存在下于pH7的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)pH也可提高目標(biāo)產(chǎn)物的萃取選擇性.改變系線長度還可以使細(xì)胞碎片選擇性分配與于PEG/鹽系統(tǒng)的下59在上述理論基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn),可確定最佳萃取系統(tǒng).雙水相萃取放大容易:一般10ml離心管的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接放大到工業(yè)規(guī)模.因此,常利用多組10ml刻度離心管,進(jìn)行分配平衡實(shí)驗(yàn).具體實(shí)驗(yàn)步驟如下.(1)配制一系列不同濃度、pH及離子強(qiáng)度的雙水相,每個(gè)雙水相改變一個(gè)參數(shù).其中pH通常用磷酸鹽緩沖液或氨酸調(diào)節(jié).(2)加入料液,再加水使整個(gè)系統(tǒng)質(zhì)量達(dá)到5~10g.離心管封口后充分混合;(3)在1800~2000g下離心3~5min,使兩相完全分離;(4)小心地用吸管或移液管將上相和下相分別吸出,測(cè)定上、下相中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度或生物活性,計(jì)算分配系數(shù).上、下兩相中目標(biāo)產(chǎn)物的總量應(yīng)與加入量對(duì)比，以檢驗(yàn)是否存在沉淀或界面吸附現(xiàn)象，并可確認(rèn)濃度或活性測(cè)定中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

在上述理論基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn),可確定最佳萃取系統(tǒng).雙水6019.5應(yīng)用1)蛋白質(zhì)、酶的純化2)多肽的分離純化19.5應(yīng)用1)蛋白質(zhì)、酶的純化613)核酸的分離純化3)核酸的分離純化624)、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器的分離4)、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器的分離63

反膠束萃取

（反膠團(tuán)萃取）反膠束萃641 基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨[S]增大而下降。當(dāng)[S]達(dá)到一定值后，S締合形成水溶性膠束,溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低。膠團(tuán)形成均是S分子自聚集的結(jié)果，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。自組裝(self-assembly):

自動(dòng)有序聚集的過程臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentration,CMC):S在水溶劑中形成膠束的最低濃度。1 基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑65反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中加入一定濃度S，在有機(jī)溶劑中所會(huì)形成膠束。當(dāng)形成反膠束時(shí)，水在有機(jī)相中的溶解隨[S]線性增大。因此，可通過測(cè)定有機(jī)相中平衡水濃度的變化，確定形成反膠團(tuán)的最低表面活性劑濃度。反膠束的形態(tài)：球形或近似球形，也呈柱狀。極性核(polarcore):S分子的自組裝形成了極性核。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中66雙水相系統(tǒng)課件672 基本性質(zhì)內(nèi)水池直徑d：反膠束的大小與溶劑和S的種類與濃度、溫度、I等因素有關(guān)，一般為5-20nm，d用下式計(jì)算：

W0-有機(jī)相中水與S的摩爾比，又稱為含水率(watercontent)；M-水分子質(zhì)量；asurf-界面處一個(gè)S的面積；N-阿弗加德羅常數(shù)。內(nèi)水的性質(zhì)：當(dāng)W0較低(如S=AOT,W0=6-8)時(shí),微水相的水分子受S親水基團(tuán)的強(qiáng)烈束縛,表觀粘度上升50倍,疏水性也極高。隨W0的增大,這些現(xiàn)象逐漸減弱,當(dāng)W0>16時(shí),微水相的水與正常的水接近,反膠團(tuán)內(nèi)可形成雙電層。但即使當(dāng)W0值很大,水池內(nèi)水的理化性質(zhì)也不能與正常的水完全相同,特別是在接近S親水頭的區(qū)域內(nèi)。2 基本性質(zhì)68AOT反膠團(tuán)直徑dAOT:常用于制備反膠束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉,商品名為AerosolOT,即AOT。其在異辛烷中形成反膠團(tuán)dAOT:

第1項(xiàng)為水核直徑，第二項(xiàng)(2*1.2nm)為二倍AOT分子長度.一般反膠團(tuán)的W0不超過40.因此,依據(jù)上式,利用ATO形成的水核直徑一般不超過12nm,大致可容納一個(gè)直徑為5-10nm的pro分子.當(dāng)pro分子比與反膠團(tuán)直徑相比大得多時(shí)(如,當(dāng)M>100-200kD),難于溶解到反膠團(tuán)中.AOT反膠團(tuán)直徑dAOT:常用于制備反膠束的S是二-(2-693 反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用： 反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。3 反膠束的溶解作用