基因診斷課件

第16章基因診斷王慧蓮第16章基因診斷概述幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾病發(fā)生的結(jié)果，或是疾病發(fā)生時(shí)的伴隨現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和預(yù)后基因診斷：是以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。概述幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段第一階段：２０世紀(jì)８０年代，以DNA分子雜交為基礎(chǔ)，通過限制性片段長度多態(tài)性性（RFLP)分析進(jìn)行．第二階段：應(yīng)用PCR技術(shù)．第三階段：應(yīng)用基因芯片技術(shù)．基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段第一階段：２０世紀(jì)８０年代，以第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù)一.基因診斷中常用的幾種技術(shù)（一）核酸雜交（二）PCR（三）DNA序列測定（四）DNA芯片技術(shù)第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù)一.基因診斷中常用的幾種技術(shù)(一)核酸分子雜交技術(shù)(1)方法:以已知順序核酸片段作為探針,經(jīng)放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后,再與未知的目的核酸片段進(jìn)行雜交反應(yīng),分離已雜交和未雜交的標(biāo)記核酸鏈,通過標(biāo)記信號(hào)的檢測就可以對(duì)未知的目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析.(2)幾種不同形式的核酸分子雜交

a.Southern印跡(southernblot)雜交:

用于DNA的檢測，可用于基因的限制性內(nèi)切酶譜分析，基因突變分析等．b.Northern印跡(Northernblot)雜交:

用于RNA的檢測，能對(duì)組織細(xì)胞中的總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析．c.斑點(diǎn)雜交（dotblot):

既可以檢測DNA也可以檢測RNA,用于特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析．方法簡單、靈敏；但特異性低．

(一)核酸分子雜交技術(shù)(1)方法:原位雜交（insituhybridization):

是細(xì)胞學(xué)技術(shù)與核酸雜交技術(shù)結(jié)合的一種核酸分析檢測技術(shù)．可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交,用于檢測染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷．

分類:①玻片原位雜交:如中期的染色體和組織切片.②膜上原位雜交:將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜(如硝酸纖維膜)

原位雜交（insituhybridization):原位雜交的鏡像圖原位雜交的鏡像圖(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探針斑點(diǎn)雜交：PCR-ASO

該方法是診斷已知點(diǎn)的突變：需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時(shí)，只需用PCR擴(kuò)增受檢者目的DNA片段，再分別與上述探針雜交．雜交的結(jié)果有如下幾種情況：

①PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交--不存在這種突變；②只與突變探針雜交--突變基因?yàn)榧兒献?；③與正常探針和突變探針都可雜交--突變基因?yàn)殡s合子；④與正常探針和突變探針都不能雜交--突變基因不屬于已發(fā)現(xiàn)的類型(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核（２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationploymorphism,SSCP)分析是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方

法．DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單

鏈指DNA,如果堿基組成和(或)排列順序不同,形成的

構(gòu)象就不同,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.這些分子在非變性PAGE中電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率.

SSCP特別適于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物。據(jù)認(rèn)為SSCP可以區(qū)分1bp的差異

PCR-SSCP分析不能確定基因變異的內(nèi)容，因此電泳后結(jié)果有差異后還需進(jìn)行測序分析，確定變異性質(zhì)

（２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrand是一種基于(3)限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）分析基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有的位點(diǎn)消失.用限制酶對(duì)不同個(gè)體基因組進(jìn)行消化時(shí)，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會(huì)產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在.(3)限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfra

限制性片段長度多態(tài)性

RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)樣品一樣品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP為遺傳標(biāo)記繪制了第一張人類遺傳圖譜限制性片段長度多態(tài)性樣品一樣品二1987年,H.Don(4)PCR+變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)雙鏈DNA在一定濃度變性劑(尿素,甲酰胺)作用下,會(huì)變性而解鏈,導(dǎo)致DNA分子電泳遷移率變化.當(dāng)在不同梯度濃度變性膠中電泳時(shí),

DNA泳動(dòng)到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性，DNA開始解鏈，從而不同的DNA片段會(huì)形成不同的遷移率條帶．優(yōu)點(diǎn)：可靠，檢出單堿基突變率可達(dá)９５％．缺點(diǎn)：富含高熔點(diǎn)GC區(qū)時(shí)，則難以檢測出突變．(4)PCR+變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)雙鏈DNA在一定（５）用甲基化特異性PCR（methylation-specificPCR)進(jìn)行分析在PCR擴(kuò)增前，先用化學(xué)試劑（NaHSO3)處理模板DNA,將所有未甲基化的胞嘧啶（C)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，在PCR擴(kuò)增時(shí)，U與引物中A配對(duì)；而CpG島上甲基化的C不受影響，在擴(kuò)增時(shí)仍與G配對(duì),基于這種差異可以進(jìn)行甲基化特異性PCR．設(shè)計(jì)一對(duì)甲基化特異性引物（引物中G結(jié)合模板中C);和非甲基化特異性引物（引物中A結(jié)合模板中U),通過PCR擴(kuò)增就可檢測出甲基化等位基因化學(xué)修飾的DNA序列和非甲基化等位基因序列．用于一些疾病和腫瘤的基因診斷．（５）用甲基化特異性PCR（methylation-spec(6)采用PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析

定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR):就是對(duì)靶核酸分子進(jìn)行定量分析的技術(shù).根據(jù)PCR擴(kuò)增指數(shù)增長期原理，理論上擴(kuò)增產(chǎn)物累積分子數(shù)N=No(1+E),其中E是指每次循環(huán)中參與復(fù)制的模板數(shù)與總模板數(shù)的比率.通過N值可求出No.但PCR擴(kuò)增時(shí)平臺(tái)期(15-25)的出現(xiàn)會(huì)影響測量的準(zhǔn)確度.定量PCR的策略和方法較多.n(6)采用PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析定量PCR(q

a.通過測定PCR產(chǎn)物量方法:對(duì)已知量的靶DNA進(jìn)行系列稀釋,比較待測樣品和已知系列稀釋樣品的PCR產(chǎn)量,還可對(duì)未知量的靶DNA進(jìn)行絕對(duì)定量.b.采用極限稀釋法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析:

方法:將待測DNA標(biāo)本進(jìn)行倍數(shù)稀釋,直至擴(kuò)增不到靶基因的稀釋度,用稀釋程度表示啟始靶基因分子數(shù)的相對(duì)量,是一種半定量方法.a.通過測定PCR產(chǎn)物量

c.采用非競爭性對(duì)照法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析方法:該方法是在一個(gè)試管內(nèi)同步擴(kuò)增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列,用內(nèi)標(biāo)序列控制DNA的用量、可擴(kuò)增性和管間擴(kuò)增效率的變化,通過比較兩段序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的熒光強(qiáng)度,對(duì)靶序列進(jìn)行定量分析d.采用競爭抑制法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析:

方法:參照標(biāo)準(zhǔn)不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,與待測序列具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn),能與待測序列競爭聚合酶,底物,引物分子.方法:將競爭模板作系列稀釋后加入恒量的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過分離和分析競爭模板和樣品DNA的PCR產(chǎn)量,對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量分析c.采用非競爭性對(duì)照法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析

e.熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)是一種目前國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的定量PCR技術(shù),是通過始點(diǎn)定量和熒光檢測系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測累計(jì)熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn),具有靈敏度高,特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).

FQ-PCR技術(shù)的兩種定量形式:

①絕對(duì)定量:一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量.如合成目的基因;將PCR產(chǎn)物直接梯度稀釋;或?qū)CR產(chǎn)物克隆到載體上,抽取質(zhì)粒,經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量.優(yōu)點(diǎn):穩(wěn)定,準(zhǔn)確.

②.相對(duì)定量:指在測定目的基因的同時(shí)測定一內(nèi)源性管家基因(如β-actin,rRNA等),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較,反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素.e.熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)(三）DNA序列測序1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序列測序法用放射性同位素標(biāo)記引物，用雙脫氧核苷酸隨機(jī)終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結(jié)果。自動(dòng)測序法

采用四色熒光標(biāo)記代替了放射性同位素標(biāo)記。

DNA測序測定是基因突變檢測的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)(三）DNA序列測序1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序（四）DNA芯片技術(shù)

DNA芯片（DNAchip)又稱為基因芯片，DNA微陣列（DNAmicroarray)該技術(shù)的基礎(chǔ)仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預(yù)先設(shè)計(jì)好的核酸探針（oligosorcDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。用熒光標(biāo)記待測樣品（DNA,cDNA,RNA)與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測雜交信號(hào)強(qiáng)度，再用特定的軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行綜合分析，就能獲得待測樣品的大量基因序列信息或表達(dá)信息?；蛐酒凑沼猛痉譃椋罕磉_(dá)芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測序芯片，毒理芯片等。該技術(shù)可用于新基因鑒定，突變檢測，表達(dá)監(jiān)控和遺傳制圖等。（四）DNA芯片技術(shù)DNA芯片（DNAchip)又稱為基第二節(jié)對(duì)不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略一.通過致病基因的檢測診斷疾病已經(jīng)基本清楚基因突變與疾病發(fā)生之間的分子機(jī)制，相關(guān)的基因已被克隆，測序，并被定位在染色體上。如：一些與疾病有關(guān)的內(nèi)源基因-癌基因，抑癌基因和血紅蛋白基因突變型。

診斷方法：根據(jù)突變的基因序列設(shè)計(jì)探針.第二節(jié)對(duì)不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略一.通過致病基二.通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測診斷疾病許多基因病，雖然它們的基因結(jié)構(gòu)還沒有闡明，但通過染色體分析已被定位在染色體的特定位置上，這些基因是通過檢測與特定染色體位點(diǎn)連鎖的遺傳標(biāo)記來發(fā)現(xiàn)的。

原理：同一染色體上位置十分靠近的相鄰基因或其它遺傳標(biāo)記，在遺傳過程中分離的幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖?？梢酝ㄟ^一個(gè)或幾個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的分析，了解另一個(gè)或幾個(gè)基因。二.通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測診斷疾病許多基因病，雖然它們?nèi)?通過與疾病相關(guān)的克隆建立疾病基因診斷指標(biāo)40-60年代:功能克隆,即基于明顯可見的或直接與生化功能相關(guān)的線索確定與疾病相關(guān)的基因:如苯丙酮尿癥與鐮刀型的貧血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色體-基因的反向遺傳學(xué)策略對(duì)沒有明顯的表型或生化功能異常的疾病.90-今

:表型克隆,不考慮基因在染色體上的位置信息,而是直接在疾病與正常樣本之間尋找分子水平上的差異.

三.通過與疾病相關(guān)的克隆建立疾病基因診斷指標(biāo)40-60年代:利用表型克隆診斷疾病表型克?。簩?duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆

一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血壓，冠心病，腫瘤，精神病，自體免疫性疾病等，由于疾病發(fā)生的原因復(fù)雜，不僅涉及多基因互作，還涉及基因與環(huán)境互作。不可能通過前面的方法來診斷，必須利用差異顯示等技術(shù)找出正常人和疾病患者之間的差異序列，鑒定與疾病相關(guān)的多個(gè)基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。

方法：根據(jù)克隆到的一組基因制作相應(yīng)的一組探針，用這組探針檢測一組與疾病相關(guān)的基因來診斷多基因病利用表型克隆診斷疾病表型克?。簩?duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆第三節(jié)遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略1.直接策略：采用基因突變的診斷方法，直接檢測致病基因。該策略的前提是基因已被克隆.

2.間接策略：即通過檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷.第三節(jié)遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記

限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)1985短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性(RFLP短串聯(lián)重復(fù)序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復(fù)，重復(fù)次數(shù)n=15-60，已知8000多個(gè)，主要形式為：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標(biāo)記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。短串聯(lián)重復(fù)序列STR廣泛存在于人基因組，占約5%，定義:主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與RFLP與STR不同,它是直接以序列的變異作為標(biāo)記,而不是以片段的長度差異作為標(biāo)記.人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3萬至3.5萬個(gè)基因。有300多萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，3-4個(gè)相鄰的標(biāo)記構(gòu)成的單倍型（haplotype）就可有8-16種。

1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）定義:主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DN

SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。②它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。③與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)(STR)相比，SNP是高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。④部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。⑤易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間.SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位一.血紅蛋白病的基因診斷

分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,前者是由于珠蛋白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a鏈和b鏈合成不平衡。（一）異常血紅蛋白病的基因診斷：

如鐮狀紅細(xì)胞貧血病:β鏈第六位氨基酸:GAA(谷)→GUA(頡)代替.

對(duì)該病的基因診斷應(yīng)采用:

1)PCR+限制酶切,即用PCR從患者基因組擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的珠蛋白基因片段,再選適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷

2)Southern印跡雜交分析一.血紅蛋白病的基因診斷分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,血紅蛋白病的基因診斷2（二）α地貧的基因診斷：1.定性分析：PCR法直接擴(kuò)增α1和α2

基因的3’端有差別，針對(duì)此可設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，如有缺失，則不能擴(kuò)增出產(chǎn)物2.定量分析:α地貧的共同特點(diǎn)是α珠蛋白mRNA的量減少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷血紅蛋白病的基因診斷2（二）α地貧的基因診斷：（三）β-地貧的基因診斷1.DN檢測與分析：

①PCR+ASO探針法為主要方法根據(jù)β-珠蛋白主要突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增可能發(fā)生突變的2個(gè)片段,再分別與相應(yīng)野生型探針和突變探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。

②PCR+RFLP連鎖分析法檢測與β-珠蛋白基因連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷,如β-珠蛋白5’端有一限制內(nèi)切酶HgiAI的多態(tài)性位點(diǎn),在中國人群的頻率為0.5

③DNA芯片技術(shù)2.RNA檢測與分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷（三）β-地貧的基因診斷二.杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,DMD)DMD：是性連鎖隱性遺傳病,是由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因突變(突變或缺失).其突出特點(diǎn)為橫紋肌進(jìn)行性萎縮，引起無力和攣縮。DMD相對(duì)更為常見。DMD患兒在5歲前發(fā)病，20歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病率在男性活嬰中約1/3500。二.杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculard杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析,找出與突變基因相連鎖的DNA多態(tài)性,并將其作為遺傳標(biāo)記追蹤多態(tài)性在家族成員中的傳遞.基因組DNA探針法:用突變高發(fā)區(qū)的常見序列作為探針,檢測抗肌萎縮蛋白基因的相應(yīng)變異.cDNA探針法:用較短的抗肌萎縮蛋白基因cDNA作為探針.比2方便、檢出率高.多重PCR法:對(duì)基因突變較集中的區(qū)域,設(shè)計(jì)多對(duì)引物,擴(kuò)增基因相應(yīng)的突變高發(fā)區(qū),檢測相應(yīng)的基因突變.杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析第四節(jié)用基因診斷技術(shù)檢測腫瘤腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素、發(fā)生過程呈多階段性、發(fā)生的分子機(jī)制十分復(fù)雜,因此對(duì)不同的腫瘤要采用不同的基因診斷策略.一.通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤:

染色體易位及基因融合是較普遍的現(xiàn)象.如:淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生.它是由于T細(xì)胞受體(TCR)基因和IgH基因重排,使原來相隔數(shù)百個(gè)堿基的IgH和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)靠近在一起.用PCR擴(kuò)增該區(qū)域片段,通過長度分析就能判斷是否發(fā)生了基因重排.

第四節(jié)用基因診斷技術(shù)檢測腫瘤腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、二.通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).大多人類腫瘤組織或細(xì)胞中都能檢測到癌基因和(或)抑癌基因的突變1.癌基因-ras與腫瘤:ras是腫瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變,高發(fā)區(qū)是第12、13和61位密碼子.如90%的胰腺癌,50%的結(jié)直腸癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密碼子突變.ras癌基因點(diǎn)突變檢測方法:

a.PCR-ASO法:檢測速度快，靈敏度高，檢測樣品量大等優(yōu)點(diǎn)；但點(diǎn)突變的檢出僅限于寡核苷酸探針的探測位點(diǎn)和突變類型。

b.PCR-SSCP法：根據(jù)PCR擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段在非變性凝膠電泳中遷移率，將突變基因檢測出來。該法檢測點(diǎn)突變更方便；缺點(diǎn)：不能檢測出突變的具體位點(diǎn)和具體類型。二.通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤癌基因的激活及抑癌通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤（續(xù)）

2.P53基因與腫瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子機(jī)制主要是基因突變，也有因?yàn)榛虮磉_(dá)異常而使p53失活，約50%以上的惡性腫瘤有p53基因突變。突變類型：130?290密碼子間常發(fā)生點(diǎn)突變，也有少量的插入或缺失突變。

基因檢測方法：①PCR-SSCP:可檢出有無突變

②

PCR-RFLP:通過內(nèi)切酶位點(diǎn)的消失或增加檢測p53的基因突變。通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤（續(xù)）2.P53基因與腫三.通過檢測腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，它們有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆轉(zhuǎn)錄病毒(retro-virus)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的致瘤作用已得到公認(rèn).還發(fā)現(xiàn)一些與人腫瘤發(fā)生有關(guān)的病毒如:

Burkitt

淋巴瘤人類乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌通過檢測這些病毒的基因就可以幫助診斷相應(yīng)的腫瘤.EB病毒三.通過檢測腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤四.通過檢測腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤腫瘤標(biāo)志物（tumormarker)是由腫瘤組織細(xì)胞產(chǎn)生的，與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，包括：腫瘤抗原，激素，酶和同工酶。僅存在腫瘤細(xì)胞中。

類型：基因標(biāo)志：是指基因本身突變和異常表達(dá)，能反映癌前啟動(dòng)階段的變化?；虮硇蜆?biāo)志：基因產(chǎn)物表達(dá)和調(diào)控異常，表現(xiàn)為所編碼的表達(dá)產(chǎn)物合成紊亂，產(chǎn)生胚胎性抗原，一般出現(xiàn)較晚。

基因診斷方法：①基因變異導(dǎo)致腫瘤標(biāo)記物的產(chǎn)生或含量改變，可選擇：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-測序，PCR-SSCP等技術(shù)。②導(dǎo)致腫瘤標(biāo)記物產(chǎn)生或含量改變分子機(jī)制不清楚，可用RT-PCR技術(shù)檢測腫瘤標(biāo)記物mRNA的存在或含量的改變。如：端?；钚悦富钚员挥脕碜鳛槟[瘤標(biāo)記物，在腫瘤細(xì)胞中該酶的活性增高。四.通過檢測腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤腫瘤標(biāo)志物（tu第五節(jié)感染性疾病的基因診斷每種病原體都有各自特異的遺傳物質(zhì),可以是DNA,也可以是RNA.每種病原生物都有各自種屬特異的基因.一.病毒感染性疾病的診斷

a.乙型肝炎病毒:

目前采用免疫法檢測血清中病毒抗原.HBV基因組包含4個(gè)開放閱讀框,S、C、P和X區(qū),C區(qū)變異性小,是基因診斷采用的目標(biāo)部位.在用PCR檢測時(shí)可擴(kuò)增HBV的特異核苷酸序列,通過PCR產(chǎn)物的直接電泳分析、或內(nèi)切酶譜分析、或點(diǎn)雜交、或Southern印跡等結(jié)果作出判斷.也可采用基因芯片技術(shù).

第五節(jié)感染性疾病的基因診斷每種病原體都有各自特異

b.傳染性非典型肺炎(SARS):

是由新型變異冠狀病毒(SARS-CoV)感染引起.SARS-CoV基因組為正鏈單股RNA,有11個(gè)開放閱讀框,基因組的特異保守序列為編碼RNA聚合酶的序列.基因診斷方法:

①

采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增保守序列

②

DNA芯片二.診斷細(xì)菌感染性的疾病用PCR技術(shù)通過對(duì)致病細(xì)菌所含質(zhì)粒的特異序列,設(shè)計(jì)引物,檢測引起的疾病的細(xì)菌類型.

b.傳染性非典型肺炎(SARS):第五節(jié)基因診斷存在的問題與發(fā)展前景一.基因診斷技術(shù)應(yīng)用存在的問題

1.理論問題目前找到的致病基因不多,由多基因及基因與環(huán)境互作所引發(fā)多種疾病的分子機(jī)制還不清楚

2.技術(shù)問題設(shè)備條件;操做人員;污染造成的假陽性.3.倫理問題二.發(fā)展前景第五節(jié)基因診斷存在的問題與發(fā)展前景一.基因診斷技術(shù)應(yīng)用存在結(jié)束語基因診斷利用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水平檢測基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài),從而對(duì)疾病作出診斷.基因診斷的基本技術(shù)是核酸分子雜交和PCR擴(kuò)增.前者是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù),后者則是應(yīng)用前景最為廣闊的診斷技術(shù).目前,基因診斷技術(shù)已廣泛地應(yīng)用到遺傳病、腫瘤和感染性疾病的診斷.隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因診斷技術(shù)將會(huì)更加廣泛.結(jié)束語基因診斷利用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水第16章基因診斷王慧蓮第16章基因診斷概述幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾病發(fā)生的結(jié)果，或是疾病發(fā)生時(shí)的伴隨現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和預(yù)后基因診斷：是以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。概述幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段第一階段：２０世紀(jì)８０年代，以DNA分子雜交為基礎(chǔ)，通過限制性片段長度多態(tài)性性（RFLP)分析進(jìn)行．第二階段：應(yīng)用PCR技術(shù)．第三階段：應(yīng)用基因芯片技術(shù)．基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段第一階段：２０世紀(jì)８０年代，以第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù)一.基因診斷中常用的幾種技術(shù)（一）核酸雜交（二）PCR（三）DNA序列測定（四）DNA芯片技術(shù)第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù)一.基因診斷中常用的幾種技術(shù)(一)核酸分子雜交技術(shù)(1)方法:以已知順序核酸片段作為探針,經(jīng)放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后,再與未知的目的核酸片段進(jìn)行雜交反應(yīng),分離已雜交和未雜交的標(biāo)記核酸鏈,通過標(biāo)記信號(hào)的檢測就可以對(duì)未知的目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析.(2)幾種不同形式的核酸分子雜交

a.Southern印跡(southernblot)雜交:

用于DNA的檢測，可用于基因的限制性內(nèi)切酶譜分析，基因突變分析等．b.Northern印跡(Northernblot)雜交:

用于RNA的檢測，能對(duì)組織細(xì)胞中的總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析．c.斑點(diǎn)雜交（dotblot):

既可以檢測DNA也可以檢測RNA,用于特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析．方法簡單、靈敏；但特異性低．

(一)核酸分子雜交技術(shù)(1)方法:原位雜交（insituhybridization):

是細(xì)胞學(xué)技術(shù)與核酸雜交技術(shù)結(jié)合的一種核酸分析檢測技術(shù)．可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交,用于檢測染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷．

分類:①玻片原位雜交:如中期的染色體和組織切片.②膜上原位雜交:將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜(如硝酸纖維膜)

原位雜交（insituhybridization):原位雜交的鏡像圖原位雜交的鏡像圖(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探針斑點(diǎn)雜交：PCR-ASO

該方法是診斷已知點(diǎn)的突變：需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時(shí)，只需用PCR擴(kuò)增受檢者目的DNA片段，再分別與上述探針雜交．雜交的結(jié)果有如下幾種情況：

①PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交--不存在這種突變；②只與突變探針雜交--突變基因?yàn)榧兒献?；③與正常探針和突變探針都可雜交--突變基因?yàn)殡s合子；④與正常探針和突變探針都不能雜交--突變基因不屬于已發(fā)現(xiàn)的類型(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核（２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationploymorphism,SSCP)分析是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方

法．DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單

鏈指DNA,如果堿基組成和(或)排列順序不同,形成的

構(gòu)象就不同,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.這些分子在非變性PAGE中電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率.

SSCP特別適于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物。據(jù)認(rèn)為SSCP可以區(qū)分1bp的差異

PCR-SSCP分析不能確定基因變異的內(nèi)容，因此電泳后結(jié)果有差異后還需進(jìn)行測序分析，確定變異性質(zhì)

（２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrand是一種基于(3)限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）分析基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有的位點(diǎn)消失.用限制酶對(duì)不同個(gè)體基因組進(jìn)行消化時(shí)，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會(huì)產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在.(3)限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfra

限制性片段長度多態(tài)性

RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)樣品一樣品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP為遺傳標(biāo)記繪制了第一張人類遺傳圖譜限制性片段長度多態(tài)性樣品一樣品二1987年,H.Don(4)PCR+變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)雙鏈DNA在一定濃度變性劑(尿素,甲酰胺)作用下,會(huì)變性而解鏈,導(dǎo)致DNA分子電泳遷移率變化.當(dāng)在不同梯度濃度變性膠中電泳時(shí),

DNA泳動(dòng)到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性，DNA開始解鏈，從而不同的DNA片段會(huì)形成不同的遷移率條帶．優(yōu)點(diǎn)：可靠，檢出單堿基突變率可達(dá)９５％．缺點(diǎn)：富含高熔點(diǎn)GC區(qū)時(shí)，則難以檢測出突變．(4)PCR+變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)雙鏈DNA在一定（５）用甲基化特異性PCR（methylation-specificPCR)進(jìn)行分析在PCR擴(kuò)增前，先用化學(xué)試劑（NaHSO3)處理模板DNA,將所有未甲基化的胞嘧啶（C)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，在PCR擴(kuò)增時(shí)，U與引物中A配對(duì)；而CpG島上甲基化的C不受影響，在擴(kuò)增時(shí)仍與G配對(duì),基于這種差異可以進(jìn)行甲基化特異性PCR．設(shè)計(jì)一對(duì)甲基化特異性引物（引物中G結(jié)合模板中C);和非甲基化特異性引物（引物中A結(jié)合模板中U),通過PCR擴(kuò)增就可檢測出甲基化等位基因化學(xué)修飾的DNA序列和非甲基化等位基因序列．用于一些疾病和腫瘤的基因診斷．（５）用甲基化特異性PCR（methylation-spec(6)采用PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析

定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR):就是對(duì)靶核酸分子進(jìn)行定量分析的技術(shù).根據(jù)PCR擴(kuò)增指數(shù)增長期原理，理論上擴(kuò)增產(chǎn)物累積分子數(shù)N=No(1+E),其中E是指每次循環(huán)中參與復(fù)制的模板數(shù)與總模板數(shù)的比率.通過N值可求出No.但PCR擴(kuò)增時(shí)平臺(tái)期(15-25)的出現(xiàn)會(huì)影響測量的準(zhǔn)確度.定量PCR的策略和方法較多.n(6)采用PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析定量PCR(q

a.通過測定PCR產(chǎn)物量方法:對(duì)已知量的靶DNA進(jìn)行系列稀釋,比較待測樣品和已知系列稀釋樣品的PCR產(chǎn)量,還可對(duì)未知量的靶DNA進(jìn)行絕對(duì)定量.b.采用極限稀釋法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析:

方法:將待測DNA標(biāo)本進(jìn)行倍數(shù)稀釋,直至擴(kuò)增不到靶基因的稀釋度,用稀釋程度表示啟始靶基因分子數(shù)的相對(duì)量,是一種半定量方法.a.通過測定PCR產(chǎn)物量

c.采用非競爭性對(duì)照法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析方法:該方法是在一個(gè)試管內(nèi)同步擴(kuò)增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列,用內(nèi)標(biāo)序列控制DNA的用量、可擴(kuò)增性和管間擴(kuò)增效率的變化,通過比較兩段序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的熒光強(qiáng)度,對(duì)靶序列進(jìn)行定量分析d.采用競爭抑制法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析:

方法:參照標(biāo)準(zhǔn)不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,與待測序列具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn),能與待測序列競爭聚合酶,底物,引物分子.方法:將競爭模板作系列稀釋后加入恒量的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過分離和分析競爭模板和樣品DNA的PCR產(chǎn)量,對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量分析c.采用非競爭性對(duì)照法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析

e.熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)是一種目前國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的定量PCR技術(shù),是通過始點(diǎn)定量和熒光檢測系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測累計(jì)熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn),具有靈敏度高,特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).

FQ-PCR技術(shù)的兩種定量形式:

①絕對(duì)定量:一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量.如合成目的基因;將PCR產(chǎn)物直接梯度稀釋;或?qū)CR產(chǎn)物克隆到載體上,抽取質(zhì)粒,經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量.優(yōu)點(diǎn):穩(wěn)定,準(zhǔn)確.

②.相對(duì)定量:指在測定目的基因的同時(shí)測定一內(nèi)源性管家基因(如β-actin,rRNA等),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較,反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素.e.熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)(三）DNA序列測序1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序列測序法用放射性同位素標(biāo)記引物，用雙脫氧核苷酸隨機(jī)終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結(jié)果。自動(dòng)測序法

采用四色熒光標(biāo)記代替了放射性同位素標(biāo)記。

DNA測序測定是基因突變檢測的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)(三）DNA序列測序1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序（四）DNA芯片技術(shù)

DNA芯片（DNAchip)又稱為基因芯片，DNA微陣列（DNAmicroarray)該技術(shù)的基礎(chǔ)仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預(yù)先設(shè)計(jì)好的核酸探針（oligosorcDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。用熒光標(biāo)記待測樣品（DNA,cDNA,RNA)與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測雜交信號(hào)強(qiáng)度，再用特定的軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行綜合分析，就能獲得待測樣品的大量基因序列信息或表達(dá)信息。基因芯片按照用途分為：表達(dá)芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測序芯片，毒理芯片等。該技術(shù)可用于新基因鑒定，突變檢測，表達(dá)監(jiān)控和遺傳制圖等。（四）DNA芯片技術(shù)DNA芯片（DNAchip)又稱為基第二節(jié)對(duì)不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略一.通過致病基因的檢測診斷疾病已經(jīng)基本清楚基因突變與疾病發(fā)生之間的分子機(jī)制，相關(guān)的基因已被克隆，測序，并被定位在染色體上。如：一些與疾病有關(guān)的內(nèi)源基因-癌基因，抑癌基因和血紅蛋白基因突變型。

診斷方法：根據(jù)突變的基因序列設(shè)計(jì)探針.第二節(jié)對(duì)不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略一.通過致病基二.通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測診斷疾病許多基因病，雖然它們的基因結(jié)構(gòu)還沒有闡明，但通過染色體分析已被定位在染色體的特定位置上，這些基因是通過檢測與特定染色體位點(diǎn)連鎖的遺傳標(biāo)記來發(fā)現(xiàn)的。

原理：同一染色體上位置十分靠近的相鄰基因或其它遺傳標(biāo)記，在遺傳過程中分離的幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖?？梢酝ㄟ^一個(gè)或幾個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的分析，了解另一個(gè)或幾個(gè)基因。二.通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測診斷疾病許多基因病，雖然它們?nèi)?通過與疾病相關(guān)的克隆建立疾病基因診斷指標(biāo)40-60年代:功能克隆,即基于明顯可見的或直接與生化功能相關(guān)的線索確定與疾病相關(guān)的基因:如苯丙酮尿癥與鐮刀型的貧血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色體-基因的反向遺傳學(xué)策略對(duì)沒有明顯的表型或生化功能異常的疾病.90-今

:表型克隆,不考慮基因在染色體上的位置信息,而是直接在疾病與正常樣本之間尋找分子水平上的差異.

三.通過與疾病相關(guān)的克隆建立疾病基因診斷指標(biāo)40-60年代:利用表型克隆診斷疾病表型克?。簩?duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆

一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血壓，冠心病，腫瘤，精神病，自體免疫性疾病等，由于疾病發(fā)生的原因復(fù)雜，不僅涉及多基因互作，還涉及基因與環(huán)境互作。不可能通過前面的方法來診斷，必須利用差異顯示等技術(shù)找出正常人和疾病患者之間的差異序列，鑒定與疾病相關(guān)的多個(gè)基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。

方法：根據(jù)克隆到的一組基因制作相應(yīng)的一組探針，用這組探針檢測一組與疾病相關(guān)的基因來診斷多基因病利用表型克隆診斷疾病表型克?。簩?duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆第三節(jié)遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略1.直接策略：采用基因突變的診斷方法，直接檢測致病基因。該策略的前提是基因已被克隆.

2.間接策略：即通過檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷.第三節(jié)遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記

限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)1985短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性(RFLP短串聯(lián)重復(fù)序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復(fù)，重復(fù)次數(shù)n=15-60，已知8000多個(gè)，主要形式為：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標(biāo)記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。短串聯(lián)重復(fù)序列STR廣泛存在于人基因組，占約5%，定義:主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與RFLP與STR不同,它是直接以序列的變異作為標(biāo)記,而不是以片段的長度差異作為標(biāo)記.人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3萬至3.5萬個(gè)基因。有300多萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，3-4個(gè)相鄰的標(biāo)記構(gòu)成的單倍型（haplotype）就可有8-16種。

1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）定義:主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DN

SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。②它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。③與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)(STR)相比，SNP是高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。④部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。⑤易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間.SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位一.血紅蛋白病的基因診斷

分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,前者是由于珠蛋白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a鏈和b鏈合成不平衡。（一）異常血紅蛋白病的基因診斷：

如鐮狀紅細(xì)胞貧血病:β鏈第六位氨基酸:GAA(谷)→GUA(頡)代替.

對(duì)該病的基因診斷應(yīng)采用:

1)PCR+限制酶切,即用PCR從患者基因組擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的珠蛋白基因片段,再選適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷

2)Southern印跡雜交分析一.血紅蛋白病的基因診斷分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,血紅蛋白病的基因診斷2（二）α地貧的基因診斷：1.定性分析：PCR法直接擴(kuò)增α1和α2

基因的3’端有差別，針對(duì)此可設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，如有缺失，則不能擴(kuò)增出產(chǎn)物2.定量分析:α地貧的共同特點(diǎn)是α珠蛋白mRNA的量減少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷血紅蛋白病的基因診斷2（二）α地貧的基因診斷：（三）β-地貧的基因診斷1.DN檢測與分析：

①PCR+ASO探針法為主要方法根據(jù)β-珠蛋白主要突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增可能發(fā)生突變的2個(gè)片段,再分別與相應(yīng)野生型探針和突變探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。

②PCR+RFLP連鎖分析法檢測與β-珠蛋白基因連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷,如β-珠蛋白5’端有一限制內(nèi)切酶HgiAI的多態(tài)性位點(diǎn),在中國人群的頻率為0.5

③DNA芯片技術(shù)2.RNA檢測與分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷（三）β-地貧的基因診斷二.杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,DMD)DMD：是性連鎖隱性遺傳病,是由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因突變(突變或缺失).其突出特點(diǎn)為橫紋肌進(jìn)行性萎縮，引起無力和攣縮。DMD相對(duì)更為常見。DMD患兒在5歲前發(fā)病，20歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病率在男性活嬰中約1/3500。二.杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculard杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析,找出與突變基因相連鎖的DNA多態(tài)性,并將其作為遺傳標(biāo)記追蹤多態(tài)性在家族成員中的傳遞.基因組DNA探針法:用突變高發(fā)區(qū)的常見序列作為探針,檢測抗肌萎縮蛋白基因的相應(yīng)變異.cDNA探針法:用較短的抗肌萎縮蛋白基因cDNA作為探針.比2方便、檢出率高.多重PCR法:對(duì)基因突變較集中的區(qū)域,設(shè)計(jì)多對(duì)引物,擴(kuò)增基因相應(yīng)的突變高發(fā)區(qū),檢測相應(yīng)的基因突變.杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析第四節(jié)用基因診斷技術(shù)檢測腫瘤腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素、發(fā)生過程呈多階段性、發(fā)生的分子機(jī)制十分復(fù)雜,因此對(duì)不同的腫瘤要采用不同的基因診斷策略.一.通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤:

染色體易位及基因融合是較普遍的現(xiàn)象.如:淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生.它是由于T細(xì)胞受體(TCR)基因和IgH基因重排,使原來相隔數(shù)百個(gè)堿基的IgH和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)靠近在一起.用PCR擴(kuò)增該區(qū)域片段,通過長度分析就能判斷是否發(fā)生了基因重排.

第四節(jié)用基因診斷技術(shù)檢測腫瘤腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、二.通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).大多人類腫瘤組織或細(xì)胞中都能檢測到癌基因和(或)抑癌基因的突變1.癌基因-ras與腫瘤:ras是腫瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變,高發(fā)區(qū)是第12、13和61位密碼子.如90%的胰腺癌,50%的結(jié)直腸癌和1/3的肺腺癌都在是