分析化學(xué)高效液相色譜法

關(guān)于分析化學(xué)高效液相色譜法第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高壓輸送流動相，高效固定相及高靈敏度檢測器，現(xiàn)代液相色譜分析方法。第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達(dá)109g，而熒光檢測器最小檢測限可達(dá)1012g。第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型

四類基本類型色譜法分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型四類基本類型色譜法分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日其他色譜類型親合色譜法（affinitychromatography；AC）手性色譜法（chiralchromatography；CC）膠束色譜法（micellarchromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、化學(xué)鍵合相色譜法

以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動相極性的相對強(qiáng)弱第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（一）正相鍵合相色譜法

固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì)第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日正相鍵合相色譜法分離機(jī)制？分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用分離選擇性：

極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。

流動相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑常用甲醇－水、乙腈－水等應(yīng)用：最廣非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等）第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日保留機(jī)制疏溶劑（solvophobictheory）溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）

極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。

第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日2、固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。

反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素3、流動相

極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大

溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大pH：影響弱酸、弱減的離解 流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatography；ISC）用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱堿反相鍵合相色譜法第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counterion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。（三）反相離子對色譜法

pairedion

chromatography；PIC

ionpairchromatography；IPC第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日反相離子對色譜法離子對模型33++()+3s3(+固定相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相通式第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時(shí)（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。

第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日適用范圍和離子對試劑的選擇適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等。分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）。第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)高效液相色譜法的固定

相和流動相及其選擇第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日固定相應(yīng)符合下列要求：顆粒細(xì)且均勻；傳質(zhì)快；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類非極性鍵合相：非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日鍵合相的種類弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜極性鍵合相：常用氨基﹑氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)鍵合硅膠一般用于正相色譜特殊用途的鍵合相第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)

鍵合反應(yīng)

硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)

如：YWG－C18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅膠Spherisorb上鍵合了ODS。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)鍵合相的性質(zhì)含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù)覆蓋度：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例封尾（end-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基。

第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日鍵合相的特點(diǎn)使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大注意：流動相的pH一般應(yīng)在3-8，否則會引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動相

對流動相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。對試樣有適宜的溶解度。使k在1~10范圍內(nèi)，與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時(shí)，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（一）流動相對分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定，α主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）流動相的強(qiáng)度和選擇性溶劑的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)溶劑的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同混合溶劑（二元或多元流動相）第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、分離條件的選擇

（一）HPLC中的速率理論渦流擴(kuò)散A=2λdp

球形、小粒度、均勻（RSD＜5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A?？v向擴(kuò)散β=2γDm可以忽略。因?yàn)镈l很小，室溫操作，且U大于U最佳，第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日HPLC中的速率理論傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略，因df極小流動相傳質(zhì)阻抗Cm

要求：dp小，Dm大第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗 ：由于部分流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η

要求:固定相dp2、流動相η都小HPLC中的速率理論第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日

H=A+Cmu+Csmu

原因：化學(xué)鍵合相，液體流動相結(jié)果：HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：①小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；②低粘度流動相，流速不宜過快；③柱溫適當(dāng)。HPLC中的速率理論第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）正相鍵合相色譜法的分離條件

固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等流動相烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）反相鍵合相色譜法的分離條件固定相非極性鍵合相如ODS流動相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑加入0.1%~1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日（四）反相離子對色譜法的分離條件

固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相，離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反流動相pH使試樣組分與離子對試劑全部離子化有機(jī)溶劑及其濃度同一般HPLC

第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)

第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動。有串聯(lián)式和并聯(lián)式第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日輸液系統(tǒng)輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日輸液系統(tǒng)輸液泵操作注意事項(xiàng)：防止固體微粒進(jìn)入泵體流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完不超過規(guī)定的最高壓力流動相一般應(yīng)該先脫氣第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥）、自動進(jìn)樣裝置色譜柱（column）由柱管和固定相組成分析柱、制備柱性能評價(jià)H、n、fs、k和α的重復(fù)性，或R。

第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、檢測系統(tǒng)（一）檢測器(detector)的主要性能要求：

靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）

第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）紫外檢測器(ultravioletdetector)

檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點(diǎn)：靈敏度較高（10-6～10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日紫外檢測器固定波長檢測器：254nm可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200～400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似光電二極管陣列檢測器(photodiodearraydetector；PDAD)：一系列光電二極管，一個(gè)二極管對應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日紫外檢測器光電二極管陣列檢測器工作原理：復(fù)光通過流通池，再進(jìn)入單色