LAMP技術及應用課件

17十二月2022LAMP技術及應用湖北省疾控中心結防所周麗平16十二月2022LAMP技術及應用湖北省疾控中心結防所1LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增法(loopmediatedisothermalamplification,LAMP),是一種在恒定溫度下實現(xiàn)核酸的指數級擴增的技術已經被用來快速檢測動物病原(病毒、細菌、寄生蟲)LAMP技術因其特異、敏感、簡便、快捷、檢測方式對實驗室基礎設施、設備的要求較少，逐步用于結核分枝桿菌診斷鑒別中世界衛(wèi)生組織于2016年8月11日，在日內瓦發(fā)布了一份最新的推薦書，推薦發(fā)展中國家的基礎醫(yī)療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測方法的替代方案LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增法(loopmediated2縣區(qū)級檢測結核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增多色巢氏熒光PCR法交叉引物發(fā)RNA等溫擴增法等省、自治區(qū)檢測結核分枝桿菌檢測是否對利福平和異煙肼耐藥地市級結核分枝桿菌及是否對利福平和異煙肼耐藥基因芯片溶解曲線線性探針“十三五”規(guī)劃要求逐步推廣的新診斷技術縣區(qū)級檢測結核分枝桿菌省、自治區(qū)檢測結核分枝桿菌地市級結核分3LAMP技術的原理

對靶基因的6個特異部位設定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地擴增。LAMP技術的原理4LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase擴增對象為雙鏈DNA時，其中一條鏈解離的同時進行鏈延長。LAMP法使用最適溫度65℃的聚合酶。17十二月2022LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶:BstDNAP5LAMP法的引物設計17十二月2022LAMP法的引物設計16十二月20226LAMP法的原理17十二月2022LAMP法的原理16十二月20227LAMP法的原理17十二月2022LAMP法的原理16十二月20228LAMP技術特點靈敏度高LAMP一般能檢測到比PCR低10倍的拷貝數，擴增模板可低至每測試10拷貝或更少。特異性強通過4對引物與靶序列上的6個特異部位準確結合來產生擴增效應,因此能獲得比PCR更高的特異性。速度快恒溫擴增反應,沒有PCR反應中溫度變化的耗時,省卻溫度循環(huán)，在30min～60min內即可完成反應過程。設備簡單只需一個簡單的恒溫器,不需要昂貴的PCR儀。產物檢測便捷在合成DNA的同時產生的大量焦磷酸根離子,與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而能定性判斷LAMP反應；可與熒光物質結合。LAMP技術特點靈敏度高LAMP一般能檢測到比PCR低10倍9LAMP法和其他PCR法的比較17十二月2022LAMP法和其他PCR法的比較16十二月202210LAMP法和其他PCR法的比較17十二月2022LAMP法和其他PCR法的比較16十二月202211LAMP法所需的試劑17十二月2022LAMP法所需的試劑16十二月20221217十二月2022LAMP技術簡介

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段的技術。該技術可以在等溫條件下（約65℃）進行核酸擴增反應，克服了傳統(tǒng)PCR反應需要通過反復的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，從而實現(xiàn)在恒溫條件下進行連續(xù)快速的核酸擴增，并且可以通過簡易直觀的目測判讀結果，相比傳統(tǒng)PCR大大節(jié)省了時間和實驗操作步驟。16十二月2022LAMP技術簡介環(huán)介導等溫擴增13LAMP法常規(guī)操作步驟17十二月2022LAMP法常規(guī)操作步驟16十二月202214LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法由LAMP原理可知，LAMP反應的最終擴增產物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結構和類似花椰菜的結構。因此，LAMP擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法在LAMP反應過程中，可以通過產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀的產生來肉眼直接判斷擴增反應是否進行。（圖B）通過熒光染料檢測有時，通過肉眼觀察白色沉淀來檢測會存在一定的誤差，所以也可通過添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBRGreenI等進行染色，來檢測擴增是否發(fā)生。（圖C）17十二月2022LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法16十二月20221517十二月202216十二月202216LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022靶標限定:結核分枝桿菌復合群gyrB基因作為結核分枝桿菌重要的功能基因，在復合群進化過程中非常保守，LAMP法檢測即以gyrB基因作為靶標。臨床上感染人類的是結核分枝桿菌復合群，包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對檢測對象的準確限定能避免假陽性過高而增加治療成本，長遠來說，更有利于避免耐藥性的產生。LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022靶標限定17LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022適宜的檢測對象

以臨床上引起結核感染的結核分枝桿菌復合群為檢測對象，可避免假陽性過高。反應管預裝反應體系

擴增及檢測在全封閉反應管中進行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡便、減少操作誤差。結果易讀

產物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結果。技術特點：LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022適宜的檢18LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結果靈敏度＝89.54%陽性結果預期值＝98.13%特異性＝98.93%陰性結果預期值＝93.77%總符合率＝95.31%LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022臨床試驗19LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（TB-qPCR）對比結果陽性一致率=88.56%陰性一致率=93.06%總符合率=91.36%LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022臨床試驗20WHO認為LAMP法的檢測結果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結核癥狀的檢測者中進行對比，TB-LAMP法比痰涂片檢測法多檢出15%的患者。對比WHO近年推薦的其它快速檢測法，如果把TB-LAMP法用于對痰涂片檢測陰性患者的復查，TB-LAMP法檢出率要高40%。17十二月2022WHO認為LAMP法的檢測結果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結核2117十二月2022LAMP法在結核菌檢測中的應用現(xiàn)有結核診斷方法和環(huán)介導恒溫擴增法比較16十二月2022LAMP法在結核菌檢測中的應用現(xiàn)有結核22痰標本目測法檢測流程100分鐘

痰標本目測法檢測流程100分鐘23一、樣品處理

1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入無菌1.5mL離心管中一、樣品處理1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液24一、樣品處理

2、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清一、樣品處理2、13000r/min離心10min，盡量吸25一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌26一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清5、重復步驟3、4一次一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄27一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100μLDNA提取液，混勻后沸水浴10min一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100μLDNA28一、樣品處理7、冷卻至室溫后，13000r/min離心﹥5min，上清即為核酸模板一、樣品處理7、冷卻至室溫后，13000r/min離心﹥29二、核酸擴增1、向反應管內按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL，注意加樣時槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至反應管大腔內，蓋緊管蓋并做好標記，移至反應區(qū)二、核酸擴增1、向反應管內按順序分別加入陰性對照、待檢模板和30二、核酸擴增2、置65℃恒溫反應60min二、核酸擴增2、置65℃恒溫反應60min31三、結果判斷1、反應結束，將反應管倒置甩動2次，再正置甩動2次，使工作液與顯色液充分混合三、結果判斷1、反應結束，將反應管倒置甩動2次，再正置甩動232三、結果判斷2、在陰性對照反應管液體顏色為無色（或橙色），陽性對照反應管液體顏色呈綠色的條件下：若待檢樣本反應管中液體顏色呈綠色，則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陽性；若待檢樣本反應管中液體顏色為無色（或橙色），則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陰性；若陰陽性對照反應管結果與上述情況不符，則本次檢測結果無效，應重新檢測。三、結果判斷2、在陰性對照反應管液體顏色為無色（或橙色），陽33（1）LAMP結果為陽性，涂片結果也為陽性?？勺龀龌颊咭伤苹加薪Y核病的診斷，并開始抗結核治療，同時等待培養(yǎng)結果。（2）LAMP結果陽性，而涂片結果為陰性。根據臨床癥狀判斷是否開始抗結核治療，同時等待培養(yǎng)結果。這時可考慮增加一個或一個以上的標本進行LAMP檢測以確認。如果增加的標本檢測結果也為陽性，則患者可被初步診斷為患有結核病，并等待培養(yǎng)的結果。（3）LAMP結果為陰性，涂片結果為陽性。應考慮LAMP結果是否受痰標本中的抑制物影響，并增加一個或一個以上的標本檢測。若增加的標本檢測結果仍不變，且排除抑制物因素，則患者可初步考慮為非結核分枝桿菌感染，進行進一步確診實驗。（4）LAMP結果為陰性，涂片結果亦為陰性。根據臨床癥狀判斷是否開始抗結核治療，并等待培養(yǎng)結果。（5）隨訪患者LAMP結果陽性，不能作為隨訪患者的療效評價。LAMP檢測結果的臨床應用（1）LAMP結果為陽性，涂片結果也為陽性。可做出患者疑似患3417十二月2022一點建議?根據試劑盒不同、實驗室嚴格分區(qū)

–溶液配制區(qū)、樣品處理區(qū)、檢測區(qū)?基本操作

–混勻、吸取

–模板最后加入，按照先陰性、后陽性，從低到高梯度，最后陽性對照?環(huán)境污染

–UV照射

–DNAZAP等DNA降解試劑16十二月2022一點建議?根據試劑盒不同、實驗室嚴格分35謝謝!17十二月202216十二月20223617十二月2022LAMP技術及應用湖北省疾控中心結防所周麗平16十二月2022LAMP技術及應用湖北省疾控中心結防所37LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增法(loopmediatedisothermalamplification,LAMP),是一種在恒定溫度下實現(xiàn)核酸的指數級擴增的技術已經被用來快速檢測動物病原(病毒、細菌、寄生蟲)LAMP技術因其特異、敏感、簡便、快捷、檢測方式對實驗室基礎設施、設備的要求較少，逐步用于結核分枝桿菌診斷鑒別中世界衛(wèi)生組織于2016年8月11日，在日內瓦發(fā)布了一份最新的推薦書，推薦發(fā)展中國家的基礎醫(yī)療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測方法的替代方案LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增法(loopmediated38縣區(qū)級檢測結核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增多色巢氏熒光PCR法交叉引物發(fā)RNA等溫擴增法等省、自治區(qū)檢測結核分枝桿菌檢測是否對利福平和異煙肼耐藥地市級結核分枝桿菌及是否對利福平和異煙肼耐藥基因芯片溶解曲線線性探針“十三五”規(guī)劃要求逐步推廣的新診斷技術縣區(qū)級檢測結核分枝桿菌省、自治區(qū)檢測結核分枝桿菌地市級結核分39LAMP技術的原理

對靶基因的6個特異部位設定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地擴增。LAMP技術的原理40LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase擴增對象為雙鏈DNA時，其中一條鏈解離的同時進行鏈延長。LAMP法使用最適溫度65℃的聚合酶。17十二月2022LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶:BstDNAP41LAMP法的引物設計17十二月2022LAMP法的引物設計16十二月202242LAMP法的原理17十二月2022LAMP法的原理16十二月202243LAMP法的原理17十二月2022LAMP法的原理16十二月202244LAMP技術特點靈敏度高LAMP一般能檢測到比PCR低10倍的拷貝數，擴增模板可低至每測試10拷貝或更少。特異性強通過4對引物與靶序列上的6個特異部位準確結合來產生擴增效應,因此能獲得比PCR更高的特異性。速度快恒溫擴增反應,沒有PCR反應中溫度變化的耗時,省卻溫度循環(huán)，在30min～60min內即可完成反應過程。設備簡單只需一個簡單的恒溫器,不需要昂貴的PCR儀。產物檢測便捷在合成DNA的同時產生的大量焦磷酸根離子,與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而能定性判斷LAMP反應；可與熒光物質結合。LAMP技術特點靈敏度高LAMP一般能檢測到比PCR低10倍45LAMP法和其他PCR法的比較17十二月2022LAMP法和其他PCR法的比較16十二月202246LAMP法和其他PCR法的比較17十二月2022LAMP法和其他PCR法的比較16十二月202247LAMP法所需的試劑17十二月2022LAMP法所需的試劑16十二月20224817十二月2022LAMP技術簡介

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段的技術。該技術可以在等溫條件下（約65℃）進行核酸擴增反應，克服了傳統(tǒng)PCR反應需要通過反復的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，從而實現(xiàn)在恒溫條件下進行連續(xù)快速的核酸擴增，并且可以通過簡易直觀的目測判讀結果，相比傳統(tǒng)PCR大大節(jié)省了時間和實驗操作步驟。16十二月2022LAMP技術簡介環(huán)介導等溫擴增49LAMP法常規(guī)操作步驟17十二月2022LAMP法常規(guī)操作步驟16十二月202250LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法由LAMP原理可知，LAMP反應的最終擴增產物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結構和類似花椰菜的結構。因此，LAMP擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法在LAMP反應過程中，可以通過產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀的產生來肉眼直接判斷擴增反應是否進行。（圖B）通過熒光染料檢測有時，通過肉眼觀察白色沉淀來檢測會存在一定的誤差，所以也可通過添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBRGreenI等進行染色，來檢測擴增是否發(fā)生。（圖C）17十二月2022LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法16十二月20225117十二月202216十二月202252LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022靶標限定:結核分枝桿菌復合群gyrB基因作為結核分枝桿菌重要的功能基因，在復合群進化過程中非常保守，LAMP法檢測即以gyrB基因作為靶標。臨床上感染人類的是結核分枝桿菌復合群，包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對檢測對象的準確限定能避免假陽性過高而增加治療成本，長遠來說，更有利于避免耐藥性的產生。LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022靶標限定53LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022適宜的檢測對象

以臨床上引起結核感染的結核分枝桿菌復合群為檢測對象，可避免假陽性過高。反應管預裝反應體系

擴增及檢測在全封閉反應管中進行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡便、減少操作誤差。結果易讀

產物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結果。技術特點：LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022適宜的檢54LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結果靈敏度＝89.54%陽性結果預期值＝98.13%特異性＝98.93%陰性結果預期值＝93.77%總符合率＝95.31%LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022臨床試驗55LAMP法在結核菌檢測中的應用17十二月2022臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（TB-qPCR）對比結果陽性一致率=88.56%陰性一致率=93.06%總符合率=91.36%LAMP法在結核菌檢測中的應用16十二月2022臨床試驗56WHO認為LAMP法的檢測結果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結核癥狀的檢測者中進行對比，TB-LAMP法比痰涂片檢測法多檢出15%的患者。對比WHO近年推薦的其它快速檢測法，如果把TB-LAMP法用于對痰涂片檢測陰性患者的復查，TB-LAMP法檢出率要高40%。17十二月2022WHO認為LAMP法的檢測結果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結核5717十二月2022LAMP法在結核菌檢測中的應用現(xiàn)有結核診斷方法和環(huán)介導恒溫擴增法比較16十二月2022LAMP法在結核菌檢測中的應用現(xiàn)有結核58痰標本目測法檢測流程100分鐘

痰標本目測法檢測流程100分鐘59一、樣品處理

1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入無菌1.5mL離心管中一、樣品處理1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液60一、樣品處理

2、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清一、樣品處理2、13000r/min離心10min，盡量吸61一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌62一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清5、重復步驟3、4一次一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄63一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100μLDNA提取液，混勻后沸水浴10min一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100μLDNA64一、樣品處理7、冷卻至室溫后，13000r/min離心﹥5min，上清即為核酸模板一、樣品處理7、冷卻至室溫后，13000r/min離心﹥65二、核酸擴增1、向反應管內按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL，注意加樣時槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至反應管大腔內，蓋緊管蓋并做好標記，移至反應區(qū)二、核酸擴增1、向反應管內按順序分別加入陰性對照、待檢模板和66二、核酸擴增2、置65℃恒溫反應60min二、核酸擴增2、置65℃恒溫反應60min6