Western-Blot操作解析概述課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗細胞與分子生物學(xué)實驗教學(xué)平臺

WesternBlot

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗細胞與分子生物學(xué)實驗教學(xué)平臺West2

Westernblot(immunoblotting)

1.WhatisWesternblot?Atechniquefordetectingspecificproteinsseparatedbyelectrophoresisbyuseoflabeledantibodies.SocalledsinceithassomesimilaritytoaSouthernblot.

2.Whywehavetouseit?Wecanusethistechniquetoidentifyatargetproteininacomplexmixture,andwecanalsouseittomeasureit’sexpressionlevel.3.Howtodoit?

Westernblot(immunoblotting)3步驟：SeparateproteinsbygelelectrophoresisTransferproteinsontoamembraneWettanktransfersystemSemi-drytransfersystemIdentifyproteinsImmunodetection步驟：Separateproteinsbygelel4優(yōu)點：

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小的靶蛋白優(yōu)點：高分辨率的電泳技術(shù)5蛋白提取

Totalprotein–standardlysisbuffer（lipa）Nuclearcytoplasmicextraction(NER-PER,extractionkit,Pierce)Topreventdegradationalwayscentrifugesamplesat4℃andincludeaproteaseinhibitor?ProteinQantification:StandardBCAassay(Pierce)Bradfordreagent蛋白提取

Totalprotein–standard6SDS不連續(xù)電泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis（PAGE）isthebestmethodinproteinseparate。UsePAGEtoseparateproteinsbyMW。

SDS不連續(xù)電泳PolyAcrylamideG7SDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。SDS：陰離子去污劑變性劑8蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒

（2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像9PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。化學(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polya10聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰11Western-Blot操作解析概述課件12試劑的純度溫度氧氣〔AP〕〔TEMED〕原則：盡量少的催化劑并在最佳時間內(nèi)聚合。影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素

試劑的純度影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素

13不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。凝膠濃度的選擇不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。凝膠濃度的選擇14不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度積層膠使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離PH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：PH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。不連續(xù)電泳：作用緩沖液PH凝膠濃度積層膠使蛋白樣品濃15濃縮效應(yīng)：三種離子：Cl-前導(dǎo)離子Gly-尾隨離子PI=5.97pro

積層膠分離膠大孔小孔阻力

濃縮效應(yīng)：三種離子：16配制：5ml10%分離膠3ml5%積層膠ddH2O1.92.130%Acr1.70.5PH8.8Tris1.3

PH6.8Tris

0.3820%SDS0.0250.01510%AP0.050.03TEMED0.0020.003配制：5ml10%分離膠3ml5%積層膠ddH2O17灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1SDS:<8%異丁醇：>8%灌制分離膠隔絕空氣ddH2O18灌制積層膠插入梳子灌制積層膠插入梳子19電泳后染色電泳后染色20ReversibleIrreversibleCoomassieBrilliantBluePonceauSredReversibleIrreversibleCoomassi21蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（electrotransferblot)Wettransfer

蛋白質(zhì)帶負電荷，凝膠在負極一側(cè)，硝酸纖維素膜在正極一側(cè)，接通電源以后，蛋白質(zhì)由負極向正極轉(zhuǎn)移至膜上。蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（electrotransferblot)22半干式轉(zhuǎn)膜半干式轉(zhuǎn)膜23注意：轉(zhuǎn)移單元無氣泡注意方向戴手套，防止引入污染蛋白膠、膜大小一致，半干轉(zhuǎn)注意短路。膜、濾紙要先平衡20%甲醇改善電轉(zhuǎn)移效果。轉(zhuǎn)移效果：Ponceau-SRed注意：轉(zhuǎn)移單元無氣泡24固相支持物的選擇：硝酸纖維素膜（nitrocellulose,NC)NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。結(jié)合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC韌性較差，易損壞。Polyvinylidenefluoride(PVDF)

與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結(jié)合。

固相支持物的選擇：硝酸纖維素膜（nitrocellulose25封閉：-5%BSA或non-fat-dry-milk(RTor4℃)-incubationtime:60min-O/NTween-20的作用：減少非特異性吸附不影響抗體與抗原的結(jié)合

為避免NC與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對NC上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。封閉：-5%BSA或non-fat-dry-milk(R26靶蛋白的免疫學(xué)檢測1.ChromogenicDetection:HRP:Diaminobenzidine(DAB)-brownprecipitateAP:BCIP/NTP-purple/blueprecipitate2.ChemiluminescentdetectionHRP:Luminol-oxidisedluminolemitsbluelight靶蛋白的免疫學(xué)檢測1.ChromogenicDetect27SubstrateProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentMembranePrimaryAntibodySecondaryAntibody/Enzyme(E)EEsssssssssProductPPPPPSubstrateProteinProteinBlockin28PoorTransferAdjustcompositionofthetransferbuffer MethanolSDSEquilibrategelandthemembraneinthetransferbuffer-Equilibratefor5-30minsPoorTransferAdjustcompositio29TransferofabroadMWrangeofproteinsmayrequireamulti-steptransfer.Startatlowcurrent/voltagetogivegoodbindingoflowmolecularweightproteinsAfter30minutesincreasecurrent/voltagetopromoteelutionofhighmolecularweightproteinsCitation:TwoStepElectrotransferProcedure-T.Otteretal,Anal.Biochem.162:370-377(1987)TransferofarangeofproteinswithdifferentmolecularweightsTransferofabroadMWrangeo30Primaryantibodydilution:higherspecificitySecondaryantibodydilution:lowerbackgroundNoisyBackground：OptimizingAbconcentration,Optimizingblockingreagent,OptimizewashingExtensivewashingHighsaltwashLowSpecificitywithHighBackgroundPrimaryantibodydilution:hig31Someexamples：Someexamples：32生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗細胞與分子生物學(xué)實驗教學(xué)平臺

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Westernblot(immunoblotting)

1.WhatisWesternblot?Atechniquefordetectingspecificproteinsseparatedbyelectrophoresisbyuseoflabeledantibodies.SocalledsinceithassomesimilaritytoaSouthernblot.

2.Whywehavetouseit?Wecanusethistechniquetoidentifyatargetproteininacomplexmixture,andwecanalsouseittomeasureit’sexpressionlevel.3.Howtodoit?

Westernblot(immunoblotting)34步驟：SeparateproteinsbygelelectrophoresisTransferproteinsontoamembraneWettanktransfersystemSemi-drytransfersystemIdentifyproteinsImmunodetection步驟：Separateproteinsbygelel35優(yōu)點：

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小的靶蛋白優(yōu)點：高分辨率的電泳技術(shù)36蛋白提取

Totalprotein–standardlysisbuffer（lipa）Nuclearcytoplasmicextraction(NER-PER,extractionkit,Pierce)Topreventdegradationalwayscentrifugesamplesat4℃andincludeaproteaseinhibitor?ProteinQantification:StandardBCAassay(Pierce)Bradfordreagent蛋白提取

Totalprotein–standard37SDS不連續(xù)電泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis（PAGE）isthebestmethodinproteinseparate。UsePAGEtoseparateproteinsbyMW。

SDS不連續(xù)電泳PolyAcrylamideG38SDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。SDS：陰離子去污劑變性劑39蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒

（2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像40PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polya41聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰42Western-Blot操作解析概述課件43試劑的純度溫度氧氣〔AP〕〔TEMED〕原則：盡量少的催化劑并在最佳時間內(nèi)聚合。影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素

試劑的純度影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素

44不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。凝膠濃度的選擇不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。凝膠濃度的選擇45不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度積層膠使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離PH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：PH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。不連續(xù)電泳：作用緩沖液PH凝膠濃度積層膠使蛋白樣品濃46濃縮效應(yīng)：三種離子：Cl-前導(dǎo)離子Gly-尾隨離子PI=5.97pro

積層膠分離膠大孔小孔阻力

濃縮效應(yīng)：三種離子：47配制：5ml10%分離膠3ml5%積層膠ddH2O1.92.130%Acr1.70.5PH8.8Tris1.3

PH6.8Tris

0.3820%SDS0.0250.01510%AP0.050.03TEMED0.0020.003配制：5ml10%分離膠3ml5%積層膠ddH2O48灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1SDS:<8%異丁醇：>8%灌制分離膠隔絕空氣ddH2O49灌制積層膠插入梳子灌制積層膠插入梳子50電泳后染色電泳后染色51ReversibleIrreversibleCoomassieBrilliantBluePonceauSredReversibleIrreversibleCoomassi52蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（electrotransferblot)Wettransfer

蛋白質(zhì)帶負電荷，凝膠在負極一側(cè)，硝酸纖維素膜在正極一側(cè)，接通電源以后，蛋白質(zhì)由負極向正極轉(zhuǎn)移至膜上。蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（electrotransferblot)53半干式轉(zhuǎn)膜半干式轉(zhuǎn)膜54注意：轉(zhuǎn)移單元無氣泡注意方向戴手套，防止引入污染蛋白膠、膜大小一致，半干轉(zhuǎn)注意短路。膜、濾紙要先平衡20%甲醇改善電轉(zhuǎn)移效果。轉(zhuǎn)移效果：Ponceau-SRed注意：轉(zhuǎn)移單元無氣泡55固相支持物的選擇：硝酸纖維素膜（nitrocellulose,NC)NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。結(jié)合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC韌性較差，易損壞。Polyvinylidenefluoride(PVDF)

與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結(jié)合。

固相支持物的選擇：硝酸纖維素膜（nitrocellulose56封閉：-5%BSA或non-fat-dry-milk(RTor4℃)-incubationtime:60min-O/NTween-20的作用：減少非特異性吸附不影響抗體與抗原的結(jié)合

為避免NC與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對NC上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。封閉：-5%BSA或non-fat-dry-milk(R57靶蛋白的免疫學(xué)檢測1.ChromogenicDetection:HRP:Diaminobenzidine(DAB)-brownprecipitateAP:BCIP/NTP-purple/blueprecipitate2.ChemiluminescentdetectionHRP:Luminol-oxidisedluminolemitsbluelight靶蛋白的免疫學(xué)檢測1.ChromogenicDetect58SubstrateProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentMembranePrimaryAntibodySecondary