霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件

研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。

研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，1研究背景其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見(jiàn)。研究背景其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐2研究背景②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠磻?yīng)性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)少于1%Reed-Sternberg細(xì)胞（R-S細(xì)胞）。這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)研究背景②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠?研究背景p53和bcl-2基因突變EB病毒感染但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制尚未明確腫瘤細(xì)胞研究背景4研究背景有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。[1]IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。研究背景有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激5研究背景將對(duì)IκBα激酶（IκBαkinase,IKK）無(wú)反應(yīng)的IκBα突變體導(dǎo)入HRS細(xì)胞中可阻斷NF-κB的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說(shuō)明IκBα在HL發(fā)病機(jī)制中有重要作用。[2]研究背景將對(duì)IκBα激酶（IκBαkinase,IKK6研究背景Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBαmRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。[3]研究背景Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBα7用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）EnVision兩步法電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。Thankyou！這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。[2]DejardinE,etal.如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育?；羝娼鹆馨土觯℉odgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：Blood,1999,94(9):3129-34.PCR引物（北京賽百勝公司）研究目的本實(shí)驗(yàn)意在：①了解IκBα基因在HL中突變的情況；②分析經(jīng)典型HLHRS中IκBα突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；③以及這些異常的病理意義，即其與HL發(fā)病的相關(guān)性。用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用8實(shí)驗(yàn)材料與試劑霍奇金淋巴瘤組織樣本CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)PCR引物（北京賽百勝公司）PCR儀（包括反應(yīng)體系）DNA測(cè)序儀實(shí)驗(yàn)材料與試劑霍奇金淋巴瘤組織樣本9實(shí)驗(yàn)流程CD30免疫組化激光顯微切割和DNA提取IκBα基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)基因外含子測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程CD30免疫組化10CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化11CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，12激光顯微切割和DNA提取用LeicaASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的CD30陽(yáng)性細(xì)胞（切割參數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長(zhǎng)377，速度5，光束直徑8）。將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本3～6組，每組約25～70個(gè)細(xì)胞。切割周?chē)恼Ａ馨图?xì)胞每例2管，每管約50個(gè)細(xì)胞。激光顯微切割和DNA提取用LeicaASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切13擴(kuò)增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。

（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，

模板2．0μl，總體積25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55％退火1min，72oC延伸1min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結(jié)束。

以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對(duì)照。）擴(kuò)增目的基因，上游引物：14IκBα基因擴(kuò)增對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα6個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。IκBα基因擴(kuò)增對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα15霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件16PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增IκBα第一和第二外顯子反應(yīng)體系：10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物1μIxl；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5min，繼而95℃變性50s，65℃退火30s，72℃延伸90S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。第二輪，反應(yīng)體系50μl，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25μl。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。反應(yīng)條件同第一輪。擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：

第一輪，l0×PCR緩沖液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／

μL)2．0μl，引物1μl。反應(yīng)條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退火溫度為63℃。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，5min，繼而95℃變性50S，65℃退火30S，72oC延伸90S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增IκBα第一和第二外顯子反應(yīng)體系：17PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μlPCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120mA，20min。紫外燈下觀(guān)察。IκBα的6個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μlPCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳18預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。19預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。沒(méi)有突變點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。20待測(cè)基因外含子測(cè)序每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。待測(cè)基因外含子測(cè)序21擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。IκBα基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變[2]DejardinE,etal.EnVision兩步法Thankyou！擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。Blood,1999,94(9):3129-34.C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBαmRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3'預(yù)期結(jié)果——測(cè)序堿基序列出現(xiàn)改變圖A-箭頭處為T(mén)-A突變（TGA為終止密碼）圖B-反向測(cè)序證實(shí)（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不22預(yù)期結(jié)果堿基序列沒(méi)有突變C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序預(yù)期結(jié)果堿基序列沒(méi)有突變C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序23預(yù)期結(jié)果腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒(méi)有突變。腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα基因都沒(méi)有突變。腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα的突變率都增加IκBα基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān)IκBα基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化估計(jì)不會(huì)發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進(jìn)一步研究預(yù)期結(jié)果腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞24參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Con25Thankyou！Thankyou！26巢式PCR巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第1輪PCR，然后再使用第1對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱(chēng)為巢式PCR。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。巢式PCR巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymears27反向測(cè)序一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3'另外一個(gè)就是反向引物（下游引物），用它來(lái)測(cè)序就是反向測(cè)序（從下游往上測(cè)序），也就是3'到5'如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）反向測(cè)序一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(2810XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物1μIxl；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；Blood,1999,94(9):3129-34.霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。模板2．0μl，總體積25μl。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制Blood,1999,94(9):3129-34.[3]EmmerichF,etal.

EnVision兩步法DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。

10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmo29CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化30CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，31預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。沒(méi)有突變點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。32參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Con33Thankyou！Thankyou！34Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）PCR引物（北京賽百勝公司）6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒(méi)有突變。其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。[1]BargouR.以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：第一輪，l0×PCR緩沖液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／μL)2．0μl，引物1μl。Thankyou！為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變IκBα的6個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。[3]EmmerichF,etal.C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序擴(kuò)增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗?；羝娼鹆馨土觯℉odgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；①了解IκBα基因在HL中突變的情況；RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒(méi)有突變。Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].IκBα基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化第二輪，反應(yīng)體系50μl，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25μl。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序?yàn)榱私?jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠磻?yīng)性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)少于1%Reed-Sternberg細(xì)胞（R-S細(xì)胞）。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；Oncogene,1999,18(16):2567-77.將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本3～6組，每組約25～70個(gè)細(xì)胞。[1]BargouR.（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對(duì)照。C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序?qū)⒛康募?xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本3～6組，每組約25～70個(gè)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒(méi)有突變。如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3'Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBαmRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。

EnVision兩步法DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。

Constitutivenuclearfactor-ka35研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。

研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，36研究背景其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見(jiàn)。研究背景其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐37研究背景②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠磻?yīng)性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)少于1%Reed-Sternberg細(xì)胞（R-S細(xì)胞）。這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)研究背景②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠?8研究背景p53和bcl-2基因突變EB病毒感染但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制尚未明確腫瘤細(xì)胞研究背景39研究背景有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。[1]IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。研究背景有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激40研究背景將對(duì)IκBα激酶（IκBαkinase,IKK）無(wú)反應(yīng)的IκBα突變體導(dǎo)入HRS細(xì)胞中可阻斷NF-κB的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說(shuō)明IκBα在HL發(fā)病機(jī)制中有重要作用。[2]研究背景將對(duì)IκBα激酶（IκBαkinase,IKK41研究背景Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBαmRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。[3]研究背景Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBα42用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）EnVision兩步法電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。Thankyou！這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。[2]DejardinE,etal.如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育?；羝娼鹆馨土觯℉odgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：Blood,1999,94(9):3129-34.PCR引物（北京賽百勝公司）研究目的本實(shí)驗(yàn)意在：①了解IκBα基因在HL中突變的情況；②分析經(jīng)典型HLHRS中IκBα突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；③以及這些異常的病理意義，即其與HL發(fā)病的相關(guān)性。用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用43實(shí)驗(yàn)材料與試劑霍奇金淋巴瘤組織樣本CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)PCR引物（北京賽百勝公司）PCR儀（包括反應(yīng)體系）DNA測(cè)序儀實(shí)驗(yàn)材料與試劑霍奇金淋巴瘤組織樣本44實(shí)驗(yàn)流程CD30免疫組化激光顯微切割和DNA提取IκBα基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)基因外含子測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程CD30免疫組化45CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化46CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，47激光顯微切割和DNA提取用LeicaASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的CD30陽(yáng)性細(xì)胞（切割參數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長(zhǎng)377，速度5，光束直徑8）。將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本3～6組，每組約25～70個(gè)細(xì)胞。切割周?chē)恼Ａ馨图?xì)胞每例2管，每管約50個(gè)細(xì)胞。激光顯微切割和DNA提取用LeicaASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切48擴(kuò)增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。

（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，

模板2．0μl，總體積25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55％退火1min，72oC延伸1min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結(jié)束。

以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對(duì)照。）擴(kuò)增目的基因，上游引物：49IκBα基因擴(kuò)增對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα6個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。IκBα基因擴(kuò)增對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα50霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件51PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增IκBα第一和第二外顯子反應(yīng)體系：10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物1μIxl；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5min，繼而95℃變性50s，65℃退火30s，72℃延伸90S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。第二輪，反應(yīng)體系50μl，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25μl。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。反應(yīng)條件同第一輪。擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：

第一輪，l0×PCR緩沖液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／

μL)2．0μl，引物1μl。反應(yīng)條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退火溫度為63℃。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，5min，繼而95℃變性50S，65℃退火30S，72oC延伸90S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增IκBα第一和第二外顯子反應(yīng)體系：52PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μlPCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120mA，20min。紫外燈下觀(guān)察。IκBα的6個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5μlPCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳53預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。54預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。沒(méi)有突變點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。55待測(cè)基因外含子測(cè)序每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。待測(cè)基因外含子測(cè)序56擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。IκBα基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變[2]DejardinE,etal.EnVision兩步法Thankyou！擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。Blood,1999,94(9):3129-34.C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBαmRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。電泳條帶不在同一水平線(xiàn)上——基因明顯突變。一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3'預(yù)期結(jié)果——測(cè)序堿基序列出現(xiàn)改變圖A-箭頭處為T(mén)-A突變（TGA為終止密碼）圖B-反向測(cè)序證實(shí)（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2μlDMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不57預(yù)期結(jié)果堿基序列沒(méi)有突變C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序預(yù)期結(jié)果堿基序列沒(méi)有突變C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序58預(yù)期結(jié)果腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒(méi)有突變。腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα基因都沒(méi)有突變。腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα的突變率都增加IκBα基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān)IκBα基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化估計(jì)不會(huì)發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進(jìn)一步研究預(yù)期結(jié)果腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞59參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Con60Thankyou！Thankyou！61巢式PCR巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱(chēng)套式PCR。在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第1輪PCR，然后再使用第1對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱(chēng)為巢式PCR。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。巢式PCR巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymears62反向測(cè)序一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3'另外一個(gè)就是反向引物（下游引物），用它來(lái)測(cè)序就是反向測(cè)序（從下游往上測(cè)序），也就是3'到5'如果片段在800以?xún)?nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）反向測(cè)序一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(6310XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物1μIxl；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物0．3μl，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50μI。（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].用已知IκBα外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；Blood,1999,94(9):3129-34.霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型。模板2．0μl，總體積25μl。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞)擴(kuò)增IκBα第三到第六外顯子反應(yīng)體系：（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，C、D分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制Blood,1999,94(9):3129-34.[3]EmmerichF,etal.

EnVision兩步法DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。

10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmo64CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化65CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，66預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。沒(méi)有突變點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變預(yù)期結(jié)果——電泳電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。67參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……參考文獻(xiàn)[1]BargouR.C,etal.Con68Thankyou！Thankyou！69Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）PCR引物（北京賽百勝公司）6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以?xún)?nèi)是可信的）電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25μL。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。電泳條帶在同一水平線(xiàn)上。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即

EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而