《放射免疫標(biāo)記》課件

放射免疫技術(shù)

精選ppt放射免疫技術(shù)

精選ppt1放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素為示蹤物的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。常用于定量測(cè)定受檢樣本中的微量物質(zhì)，在內(nèi)分泌學(xué)、免疫學(xué)、藥物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是放射免疫技術(shù)總是伴有不同程度放射性污染，目前有逐漸被其他免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)所取代的趨勢(shì)。精選ppt放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）是以2放射免疫技術(shù)類型主要包括:放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)免疫放射分析或免疫放射度量分析(immunoradiometricassay，IRMA)精選ppt放射免疫技術(shù)類型主要包括:精選ppt3放射免疫分析(RIA)是以放射性核素標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的特異性抗體，來測(cè)定待測(cè)抗原含量的一種競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)方法。即經(jīng)典的RIA法。是目前應(yīng)用最廣的放射免疫技術(shù)。精選ppt放射免疫分析(RIA)是以放射性核素標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)4免疫放射分析(IRMA)又稱免疫放射度量分析，是以放射性核素標(biāo)記的抗體與待測(cè)抗原發(fā)生非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，來測(cè)定待測(cè)抗原含量的一種非競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)方法。精選ppt免疫放射分析(IRMA)又稱免疫放射度量分析，是以放射性核素5一、放射性核素標(biāo)記物的制備放射性核素標(biāo)記物是指放射性核素標(biāo)記在目的抗原或抗體上所形成的放射性標(biāo)記抗原或抗體，是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成成份。精選ppt一、放射性核素標(biāo)記物的制備放射性核素標(biāo)記物是指放射性核素標(biāo)記6（一）放射性核素放射性核素是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級(jí)的變化，然后變成另一種核素，變化時(shí)伴有射線的發(fā)射。其放射量單位有:①放射性活度②放射性比活度③放射性濃度精選ppt（一）放射性核素放射性核素是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級(jí)的7①放射性活度——單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒衰變次數(shù)，用貝可勒爾(Becquerel，Bq)表示1Ci=3.7×1010Bq精選ppt①放射性活度——單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒衰變次數(shù)，用貝可8②放射性比活度——是指單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示③放射性濃度——是指單位體積溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。精選ppt②放射性比活度——是指單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/9放射性核素類別依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍計(jì)數(shù)器及γ計(jì)數(shù)器測(cè)定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。現(xiàn)以125I和3H為例比較兩者的特點(diǎn)(表19-1)。精選ppt放射性核素類別依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有10表19-1125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物3H標(biāo)記物標(biāo)記方法方法簡(jiǎn)便，易獲得高比放射性標(biāo)記物方法較難，不易獲得高比放射性標(biāo)記物對(duì)標(biāo)記化合物影響標(biāo)記時(shí)以I代替H1改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可影響抗原免疫學(xué)活性不改變抗原結(jié)構(gòu)，一般不影響抗原免疫活性測(cè)量方法方法簡(jiǎn)便、效率高方法復(fù)雜，效率低測(cè)量?jī)x器γ計(jì)數(shù)器液體閃爍計(jì)數(shù)器半衰期60.2天約11年廢棄物處理容易較難精選ppt表19-1125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物11放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對(duì)抗原或抗體沒損害并且容易標(biāo)記。125I最接近理想條件，其比活度為6.438×1014Bq/g，而14C的最大比活度為16.65×1010Bq/g，如果標(biāo)記量相同，125I敏感度比14C大3900倍。精選ppt放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對(duì)抗原或抗體沒損害并12(二)抗原或抗體用于放射性標(biāo)記的抗原或抗體的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性;用于標(biāo)記的抗原要求純度高，并具有足夠或完整的免疫活性；用于標(biāo)記的抗體應(yīng)具有高親和常數(shù)、交叉反應(yīng)率低、抗體滴度高。精選ppt(二)抗原或抗體用于放射性標(biāo)記的抗原或抗體的質(zhì)量直接影響分13（三）放射性核素標(biāo)記物的制備RIA和IRMA分別以放射性核素標(biāo)記抗原和放射性核素標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原。以放射性核素125I標(biāo)記抗原為例說明標(biāo)記物制備。精選ppt（三）放射性核素標(biāo)記物的制備RIA和IRMA分別以放射性核141．直接標(biāo)記法是將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯環(huán)上，形成單碘酪氨酸或雙碘酪氨酸。操作簡(jiǎn)便，結(jié)合效率高，但只能標(biāo)記含酪氨酸的化合物，有時(shí)可能會(huì)損害蛋白質(zhì)的活性。精選ppt1．直接標(biāo)記法是將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯152.間接標(biāo)記法亦稱聯(lián)結(jié)標(biāo)記法。這種方法是先將放射性碘連接到一個(gè)小分子載體上，再將這個(gè)小分子載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。具有代表性的方法是Bolton-Hunter法，使用的載體分子是N-琥珀酰亞胺3-(4-羥基苯)-丙酸(SHPP)。標(biāo)記方法分兩步進(jìn)行，第一步是先用氯胺T法使SHPP碘化，第二步再將碘化SHPP分子偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上。精選ppt2.間接標(biāo)記法亦稱聯(lián)結(jié)標(biāo)記法。這種方法是先將放射性碘連接到一16(四)放射性標(biāo)記物的純化與鑒定1.放射性標(biāo)記物純化可用葡聚糖凝膠過濾法或薄層層析法、紙層析法、電泳法、高效液相層析法等。2.放射性標(biāo)記物的鑒定理想的放射性標(biāo)記物是高放射化學(xué)純度、適當(dāng)?shù)谋确派湫院兔庖呋钚?。精選ppt(四)放射性標(biāo)記物的純化與鑒定1.放射性標(biāo)記物純化17(1)放射化學(xué)純度是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率;即碘化蛋白峰的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。影響因素:①被標(biāo)記物不純，雜質(zhì)也被放射性核素標(biāo)記；②標(biāo)記后的分離純化不完全；③標(biāo)記化合物貯存過程中的碘脫落。精選ppt(1)放射化學(xué)純度是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射18(2)比放射性或稱放射性比度,是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，單位為Bq/g。標(biāo)記抗原的比放射性越高，所需標(biāo)記抗原量越少，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的敏感度越高。但過高的比放射性可能會(huì)損傷抗原的免疫活性。如碘標(biāo)記化合物以單碘標(biāo)記為宜。精選ppt(2)比放射性或稱放射性比度,是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，19(3)免疫活性是指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。以檢查標(biāo)記后免疫活性損失情況。方法是加10倍量抗體和標(biāo)記抗原反應(yīng)，測(cè)定結(jié)合部分(B)和游離部分(F)的放射強(qiáng)度，算出B/B+F的百分率，正常應(yīng)在80%以上，值越大，說明抗原損傷越少;如果值過小，標(biāo)記抗原應(yīng)重新強(qiáng)化或廢棄重做。精選ppt(3)免疫活性是指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度20二、抗體選用抗體也是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成試劑之一，常采用含特異性抗體的抗血清和小鼠雜交瘤單克隆抗體?？贵w的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性?？贵w的質(zhì)量指標(biāo)主要有親和常數(shù)、特異性和效價(jià)。精選ppt二、抗體選用抗體也是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成試劑之一，常采21三、免疫復(fù)合物分離技術(shù)在放射免疫技術(shù)的反應(yīng)系統(tǒng)中，因抗原和抗體含量極微，所形成的免疫復(fù)合物不發(fā)生沉淀。必須采用適當(dāng)方法將反應(yīng)平衡時(shí)※Ag-Ab復(fù)合物（B）和游離※Ag（F）分開，才能分別測(cè)量其放射性。精選ppt三、免疫復(fù)合物分離技術(shù)在放射免疫技術(shù)的反應(yīng)系統(tǒng)中，因抗原和抗22理想的分離技術(shù)符合條件①簡(jiǎn)便易行，適于大批量樣品分析;②分離效果完全、快速，非特異結(jié)合低;③試劑來源容易、價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、可長(zhǎng)期保存;④不受外界因素和樣品中其他組分的干擾，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)抗原分離效果相同;⑤適合自動(dòng)化分析的要求。

目前尚無完全滿足上述條件的分離方法精選ppt理想的分離技術(shù)符合條件①簡(jiǎn)便易行，適于大批量樣品分析;精選p23免疫復(fù)合物分離常用方法1.吸附法是用吸附劑(如活性炭)吸附小分子的游離。2.化學(xué)沉淀法RIA反應(yīng)條件接近抗體的等電點(diǎn)，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白質(zhì)沉淀劑可破壞蛋白分子表面的水化層而使蛋白沉淀，從而分離B與F。3.雙抗體法利用抗抗體和※Ag-Ab復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成更大免疫復(fù)合物，離心沉淀即可分離B與F。精選ppt免疫復(fù)合物分離常用方法1.吸附法是用吸附劑(如活性炭)244．PR試劑將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各自的不足，分離效果好，適用范圍廣。5．固相分離法將抗體或抗原結(jié)合在固相載體（如磁顆粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗體或抗原分離B和F，具有簡(jiǎn)便、快速、適合于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的液相分離方法。精選ppt4．PR試劑將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各25核射線探測(cè)儀器由射線探測(cè)器和后續(xù)電子學(xué)單元兩大部分組成。核射線探測(cè)器是個(gè)能量轉(zhuǎn)化器，其檢測(cè)原理是當(dāng)射線作用于閃爍體，閃爍體吸收了射線的能量而引起閃爍體中的原子或分子激發(fā)，當(dāng)受激的原子或分子退激時(shí)，則發(fā)出光子進(jìn)入光電倍增管光陰極，轉(zhuǎn)換為光電子，光電子在光電倍增管電場(chǎng)作用下到達(dá)陽極，形成電脈沖。轉(zhuǎn)換模式是放射能→光能→電能→脈沖。精選ppt核射線探測(cè)儀器由射線探測(cè)器和后續(xù)電子學(xué)單元兩大部分組成。核射26第二節(jié)放射免疫分析該項(xiàng)技術(shù)是由1959年美國Berson和Yalow首先以放射性碘標(biāo)記胰島素測(cè)定血清中胰島素含量而建立起來的。開創(chuàng)了體外微量物質(zhì)檢測(cè)新紀(jì)元。于1977年獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。精選ppt第二節(jié)放射免疫分析該項(xiàng)技術(shù)是由1959年美國Berson和27一、原理其基本原理是抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，即待測(cè)抗原(Ag)和定量的標(biāo)記抗原(※Ag)與限量的抗體(Ab)進(jìn)行特異性反應(yīng)，其中Ab的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)小于Ag＋※Ag的結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)，則Ag和※Ag與Ab發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。如待測(cè)Ag含量多，則Ag-Ab復(fù)合物形成得多，※Ag-Ab復(fù)合物(B)形成少，游離的※Ag（F）多，反之亦然（圖19-1）。精選ppt一、原理其基本原理是抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，即待測(cè)28精選ppt精選ppt29二、技術(shù)要點(diǎn)1.抗原抗體反應(yīng)為待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。根據(jù)加樣順序不同，RIA可分為2個(gè)類型：①平衡法將Ag和※Ag同時(shí)與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離※Ag-Ab和※Ag，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差；②順序飽和法先將待測(cè)Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入※Ag，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。精選ppt二、技術(shù)要點(diǎn)1.抗原抗體反應(yīng)為待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的302.B/F分離B/F分離技術(shù)如第一節(jié)所述，具體操作中應(yīng)注意B/F分離好壞是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，為了使測(cè)量結(jié)果能代表反應(yīng)結(jié)果，要求分離方法能使B和F得以完全有效地分開，且要求分離不破壞已經(jīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的免疫反應(yīng)。因此常常要求提高分離速度、降低操作溫度、縮短分離劑和反應(yīng)系統(tǒng)的接觸時(shí)間等。精選ppt2.B/F分離B/F分離技術(shù)如第一節(jié)所述，具體操作313.放射性強(qiáng)度測(cè)定根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計(jì)數(shù)儀（β型）和γ計(jì)數(shù)儀（γ型），測(cè)定各待測(cè)標(biāo)本和備抗原標(biāo)準(zhǔn)品的※Ag-Ab放射性強(qiáng)度(B)或游離※Ag放射性強(qiáng)度(F)。精選ppt3.放射性強(qiáng)度測(cè)定根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計(jì)數(shù)324.數(shù)據(jù)處理(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)為放射性反應(yīng)參數(shù)，有各種表示方式，可選用B/F、B/T、F/B、B/B0等比值或B或F的cpm值，常選用B/B0比值作為參數(shù)。橫坐標(biāo)為已知測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，以算術(shù)數(shù)或?qū)?shù)表示。放射免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線為雙曲線(圖19-2)精選ppt4.數(shù)據(jù)處理(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)33RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型

（1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計(jì)數(shù)（cpm）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為縱坐標(biāo)，曲線呈反S型；(3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，logitB/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為從左到右的漸降直線。精選pptRIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型（1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%34(2)抗原含量計(jì)算根據(jù)待測(cè)抗原管的放射性強(qiáng)度計(jì)算相應(yīng)反應(yīng)參數(shù)值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得待測(cè)抗原相應(yīng)含量。精選ppt(2)抗原含量計(jì)算根據(jù)待測(cè)抗原管的放射性強(qiáng)度計(jì)算相應(yīng)反35三、方法學(xué)評(píng)價(jià)RIA優(yōu)點(diǎn)①敏感度高，能測(cè)到μg/L，甚至可測(cè)到ng/L或pg/水平；②特異性強(qiáng)，與結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)間的交叉反應(yīng)少；③準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好，批間批內(nèi)誤差低；④用血量少。RIA缺點(diǎn)①有放射性核素對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室污染；②放射性核素易衰變以及放射性標(biāo)記物不穩(wěn)定，導(dǎo)致試劑有效期短。精選ppt三、方法學(xué)評(píng)價(jià)RIA優(yōu)點(diǎn)①敏感度高，能測(cè)到μg/L，甚至可36第二節(jié)免疫放射技術(shù)1968年Miles和Hales應(yīng)用同位素標(biāo)記的抗胰島素抗體檢測(cè)牛血清中胰島素獲得成功。IRMA的靈敏度明顯高于RIA。精選ppt第二節(jié)免疫放射技術(shù)1968年Miles和Hales應(yīng)用同位37一、原理免疫放射分析的原理屬于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)。是將放射性同位素標(biāo)記在抗體上，用過量的標(biāo)記抗體(Ab)與待測(cè)抗原反應(yīng)，反應(yīng)式為Ag+※Ab=Ag-※Ab+※Ab。待充分反應(yīng)后，除去游離的標(biāo)記抗體，Ag-※Ab結(jié)合物的放射性強(qiáng)度與待測(cè)抗原量呈正比關(guān)系，即待測(cè)抗原含量越多，則復(fù)合物的計(jì)數(shù)率就越高，反之則越低。其反應(yīng)式如下：精選ppt一、原理免疫放射分析的原理屬于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)。是將放射38Ag+Ab*(過量)Ag-Ab*+Ab*

精選pptAg+Ab*(過量)Ag-Ab*+39IRMA方法學(xué)單點(diǎn)IRMA法（圖19-3）雙位點(diǎn)IRMA法（圖19-4）精選pptIRMA方法學(xué)單點(diǎn)IRMA法（圖19-3）精選ppt40

單位點(diǎn)IRMA原理示意圖

精選ppt單位點(diǎn)IRMA原理示意圖精選ppt41

雙位點(diǎn)IRMA原理示意圖精選ppt雙位點(diǎn)IRMA原理示意圖精選ppt42二、技術(shù)要點(diǎn)1．抗原抗體反應(yīng)向已包被抗體的反應(yīng)管（包被試管或包被珠）中加入待測(cè)抗原和標(biāo)記抗體,進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，在一定的溫度下溫育，使反應(yīng)達(dá)到平衡。2．B/F分離采用固相分離法，洗滌或吸棄上清液，除去未結(jié)合的游離標(biāo)記抗體。精選ppt二、技術(shù)要點(diǎn)1．抗原抗體反應(yīng)向已包被抗體的反應(yīng)管（433．放射性強(qiáng)度測(cè)定除去游離標(biāo)記抗體后，測(cè)定反應(yīng)管中放射性強(qiáng)度4．?dāng)?shù)據(jù)處理反應(yīng)管中放射性強(qiáng)度即代表與抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體量。IRMA復(fù)合物放射性強(qiáng)度與待測(cè)抗原量呈正比，用抗原標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得待測(cè)抗原量。精選ppt3．放射性強(qiáng)度測(cè)定除去游離標(biāo)記抗體后，測(cè)定反應(yīng)管中放射44三、方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)

1．敏感性高2．特異性高3．標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記容易。4．結(jié)果穩(wěn)定精選ppt三、方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)精選ppt45放射免疫技術(shù)

精選ppt放射免疫技術(shù)

精選ppt46放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素為示蹤物的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。常用于定量測(cè)定受檢樣本中的微量物質(zhì)，在內(nèi)分泌學(xué)、免疫學(xué)、藥物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是放射免疫技術(shù)總是伴有不同程度放射性污染，目前有逐漸被其他免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)所取代的趨勢(shì)。精選ppt放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）是以47放射免疫技術(shù)類型主要包括:放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)免疫放射分析或免疫放射度量分析(immunoradiometricassay，IRMA)精選ppt放射免疫技術(shù)類型主要包括:精選ppt48放射免疫分析(RIA)是以放射性核素標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的特異性抗體，來測(cè)定待測(cè)抗原含量的一種競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)方法。即經(jīng)典的RIA法。是目前應(yīng)用最廣的放射免疫技術(shù)。精選ppt放射免疫分析(RIA)是以放射性核素標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)49免疫放射分析(IRMA)又稱免疫放射度量分析，是以放射性核素標(biāo)記的抗體與待測(cè)抗原發(fā)生非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，來測(cè)定待測(cè)抗原含量的一種非競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)方法。精選ppt免疫放射分析(IRMA)又稱免疫放射度量分析，是以放射性核素50一、放射性核素標(biāo)記物的制備放射性核素標(biāo)記物是指放射性核素標(biāo)記在目的抗原或抗體上所形成的放射性標(biāo)記抗原或抗體，是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成成份。精選ppt一、放射性核素標(biāo)記物的制備放射性核素標(biāo)記物是指放射性核素標(biāo)記51（一）放射性核素放射性核素是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級(jí)的變化，然后變成另一種核素，變化時(shí)伴有射線的發(fā)射。其放射量單位有:①放射性活度②放射性比活度③放射性濃度精選ppt（一）放射性核素放射性核素是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級(jí)的52①放射性活度——單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒衰變次數(shù)，用貝可勒爾(Becquerel，Bq)表示1Ci=3.7×1010Bq精選ppt①放射性活度——單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒衰變次數(shù)，用貝可53②放射性比活度——是指單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示③放射性濃度——是指單位體積溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。精選ppt②放射性比活度——是指單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/54放射性核素類別依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍計(jì)數(shù)器及γ計(jì)數(shù)器測(cè)定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用?，F(xiàn)以125I和3H為例比較兩者的特點(diǎn)(表19-1)。精選ppt放射性核素類別依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有55表19-1125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物3H標(biāo)記物標(biāo)記方法方法簡(jiǎn)便，易獲得高比放射性標(biāo)記物方法較難，不易獲得高比放射性標(biāo)記物對(duì)標(biāo)記化合物影響標(biāo)記時(shí)以I代替H1改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可影響抗原免疫學(xué)活性不改變抗原結(jié)構(gòu)，一般不影響抗原免疫活性測(cè)量方法方法簡(jiǎn)便、效率高方法復(fù)雜，效率低測(cè)量?jī)x器γ計(jì)數(shù)器液體閃爍計(jì)數(shù)器半衰期60.2天約11年廢棄物處理容易較難精選ppt表19-1125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物56放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對(duì)抗原或抗體沒損害并且容易標(biāo)記。125I最接近理想條件，其比活度為6.438×1014Bq/g，而14C的最大比活度為16.65×1010Bq/g，如果標(biāo)記量相同，125I敏感度比14C大3900倍。精選ppt放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對(duì)抗原或抗體沒損害并57(二)抗原或抗體用于放射性標(biāo)記的抗原或抗體的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性;用于標(biāo)記的抗原要求純度高，并具有足夠或完整的免疫活性；用于標(biāo)記的抗體應(yīng)具有高親和常數(shù)、交叉反應(yīng)率低、抗體滴度高。精選ppt(二)抗原或抗體用于放射性標(biāo)記的抗原或抗體的質(zhì)量直接影響分58（三）放射性核素標(biāo)記物的制備RIA和IRMA分別以放射性核素標(biāo)記抗原和放射性核素標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原。以放射性核素125I標(biāo)記抗原為例說明標(biāo)記物制備。精選ppt（三）放射性核素標(biāo)記物的制備RIA和IRMA分別以放射性核591．直接標(biāo)記法是將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯環(huán)上，形成單碘酪氨酸或雙碘酪氨酸。操作簡(jiǎn)便，結(jié)合效率高，但只能標(biāo)記含酪氨酸的化合物，有時(shí)可能會(huì)損害蛋白質(zhì)的活性。精選ppt1．直接標(biāo)記法是將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯602.間接標(biāo)記法亦稱聯(lián)結(jié)標(biāo)記法。這種方法是先將放射性碘連接到一個(gè)小分子載體上，再將這個(gè)小分子載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。具有代表性的方法是Bolton-Hunter法，使用的載體分子是N-琥珀酰亞胺3-(4-羥基苯)-丙酸(SHPP)。標(biāo)記方法分兩步進(jìn)行，第一步是先用氯胺T法使SHPP碘化，第二步再將碘化SHPP分子偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上。精選ppt2.間接標(biāo)記法亦稱聯(lián)結(jié)標(biāo)記法。這種方法是先將放射性碘連接到一61(四)放射性標(biāo)記物的純化與鑒定1.放射性標(biāo)記物純化可用葡聚糖凝膠過濾法或薄層層析法、紙層析法、電泳法、高效液相層析法等。2.放射性標(biāo)記物的鑒定理想的放射性標(biāo)記物是高放射化學(xué)純度、適當(dāng)?shù)谋确派湫院兔庖呋钚?。精選ppt(四)放射性標(biāo)記物的純化與鑒定1.放射性標(biāo)記物純化62(1)放射化學(xué)純度是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率;即碘化蛋白峰的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。影響因素:①被標(biāo)記物不純，雜質(zhì)也被放射性核素標(biāo)記；②標(biāo)記后的分離純化不完全；③標(biāo)記化合物貯存過程中的碘脫落。精選ppt(1)放射化學(xué)純度是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射63(2)比放射性或稱放射性比度,是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，單位為Bq/g。標(biāo)記抗原的比放射性越高，所需標(biāo)記抗原量越少，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的敏感度越高。但過高的比放射性可能會(huì)損傷抗原的免疫活性。如碘標(biāo)記化合物以單碘標(biāo)記為宜。精選ppt(2)比放射性或稱放射性比度,是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，64(3)免疫活性是指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。以檢查標(biāo)記后免疫活性損失情況。方法是加10倍量抗體和標(biāo)記抗原反應(yīng)，測(cè)定結(jié)合部分(B)和游離部分(F)的放射強(qiáng)度，算出B/B+F的百分率，正常應(yīng)在80%以上，值越大，說明抗原損傷越少;如果值過小，標(biāo)記抗原應(yīng)重新強(qiáng)化或廢棄重做。精選ppt(3)免疫活性是指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度65二、抗體選用抗體也是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成試劑之一，常采用含特異性抗體的抗血清和小鼠雜交瘤單克隆抗體。抗體的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性?？贵w的質(zhì)量指標(biāo)主要有親和常數(shù)、特異性和效價(jià)。精選ppt二、抗體選用抗體也是放射免疫技術(shù)試劑盒主要組成試劑之一，常采66三、免疫復(fù)合物分離技術(shù)在放射免疫技術(shù)的反應(yīng)系統(tǒng)中，因抗原和抗體含量極微，所形成的免疫復(fù)合物不發(fā)生沉淀。必須采用適當(dāng)方法將反應(yīng)平衡時(shí)※Ag-Ab復(fù)合物（B）和游離※Ag（F）分開，才能分別測(cè)量其放射性。精選ppt三、免疫復(fù)合物分離技術(shù)在放射免疫技術(shù)的反應(yīng)系統(tǒng)中，因抗原和抗67理想的分離技術(shù)符合條件①簡(jiǎn)便易行，適于大批量樣品分析;②分離效果完全、快速，非特異結(jié)合低;③試劑來源容易、價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、可長(zhǎng)期保存;④不受外界因素和樣品中其他組分的干擾，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)抗原分離效果相同;⑤適合自動(dòng)化分析的要求。

目前尚無完全滿足上述條件的分離方法精選ppt理想的分離技術(shù)符合條件①簡(jiǎn)便易行，適于大批量樣品分析;精選p68免疫復(fù)合物分離常用方法1.吸附法是用吸附劑(如活性炭)吸附小分子的游離。2.化學(xué)沉淀法RIA反應(yīng)條件接近抗體的等電點(diǎn)，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白質(zhì)沉淀劑可破壞蛋白分子表面的水化層而使蛋白沉淀，從而分離B與F。3.雙抗體法利用抗抗體和※Ag-Ab復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成更大免疫復(fù)合物，離心沉淀即可分離B與F。精選ppt免疫復(fù)合物分離常用方法1.吸附法是用吸附劑(如活性炭)694．PR試劑將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各自的不足，分離效果好，適用范圍廣。5．固相分離法將抗體或抗原結(jié)合在固相載體（如磁顆粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗體或抗原分離B和F，具有簡(jiǎn)便、快速、適合于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的液相分離方法。精選ppt4．PR試劑將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各70核射線探測(cè)儀器由射線探測(cè)器和后續(xù)電子學(xué)單元兩大部分組成。核射線探測(cè)器是個(gè)能量轉(zhuǎn)化器，其檢測(cè)原理是當(dāng)射線作用于閃爍體，閃爍體吸收了射線的能量而引起閃爍體中的原子或分子激發(fā)，當(dāng)受激的原子或分子退激時(shí)，則發(fā)出光子進(jìn)入光電倍增管光陰極，轉(zhuǎn)換為光電子，光電子在光電倍增管電場(chǎng)作用下到達(dá)陽極，形成電脈沖。轉(zhuǎn)換模式是放射能→光能→電能→脈沖。精選ppt核射線探測(cè)儀器由射線探測(cè)器和后續(xù)電子學(xué)單元兩大部分組成。核射71第二節(jié)放射免疫分析該項(xiàng)技術(shù)是由1959年美國Berson和Yalow首先以放射性碘標(biāo)記胰島素測(cè)定血清中胰島素含量而建立起來的。開創(chuàng)了體外微量物質(zhì)檢測(cè)新紀(jì)元。于1977年獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。精選ppt第二節(jié)放射免疫分析該項(xiàng)技術(shù)是由1959年美國Berson和72一、原理其基本原理是抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，即待測(cè)抗原(Ag)和定量的標(biāo)記抗原(※Ag)與限量的抗體(Ab)進(jìn)行特異性反應(yīng)，其中Ab的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)小于Ag＋※Ag的結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)，則Ag和※Ag與Ab發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。如待測(cè)Ag含量多，則Ag-Ab復(fù)合物形成得多，※Ag-Ab復(fù)合物(B)形成少，游離的※Ag（F）多，反之亦然（圖19-1）。精選ppt一、原理其基本原理是抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，即待測(cè)73精選ppt精選ppt74二、技術(shù)要點(diǎn)1.抗原抗體反應(yīng)為待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。根據(jù)加樣順序不同，RIA可分為2個(gè)類型：①平衡法將Ag和※Ag同時(shí)與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離※Ag-Ab和※Ag，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差；②順序飽和法先將待測(cè)Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入※Ag，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。精選ppt二、技術(shù)要點(diǎn)1.抗原抗體反應(yīng)為待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的752.B/F分離B/F分離技術(shù)如第一節(jié)所述，具體操作中應(yīng)注意B/F分離好壞是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，為了使測(cè)量結(jié)果能代表反應(yīng)結(jié)果，要求分離方法能使B和F得以完全有效地分開，且要求分離不破壞已經(jīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的免疫反應(yīng)。因此常常要求提高分離速度、降低操作溫度、縮短分離劑和反應(yīng)系統(tǒng)的接觸時(shí)間等。精選ppt2.B/F分離B/F分離技術(shù)如第一節(jié)所述，具體操作763.放射性強(qiáng)度測(cè)定根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計(jì)數(shù)儀（β型）和γ計(jì)數(shù)儀（γ型），測(cè)定各待測(cè)標(biāo)本和備抗原標(biāo)準(zhǔn)品的※Ag-Ab放射性強(qiáng)度(B)或游離※Ag放射性強(qiáng)度(F)。精選ppt3.放射性強(qiáng)度測(cè)定根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計(jì)數(shù)774.數(shù)據(jù)處理(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)為放射性反應(yīng)參數(shù)，有各種表示方式，可選用B/F、B/T、F/B、B/B0等比值或B或F的cpm值，常選用B/B0比值作為參數(shù)。橫坐標(biāo)為已知測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，以算術(shù)數(shù)或?qū)?shù)表示。放射免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線為雙曲線(圖19-2)精選ppt4.數(shù)據(jù)處理(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)78RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型

（1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計(jì)數(shù)（cpm）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為縱坐標(biāo)，曲線呈反S型；(3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，logitB/B0為縱坐標(biāo)，