復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的實(shí)驗(yàn)與臨床研究

復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的實(shí)驗(yàn)與臨床研究

作者：朱浩然竇志華羅琳張兵李民達(dá)坤林【摘要】

目的考察復(fù)方五仁醇膠囊對(duì)損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)慢性肝炎的治療效果。方法以SD大鼠為供體制備復(fù)方五仁醇膠囊含藥血清，CCl4誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞損傷模型，采用血清藥理學(xué)方法考察含藥血清對(duì)損傷肝細(xì)胞增值（MTT法）和培養(yǎng)上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的影響；將446例慢性乙型肝炎患者隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組，以臨床癥狀、體征、肝功能為主要指標(biāo)，考察復(fù)方五仁醇膠囊的治療效果。結(jié)果與模型組比較，含藥血清組MTT值明顯升高，上清液中ALT均顯著下降，體系中加入10%含藥血清效果最佳；治療組、對(duì)照組臨床癥狀、體征及肝功能指標(biāo)均明顯得到改善，復(fù)方五仁醇膠囊的療效優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥護(hù)肝片。結(jié)論復(fù)方五仁醇膠囊對(duì)肝細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用，對(duì)慢性肝炎有較好治療作用?！娟P(guān)鍵詞】

復(fù)方五仁醇膠囊；保肝作用；血清藥理學(xué)；臨床觀察Abstract：ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftheCompoundWurenchunCapsula(CWC)oninjuredhepatocytepatientswithchronichepatitis.MethodsHepatocyteinjurymodelwasinducedbyCCl4andtheinjuredhepatocyteswereincubatedwithratserumobtainedafteroraladministrationofCWC.Thehepatocyteproliferationrate(MTT)andalanineaminotransferase(ALT)concentrationincellculturemediumweredetermined.446patientswithchronichepatitisweredividedintoexperimentalgroup(treatedbyCWC)andcontrolgroup(treatedbyHuGanTablets,HGT）randomly.Withphysicalsign,symptomandhepaticfunctionasmainindices,thetherapeuticeffectofCWConpatientswithchronichepatitiswasevaluated.ResultsSerumcontainingdrugcouldelevateMTTincrementanddepressALTsignificantly,withthebesteffectataconcentrationof10%.Physicalsign,symptomandliverfunctionofpatientsinexperimentalandcontrolgroupswereallimprovedaftertreatment,andthetherapeuticeffectofCWCwassurpassedtheoneofHGT.ConclusionCWChasanobviousprotectiveeffectoninjuredhepatocyteandpossessesanexactlytherapeuticeffectforchronichepatitis.Keywords：CompoundWurenchunCapsula(CWC);

Liver-protectiveeffect;

Serumpharmacology;

Clinicalobservation

復(fù)方五仁醇膠囊是我院經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)而研制的科研制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：蘇藥制字Z04001984），處方由五味子、柴胡、葉下珠、三七4味中藥組成，具有清熱解毒、疏肝活血、補(bǔ)益肝腎作用［1］。初步研究結(jié)果表明，該制劑能改善慢性肝炎患者癥狀和體征、降低血清轉(zhuǎn)氨酶［2］。為了進(jìn)一步深化開(kāi)發(fā)和推廣應(yīng)用，近年來(lái)我們?cè)谑∈卸囗?xiàng)科研計(jì)劃的資助下對(duì)復(fù)方五仁醇膠囊進(jìn)行了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)理、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等較為全面的研究［3～8］。現(xiàn)將有關(guān)藥效及臨床擴(kuò)大研究的結(jié)果報(bào)道如下。1

資料與方法1.1

實(shí)驗(yàn)研究1.1.1

材料SD大鼠［SPF級(jí)，體重（230±19.8）g，♀♂兼用，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYKX（蘇）2002-0022］；羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，香港FARCO公司，批號(hào)L0024LJ0101M21）；乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA，美國(guó)AMRESCO公司分裝,批號(hào)0732）；膠原酶IV（美國(guó)Sigma公司分裝,批號(hào)0406）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司分裝,批號(hào)030702）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)1255136）；新西蘭新生小牛血清（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)DPEO166）；溴化3-（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基四氮唑藍(lán)（MTT，AMRESCO公司,批號(hào)1324B37）；四氯化碳（宜興市第二化學(xué)試劑廠，批號(hào)20010608）；復(fù)方五仁醇膠囊（本院自制，批號(hào)050505）；HERAcellCO2培養(yǎng)箱（德國(guó)GmbH公司）；BT-200B數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠）；BIO-TEK340酶標(biāo)儀（美國(guó)Sigma公司）；日立7170全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。1.1.2

含藥血清、空白血清的制備SD大鼠4只，禁食12h(自由飲水)，稱重，每天按照4.50ml/kg（相當(dāng)于成人臨床等效劑量的10倍）分兩次灌胃復(fù)方五仁醇膠囊甲醇提取物的0.5%CMC-Na混懸液，連續(xù)給藥3d。末次給藥后2h以3%戊巴比妥鈉1.5ml/kg腹腔注射麻醉，頸總動(dòng)脈取血，置冰箱4℃冷藏過(guò)夜，分離血清，即為含藥血清。SD大鼠每天0.5%CMC-Na4.50ml/kg灌胃，同法制備空白血清。1.1.3

肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)大鼠用3％戊巴比妥鈉1.5ml/kg腹腔注射麻醉，門靜脈插管，以37℃無(wú)鈣灌流液（組成：HBSS500ml，HEPES1.19g，EGTA0.095g，NaHCO30.175g，pH7.4）灌流約20min后，換用37℃的通氧膠原酶灌流液（組成：HBSS100ml，HEPES0.238g，CaCl20.07g，膠原酶IV0.075g，胰蛋白酶0.01g，NaHCO30.035g，pH7.4）繼續(xù)灌流10min后取下肝臟，剪開(kāi)肝包膜，將肝細(xì)胞懸液過(guò)濾清洗后懸浮于含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力達(dá)90％，以1×105/cm2接種于96孔及48孔板中，置CO2培養(yǎng)箱（5％CO2）37℃培養(yǎng)。1.1.4

肝細(xì)胞的分組與處理培養(yǎng)24h后，吸棄上清液，隨機(jī)分成6組（正常組、模型組及5%，10%，20%，40%含藥血清組），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。模型組和各含藥血清組更換為加入CCl410mmol/L的DMEM培養(yǎng)液，正常組相應(yīng)加入DMEM培養(yǎng)基，正常組和模型組加入終濃度為10％的空白血清，5%，10%，20%，40%含藥血清組加入含藥血清，使終濃度分別為5%，10%，20%和40%。作用24h后，收集48孔板中培養(yǎng)上清液檢測(cè)ALT。96孔板中每孔加入5mg/ml的MTT液20μl，繼續(xù)孵育4h，每孔再加入DMSO200μl，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀于檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)655nm測(cè)定各孔吸光度（A）。1.1.5

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，使用wstata7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，樣本數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和Scheffe檢驗(yàn)，以P0.05為顯著性判斷界值。1.2

臨床研究1.2.1

病例選擇與分組隨機(jī)選取446例慢性乙型肝炎患者，均為我院2001～2006年門診及住院患者，其中男性328例，女性118例；年齡16～69歲，平均37.4歲；病程1～6年。排除合并其他肝炎病毒感染，無(wú)心、腦、腎、內(nèi)分泌等并發(fā)癥。診斷符合2000年西安全國(guó)病毒性肝炎學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇HBsAg（+）、HBeAg（+）或HBV-DNA（+）、ALT80～200U/L、SB35.6μmol/L。病例隨機(jī)分成兩組，其中治療組264例，對(duì)照組182例。兩組在年齡性別病情及病程方面具有可比性(P0.05)。見(jiàn)表1。表1

兩組患者一般臨床資料比較（略）1.2.2

治療方法治療組應(yīng)用復(fù)方五仁醇膠囊口服，4粒/次，3次/d。對(duì)照組給予護(hù)肝片口服，4片/次，3次/d。療程均為2～4周。1.2.3

觀察指標(biāo)臨床癥狀、體征的變化；肝功能(主要觀察ALT)指標(biāo)變化；不良反應(yīng)。1.2.4

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用χ2檢驗(yàn)和u檢驗(yàn)。

2

結(jié)果2.1

各組含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖和上清液中ALT的影響與正常組比較，模型組MTT值顯著下降（P0.01），上清液中ALT顯著升高（P0.01），說(shuō)明造模成功；與模型組比較，各濃度含藥血清組MTT值均明顯升高（P0.01或P0.05），上清液中ALT均顯著下降（P0.01）；與10%含藥血清組比較，20%，40%含藥血清組MTT值明顯下降（P0.01或P0.05），5%含藥血清組無(wú)顯著差異（P0.05），5%，20%，40%含藥血清組上清液中ALT均明顯升高（P0.01或P0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明體系中加入10%的含藥血清效果最佳。見(jiàn)表2。表2

肝細(xì)胞增殖及培養(yǎng)上清液中ALT測(cè)定結(jié)果（略）與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與10％含藥血清組比較，dP＜0.05，eP＜0.01；n=62.2

臨床癥狀、體征變化乏力、納差的消失率治療組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P0.05）；肝區(qū)疼痛、肝脾腫大消失率，治療組明顯優(yōu)于對(duì)照組（P0.01）。見(jiàn)表3。表3

臨床癥狀體征消失率比較（略）2.3

肝功能變化治療后兩組肝功能ALT均顯著下降（P0.01）；治療組明顯優(yōu)于對(duì)照組（P0.05）。見(jiàn)表4。表4

兩組患者治療前后ALT變化情況（略）2.4

不良反應(yīng)治療組極少數(shù)患者服藥后出現(xiàn)胃部不適，減量或停藥后消失，無(wú)其他不良反應(yīng)。對(duì)照組未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。3

討論

本次藥效研究采用的是體外進(jìn)行的血清藥理學(xué)方法，該方法由日本學(xué)者首先提出［9］。血清藥理學(xué)研究方法既能防止中藥粗制劑本身理化性質(zhì)對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的干擾，又能反映中藥在胃腸道消化吸收，再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，最后產(chǎn)生藥理效應(yīng)的過(guò)程，因此作為中藥研究的新思路和新方法而備受推崇［10］。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體系中加入5%～40%的含藥血清均具有一定的保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷的作用，但與10%含藥血清組比較，20%，40%含藥血清組MTT值均明顯下降（P0.01或P0.05），5%含藥血清組雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但也有下降趨勢(shì)，5%，20%，40%含藥血清組ALT均顯著升高（P0.01），說(shuō)明在一定范圍內(nèi)體系中含藥血清濃度與藥效強(qiáng)度之間具有一定量-效關(guān)系，但血清濃度超過(guò)一定范圍藥效反而降低，這可能是由于血清濃度過(guò)高又會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性［11］。

臨床觀察結(jié)果顯示，復(fù)方五仁醇膠囊對(duì)慢性肝炎的治療效果，在肝區(qū)疼痛、肝脾腫大等體征和癥狀的消失以及ALT下降等方面，均明顯優(yōu)于治療前（P0.01），也明顯優(yōu)于對(duì)照藥護(hù)肝片（P0.05）。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性病毒性肝炎的主要病因是濕熱疫毒導(dǎo)致肝脾腎臟腑功能失調(diào)、陰陽(yáng)氣血虧損。虛者脾虛、肝腎陰虛，實(shí)者濕熱、瘀毒多見(jiàn)，為虛實(shí)夾雜之癥。臨床治療應(yīng)以補(bǔ)益肝腎、疏肝健脾、活血化瘀、解毒扶正為主法。目前市場(chǎng)上以護(hù)肝降酶為主要功效的治療慢性病毒性肝炎的中成藥品種不少，但從病因病機(jī)出發(fā)兼顧以上幾方面治法的不多，特別是兼顧活血化瘀的更少。復(fù)方五仁醇膠囊在重用五味子護(hù)肝降酶的同時(shí)，配伍了葉下珠清熱解毒、柴胡疏肝理氣；三七活血化瘀。諸藥合用共奏標(biāo)本兼治之效，可能是其療效突出的主要原因之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

［1］竇志華，施忠，李偉紅，等．復(fù)方五仁醇膠囊的研制［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（10）：953，956

［2］達(dá)坤林,王陸軍,張兵，等．復(fù)方五仁醇膠囊治療慢性乙型肝炎78例臨床療效觀察［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（5）：798

［3］竇志華，丁安偉，王陸軍，等．復(fù)方五仁醇膠囊含藥血清