轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定課件

轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定1為什么要進行轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定？在DNA體外重組實驗中，外源DNA片段與載體DNA的連接反應物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，再加上重組率和轉(zhuǎn)化率的不理想，因此必須通過篩選和鑒定來區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、期望重組子與非期望重組子。轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細胞。非轉(zhuǎn)化子：為接納載體或重組分子的非轉(zhuǎn)化細胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。非重組子：僅含有空載載體分子的轉(zhuǎn)化子。期望重組子：含有目的基因的重組子。非期望重組子：不含目的基因的重組子。為什么要進行轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定？2轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子三者的關(guān)系轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子三者的關(guān)系3轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定方法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子基于克隆片段序列的篩選與鑒定由于基于載體遺傳的篩選與鑒定程序不能區(qū)分期望重組子與非期望重組子。在大多數(shù)情況下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根據(jù)克隆片段序列設計的篩選與鑒定程序具有廣泛的實用性基于外源基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定如果克隆在受體細胞中的外源基因編碼產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則可通過檢測這種蛋白質(zhì)的生物功能或結(jié)構(gòu)來篩選和鑒定期望重組子轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定方法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定4基于載體遺傳標記的篩選與鑒定抗藥性篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法顯色模板篩選法噬菌斑篩選法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定抗藥性篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法顯色5ROPROISalIBamH

ITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHind

IIIHind

IIBalIAprpBR3224363bpori可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。非重組子：Apr、Tcr

重組子：Aps、Tcs

抗藥性篩選法將外源DNA片段插入BamHI、SalI位點ROPROISalIBamHITcrPvuIPstI6將轉(zhuǎn)化液涂布含Ap的平板Ap再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上Ap+Tc影印挑選在Ap平板上生長、但在Ap+Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子為重組子基本操作：將轉(zhuǎn)化液涂布含Ap的平板Ap再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有7營養(yǎng)缺陷性篩選法基本原理：

營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子。營養(yǎng)缺陷性篩選法基本原理：營養(yǎng)缺陷型篩選法8Lys?Lys+Lys?Lys+基本原理圖示：Lys?Lys+Lys?Lys+基本原理圖示：9常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：

哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的合成途徑：用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動物細胞的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應的受體細胞則選擇tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的10顯色模型篩選法基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等。顯色模型篩選法基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與11顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落

顯色篩選法的基本操作：pUC18AprlacZ'oriAp12噬菌斑篩選法重組子非重組子1.取代型載體噬菌斑中的λ噬菌體即為重組子。2.插入型載體根據(jù)載體上的標記基因篩選。（如：lacZ′）噬菌斑篩選法重組子非重組子1.取代型載體噬菌斑中的λ噬13基于克隆片段序列的篩選與鑒定PCR鑒定法菌落原位雜交法限制性酶切圖譜法亞克隆法DNA序列測定法基于克隆片段序列的篩選與鑒定PCR鑒定法菌落原位雜交法限制性14PCR鑒定法

PCR技術(shù)的兩大主要用途為目的基因的獲得和DNA特定序列的檢測。根據(jù)引物互補區(qū)域的不同，PCR技術(shù)即可用于區(qū)分重組子與非重組子，也能鑒定期望重組子與非期望重組子，甚至還能探測目的基因或DNA片段是否整合在受體細胞的基因組上。上述PCR鑒定程序一般需要將篩選平板上的單菌落分別挑出進一步培養(yǎng)，因此不太適用于成千上萬個轉(zhuǎn)化子的鑒定。PCR鑒定法PCR技術(shù)的兩大主要用途為目的基因的獲得和15轉(zhuǎn)化子重組子非期望重組子轉(zhuǎn)化子期望重組子期望重組子受體基因組非整合子整合子工作原理：轉(zhuǎn)化子重組子非期望重組子轉(zhuǎn)化子期望重組子期16菌落原位雜交法菌落原位雜交法（又稱探針原位雜交法）能從成千上萬個轉(zhuǎn)化子中迅速檢測出期望重組子，其前提條件是必須擁有與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列。根據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性的雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位檢測。菌落原位雜交法菌落原位雜交法（又稱探針原位雜交法）能從17原位雜交的操作程序原位雜交的操作程序18探針的制備探針的長度以及與目的基因之間的序列同源性是雜交實驗成敗的關(guān)鍵最佳的探針長度范圍為100~1000bp探針內(nèi)部不能含有大面積的互補序列，會直接影響探針與DNA靶序列的雜交。探針的獲取方法：

1、目的基因的同源序列2、cDNA3、人工合成探針的制備探針的長度以及與目的基因之間的序列同源性是雜交19探針的標記探針在雜交后是通過其分子中的放射性同位素或熒光基團進行定位示蹤的，放射性的強弱直接關(guān)系到雜交反應的靈敏度。單位長度探針標記的同位素越多，雜交反應靈敏度就越高。探針標記方法：

1、5＇端標記法。2、反轉(zhuǎn)錄標記法。3、缺刻前移標記。4、ABC標記法。探針的標記探針在雜交后是通過其分子中的放射性同位素或熒光205＇端標記法PPDTT、Mg2+、[γ-32P]dATP、過量ADPT4-PNP酶PP方法1PP堿性磷酸酶PP方法2T4-PNP酶變性制備單鏈探針5＇端標記法PPDTT、Mg2+、T4-PNP酶PP方法121缺刻前移標記法5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇DNaseIDNA聚合酶IdNTP、[α-32P]dATP變性缺刻前移標記法5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇DNa22限制性酶切圖譜法

所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入23全酶解圖譜法pUC18

2.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子全酶解圖譜法pUC182.7kbHindIIISphI24pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子如果外源DNA片段插pUC18的SphI位點處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟，因為SphI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及SphI的1/50

pUC182.7kbHindIIISphIPstI25pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbpUC182.7kbHindIIISphIPstI26pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBE4.0kb2.0kb2.0kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子對圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現(xiàn)2.0kb和2.7kb兩條帶子，實際上2.0kb的條帶中含有兩種不同的分子2.7kb2.0kbEpUC182.7kbHindIIISphIPstI27部分酶解圖譜法2.2kbPstIEcoRIBamHIBBE4.4kb1.21.8kbEB0.60.8該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：BamHI全酶解：0.60.81.83.4kbBamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb其中，1.2kb片段的存在表明該片段位于一端BamHI部分酶解：1.42.64.0kb其中，1.4kb的片段必為0.6kb和0.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；同理，2.6kb的片段必為0.8kb和1.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，4.0kb的片段必為0.6kb和3.4kb兩片段，表明兩者是連在一起的部分酶解圖譜法2.2kbPstIEcoRIBamH28DNA序列測定法DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應的進程中，通過位點特異性終止測定。DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：DNA鏈聚合反應時的定點隨機中斷（ddNTP）聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600bp/601bp）電腦自動檢測、記錄、編輯程序用于DNA測序的專一性試劑盒（Kit）DNA序列測定法DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要29雙脫氧末端終止測序法的基本操作：

A

C

G

T

ssDNAssDNAssDNAssDNAPrimer

Primer

Primer

Primer

KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA

G

T

C

DNA聚合反應聚丙烯酰胺凝膠電泳雙脫氧末端終止測序法的基本操作：ACGTssDNA30雙脫氧末端終止測序法的基本反應：

KlenowOH3'5'PTdNTP+

ddATP

TTTTTOH3'5'PA

G

T

C

GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA雙脫氧末端終止測序法的基本反應：KlenowOH3'5'31基于外源基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定蛋白質(zhì)生物功能檢測法放射免疫原位檢測法蛋白凝膠電泳檢測法基于外源基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定蛋白質(zhì)生物功能檢測法放射免疫32蛋白質(zhì)生物功能檢測法某些外源基因編碼具有特殊生物功能的酶類或活性蛋白（如α-淀粉酶、葡聚糖內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、抗生素抗性蛋白等），設計簡單靈敏的平板模型，可以迅速篩選出克隆了上述蛋白編碼基因的期望重組子。重組子利用淀粉酶基因表達產(chǎn)物檢測重組子蛋白質(zhì)生物功能檢測法某些外源基因編碼具有特殊生物功能的酶33放射免疫原位檢測法基本原理及操作程序與菌落原位雜交法非常相似，只不過后者是用核酸探針通過堿基互補的形式特異性雜交目的DNA序列，而前者利用抗體通過特異性免疫反應搜尋目標蛋白質(zhì)。因此使用放射免疫原位檢測法篩選鑒定期望重組子的前提條件是外源基因在受體細胞中必須表達出具有正確空間構(gòu)象的蛋白產(chǎn)物，同時具備與之對應的特異性抗體。放射免疫原位檢測法基本原理及操作程序與菌34蛋白凝膠電泳檢測法對于那些生物功能難以檢測的外源基因編碼產(chǎn)物，手頭又沒有現(xiàn)成的抗體做蛋白免疫原位分析實驗，可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對重組克隆進行篩選鑒定。表達產(chǎn)物非重組子重組子蛋白凝膠電泳檢測法對于那些生物功能難以檢測的外源基因編35轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定36為什么要進行轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定？在DNA體外重組實驗中，外源DNA片段與載體DNA的連接反應物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，再加上重組率和轉(zhuǎn)化率的不理想，因此必須通過篩選和鑒定來區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、期望重組子與非期望重組子。轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細胞。非轉(zhuǎn)化子：為接納載體或重組分子的非轉(zhuǎn)化細胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。非重組子：僅含有空載載體分子的轉(zhuǎn)化子。期望重組子：含有目的基因的重組子。非期望重組子：不含目的基因的重組子。為什么要進行轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定？37轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子三者的關(guān)系轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子三者的關(guān)系38轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定方法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子基于克隆片段序列的篩選與鑒定由于基于載體遺傳的篩選與鑒定程序不能區(qū)分期望重組子與非期望重組子。在大多數(shù)情況下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根據(jù)克隆片段序列設計的篩選與鑒定程序具有廣泛的實用性基于外源基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定如果克隆在受體細胞中的外源基因編碼產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則可通過檢測這種蛋白質(zhì)的生物功能或結(jié)構(gòu)來篩選和鑒定期望重組子轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定方法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定39基于載體遺傳標記的篩選與鑒定抗藥性篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法顯色模板篩選法噬菌斑篩選法基于載體遺傳標記的篩選與鑒定抗藥性篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法顯色40ROPROISalIBamH

ITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHind

IIIHind

IIBalIAprpBR3224363bpori可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。非重組子：Apr、Tcr

重組子：Aps、Tcs

抗藥性篩選法將外源DNA片段插入BamHI、SalI位點ROPROISalIBamHITcrPvuIPstI41將轉(zhuǎn)化液涂布含Ap的平板Ap再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上Ap+Tc影印挑選在Ap平板上生長、但在Ap+Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子為重組子基本操作：將轉(zhuǎn)化液涂布含Ap的平板Ap再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有42營養(yǎng)缺陷性篩選法基本原理：

營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子。營養(yǎng)缺陷性篩選法基本原理：營養(yǎng)缺陷型篩選法43Lys?Lys+Lys?Lys+基本原理圖示：Lys?Lys+Lys?Lys+基本原理圖示：44常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：

哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的合成途徑：用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動物細胞的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應的受體細胞則選擇tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的45顯色模型篩選法基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等。顯色模型篩選法基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與46顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落

顯色篩選法的基本操作：pUC18AprlacZ'oriAp47噬菌斑篩選法重組子非重組子1.取代型載體噬菌斑中的λ噬菌體即為重組子。2.插入型載體根據(jù)載體上的標記基因篩選。（如：lacZ′）噬菌斑篩選法重組子非重組子1.取代型載體噬菌斑中的λ噬48基于克隆片段序列的篩選與鑒定PCR鑒定法菌落原位雜交法限制性酶切圖譜法亞克隆法DNA序列測定法基于克隆片段序列的篩選與鑒定PCR鑒定法菌落原位雜交法限制性49PCR鑒定法

PCR技術(shù)的兩大主要用途為目的基因的獲得和DNA特定序列的檢測。根據(jù)引物互補區(qū)域的不同，PCR技術(shù)即可用于區(qū)分重組子與非重組子，也能鑒定期望重組子與非期望重組子，甚至還能探測目的基因或DNA片段是否整合在受體細胞的基因組上。上述PCR鑒定程序一般需要將篩選平板上的單菌落分別挑出進一步培養(yǎng)，因此不太適用于成千上萬個轉(zhuǎn)化子的鑒定。PCR鑒定法PCR技術(shù)的兩大主要用途為目的基因的獲得和50轉(zhuǎn)化子重組子非期望重組子轉(zhuǎn)化子期望重組子期望重組子受體基因組非整合子整合子工作原理：轉(zhuǎn)化子重組子非期望重組子轉(zhuǎn)化子期望重組子期51菌落原位雜交法菌落原位雜交法（又稱探針原位雜交法）能從成千上萬個轉(zhuǎn)化子中迅速檢測出期望重組子，其前提條件是必須擁有與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列。根據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性的雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位檢測。菌落原位雜交法菌落原位雜交法（又稱探針原位雜交法）能從52原位雜交的操作程序原位雜交的操作程序53探針的制備探針的長度以及與目的基因之間的序列同源性是雜交實驗成敗的關(guān)鍵最佳的探針長度范圍為100~1000bp探針內(nèi)部不能含有大面積的互補序列，會直接影響探針與DNA靶序列的雜交。探針的獲取方法：

1、目的基因的同源序列2、cDNA3、人工合成探針的制備探針的長度以及與目的基因之間的序列同源性是雜交54探針的標記探針在雜交后是通過其分子中的放射性同位素或熒光基團進行定位示蹤的，放射性的強弱直接關(guān)系到雜交反應的靈敏度。單位長度探針標記的同位素越多，雜交反應靈敏度就越高。探針標記方法：

1、5＇端標記法。2、反轉(zhuǎn)錄標記法。3、缺刻前移標記。4、ABC標記法。探針的標記探針在雜交后是通過其分子中的放射性同位素或熒光555＇端標記法PPDTT、Mg2+、[γ-32P]dATP、過量ADPT4-PNP酶PP方法1PP堿性磷酸酶PP方法2T4-PNP酶變性制備單鏈探針5＇端標記法PPDTT、Mg2+、T4-PNP酶PP方法156缺刻前移標記法5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇DNaseIDNA聚合酶IdNTP、[α-32P]dATP變性缺刻前移標記法5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇5＇DNa57限制性酶切圖譜法

所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入58全酶解圖譜法pUC18

2.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子全酶解圖譜法pUC182.7kbHindIIISphI59pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子如果外源DNA片段插pUC18的SphI位點處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟，因為SphI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及SphI的1/50

pUC182.7kbHindIIISphIPstI60pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbpUC182.7kbHindIIISphIPstI61pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBE4.0kb2.0kb2.0kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子對圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現(xiàn)2.0kb和2.7kb兩條帶子，實際上2.0kb的條帶中含有兩種不同的分子2.7kb2.0kbEpUC182.7kbHindIIISphIPstI62部分酶解圖譜法2.2kbPstIEcoRIBamHIBBE4.4kb1.21.8kbEB0.60.8該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：BamHI全酶解：0.60.81.83.4kbBamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb其中，1.2kb片段的存在表明該片段位于一端BamHI部分酶解：1.42.64.0kb其中，1.4kb的片段必為0.6kb和0.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；同理，2.6kb的片段必為0.8kb和1.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，4.0kb的片段必為0.6kb和3.4kb兩片段，表明兩者是連在一起的部分酶解圖譜法2.2kbPstIEcoRIBamH63D