瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

-血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別黔東南州疾控中心檢驗(yàn)科潘雪雪

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

-血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別黔東南州1寄生人體的四種瘧原蟲間日瘧原蟲[P.vivax，P.v]惡性瘧原蟲[P．Falciparum,P.f]三日瘧原蟲[P．Malariae,P.m]卵形瘧原蟲[P．Ovale,P.o]我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另二種少見，近年偶見國外輸入病例。其它瘧原蟲諾氏瘧原蟲(Plasmodiumnowlesi)寄生人體的四種瘧原蟲間日瘧原蟲[P.vivax，P.v]2內(nèi)容提綱血片制作與染色瘧原蟲計(jì)數(shù)瘧原蟲的基本形態(tài)特征內(nèi)容提綱血片制作與染色3血片制作第一步：載玻片的清洗用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于95%的乙醇中1小時以上用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。血片制作第一步：載玻片的清洗4第二步：患都信息的核實(shí)采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和年齡并在玻片的右側(cè)編號第二步：患都信息的核實(shí)采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和5第三步：采集血樣采血部位：耳垂或無名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。第三步：采集血樣采血部位：耳垂或無名指，6厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜第四步：血片制作厚血膜薄血膜厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火7制片過程圖示標(biāo)簽制片過程圖示標(biāo)簽8標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過多或過少●薄血膜平整,無皺折和空泡.顯微鏡下紅細(xì)胞單層排列標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過多或過少9血片的制作×××××√血片的制作×××××√10血片制作影響因素載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)胞均勻分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-10個白細(xì)胞為宜；血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜；制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果．血片制作影響因素載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)11血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法

1.染色原液配制2.門診快染、慢染

3.成批染色和溶血染色●

瑞氏染色法WHO推薦使用吉氏染色法血片染色兩種染色方法:12吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(純)250ml甲醇

(純)250ml●吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好?！裾麄€染色液配制時間不能少于5個小時吉氏染液(原液)的配置吉氏染粉(AzureB13血片的染色染色用水和沖洗用水配制常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水用pH7.0～pH7.2的緩沖液。血片的染色染色用水和沖洗用水配制14血片染色薄血膜的固定厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要點(diǎn)：甲醇不能觸碰到厚血膜）血片染色薄血膜的固定15操作1（快染）量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。操作2(慢染)量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。血片染色操作1（快染）量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)16將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，染色30分鐘。（如染液稀釋液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。成批血片染色將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染成批血片染色17厚血膜溶血染色放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進(jìn)行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。厚血膜溶血染色放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固18質(zhì)量好的染色

顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色，薄血膜平整，紅細(xì)胞單層排列

如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量好的染色外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)19配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；染液稀釋后使用時間：原液必須臨用時稀釋，隨配隨用；染液的稀釋濃度；染色時間。染色質(zhì)量影響因素配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；染20用水過酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來；用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍(lán)色，致使R的胞漿難以辨論。染色稀釋用水:PH7.0-7.2清潔水。染色質(zhì)量影響因素用水過酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來；染色稀釋用水:21固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；血膜在制備后應(yīng)盡量能在當(dāng)天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時,放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。染色質(zhì)量影響因素固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；染色質(zhì)量影響因素22瘧原蟲鏡檢●瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)●瘧原蟲密度計(jì)數(shù)方法●人體四種瘧原蟲的形態(tài)特征瘧原蟲鏡檢●瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)23●當(dāng)前分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被認(rèn)為是不可替代的確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”

●顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲實(shí)體并鑒別4種人體瘧原蟲原蟲鏡檢---金標(biāo)準(zhǔn)●當(dāng)前分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被24瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)25瘧原蟲密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲密度的三種方法：●白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法(厚血膜WHO)

優(yōu)點(diǎn)：可作為定性和定量分析●

半定量計(jì)數(shù)法(厚血膜)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便缺點(diǎn)：只能定性，不宜作為定量分析●

紅細(xì)胞感染密度計(jì)算法(薄血膜)瘧原蟲密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲密度的三種方法：26白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（200個白細(xì)胞中小于100個瘧原蟲），可增加白細(xì)胞，計(jì)數(shù)500個。密度單位:原蟲數(shù)/μl計(jì)算公式：瘧原蟲數(shù)÷計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)×患者每微升血白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血。如果不知患者的白細(xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國際標(biāo)準(zhǔn))。白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細(xì)27白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法從血膜的左上角開始，橫向。計(jì)數(shù)1個視野后，每次間隔5個視野,再計(jì)數(shù)。厚血膜白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法從血膜的左上角開始，橫向。厚血膜28×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計(jì)數(shù)的視野如果該視野無原蟲，則計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)

●看到第一個原蟲開始計(jì)數(shù)

白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)方法×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計(jì)數(shù)的視野白29白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法●例如計(jì)數(shù)200WBC中有135個瘧原蟲，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個白細(xì)胞計(jì)數(shù),由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲密度為：135（計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)）÷200（計(jì)數(shù)的白細(xì)胞）x8000（每微升血白細(xì)胞數(shù)）=5400/μl答：該患者的瘧原蟲密度為5400/μl。白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法●例如計(jì)數(shù)200WBC中有135個瘧原30用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野1～5個蟲，記錄“＋”4.平均每個視野6～10個蟲，記錄“++”5.平均每個視野11～100個蟲，記錄“+++”6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“++++”。

如：PvR+T++S5G少這種方法簡便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。半定量計(jì)數(shù)法用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密31如何確定瘧原蟲血片為陰性●

檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲●最少檢查100個厚血膜視野未查見瘧原蟲（臨床病人）如何確定瘧原蟲血片為陰性●檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲32人體四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢人體四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢33感染人的瘧原蟲有四種:

惡性瘧原蟲P.falciparum間日瘧原蟲P.vivax三日瘧原蟲P.malariae

卵形瘧原蟲P.ovale

感染人的瘧原蟲有四種:惡性瘧原蟲P.falcipar34惡性瘧P.falciparum

●分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病●我國流行區(qū)域?yàn)樵颇鲜『秃Ｄ鲜　袼姆N瘧原蟲中致病力最強(qiáng)，無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時治療可危及生命（腦型瘧）惡性瘧P.falciparum

●分布熱帶、亞熱帶，35間日瘧P.vivax

●間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū),主要是中部地區(qū)●病程良性,有復(fù)發(fā)●遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見間日瘧P.vivax●間日瘧原蟲分布于我國大部分地36三日瘧P.malariae

●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布●三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報(bào)告卵形瘧（蛋形瘧）P.ovale●主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報(bào)告●在我國已基本消滅三日瘧P.malariae●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特37

原蟲鏡檢原蟲鏡檢38血細(xì)胞紅細(xì)胞血小板白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）血細(xì)胞39紅細(xì)胞紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀邊緣較厚，而中間較薄紅細(xì)胞紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀40血小板血小板41各種血細(xì)胞模式圖

1.紅細(xì)胞

2.嗜酸性粒細(xì)胞

3.嗜堿性粒細(xì)胞

4.中性粒細(xì)胞

5.淋巴細(xì)胞

6.單核細(xì)胞

7.血小板1234567123456742瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件43瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色素；原蟲：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色；細(xì)胞漿：藍(lán)色或深藍(lán)色，隨著蟲體發(fā)育長大，細(xì)胞漿逐漸增多；核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。核胞漿斑點(diǎn)瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色44瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團(tuán)塊。間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲：呈細(xì)砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧色素瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在45紅細(xì)胞不漲大環(huán)狀體纖細(xì),常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個核環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣除環(huán)狀體，配子體外沒有其他發(fā)育期配子體呈新月形或臘腸形成熟裂殖體約含16-32個裂殖子，排列不規(guī)則可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞不漲大惡性瘧（P.falciparum）46瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件47瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件48瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件49瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件5021.AmemberoftheUNforcesinEastTimor.Presentedwithhightemperature.21.AmemberoftheUNforces51瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件52紅細(xì)胞明顯漲大薛氏點(diǎn)明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個裂殖子

間日瘧（P.vivax）鑒定要點(diǎn)間日瘧（P.vivax）532.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.2.Intermittentfever;arrived54瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件55瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件56瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件57瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件58紅細(xì)胞不漲大或略小環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個裂殖子雌雄配子體小于正常紅細(xì)胞，色素呈深褐色常可查見各階段的瘧原蟲三日瘧（P.malariae）診斷要點(diǎn)紅細(xì)胞不漲大或略小三日瘧（P.malariae）59瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件60瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件61瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件62瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件63卵形瘧（P.ovale）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞正?；蚵詽q大

常見慧星狀(也稱齒輪狀)環(huán)粗大薛氏點(diǎn)明顯

成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大成熟裂殖體約含6-12個裂殖子

卵形瘧（P.ovale）鑒定要64瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件65瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件66瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件6718.RecenttriptoSouthernIndia-headachesandvaguelyunwell.18.RecenttriptoSouthernIn68類型周圍血中發(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲環(huán)狀體配子體正常大小茂氏點(diǎn)小滋養(yǎng)體纖細(xì)，常見２個核，一個紅細(xì)胞內(nèi)常有2個以上的原蟲粗黑，配子體中明顯

16-32間日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體配子體漲大,可達(dá)正常的1.5-2倍薛氏點(diǎn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍(lán)色，活潑金棕色不明顯12-24

卵形瘧原蟲各期均有正常大小或略漲大,

薛氏點(diǎn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍(lán)色較深，核較大深棕色明顯6-12三日瘧原蟲各期均有裂殖體正?；蚵钥s小齊氏點(diǎn)（西門氏）但少見圓形，藍(lán)色深，核緊縮，滋養(yǎng)體胞漿呈帶狀深棕色，粗明顯6-12

類型周圍血中發(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂69混合感染的鑒別容易鑒別的混合感染1）同一血膜中發(fā)現(xiàn)間日瘧各期原蟲和惡性瘧雌雄配子體。2）同一血膜中發(fā)現(xiàn)大量纖細(xì)的惡性瘧環(huán)狀體，并混有少量間日瘧原蟲。不易鑒別的混合感染1）間日瘧各期原蟲和粗環(huán)的惡性瘧環(huán)狀體。2）僅有間日瘧和惡性瘧的環(huán)狀體?；旌细腥镜蔫b別容易鑒別的混合感染70厚血膜中容易被誤認(rèn)為瘧原蟲的物質(zhì)●

未成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞溶血后的殘影易被誤為薛氏點(diǎn)●

重疊的血小板易被誤為裂殖體●

混雜在稀釋液中的細(xì)菌、植物孢子、酵母、花粉、藻類等很像血液中的多種寄生蟲，如血孢子蟲等，會干擾對瘧原蟲的鑒別。厚血膜中容易被誤認(rèn)為瘧原蟲的物質(zhì)●未成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞溶血后71讀片練習(xí)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件72瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件73瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件74瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件75瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件76瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件77瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件784.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C4.Unspecifiedoverseastravel79瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件80瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件81瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件82瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件83瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件84瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件85瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件86瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件873.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.3.Historyofroundtheworld88謝謝！謝謝！89

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瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

-血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別黔東南州90寄生人體的四種瘧原蟲間日瘧原蟲[P.vivax，P.v]惡性瘧原蟲[P．Falciparum,P.f]三日瘧原蟲[P．Malariae,P.m]卵形瘧原蟲[P．Ovale,P.o]我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另二種少見，近年偶見國外輸入病例。其它瘧原蟲諾氏瘧原蟲(Plasmodiumnowlesi)寄生人體的四種瘧原蟲間日瘧原蟲[P.vivax，P.v]91內(nèi)容提綱血片制作與染色瘧原蟲計(jì)數(shù)瘧原蟲的基本形態(tài)特征內(nèi)容提綱血片制作與染色92血片制作第一步：載玻片的清洗用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于95%的乙醇中1小時以上用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。血片制作第一步：載玻片的清洗93第二步：患都信息的核實(shí)采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和年齡并在玻片的右側(cè)編號第二步：患都信息的核實(shí)采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和94第三步：采集血樣采血部位：耳垂或無名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。第三步：采集血樣采血部位：耳垂或無名指，95厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜第四步：血片制作厚血膜薄血膜厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火96制片過程圖示標(biāo)簽制片過程圖示標(biāo)簽97標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過多或過少●薄血膜平整,無皺折和空泡.顯微鏡下紅細(xì)胞單層排列標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過多或過少98血片的制作×××××√血片的制作×××××√99血片制作影響因素載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)胞均勻分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-10個白細(xì)胞為宜；血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜；制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果．血片制作影響因素載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)100血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法

1.染色原液配制2.門診快染、慢染

3.成批染色和溶血染色●

瑞氏染色法WHO推薦使用吉氏染色法血片染色兩種染色方法:101吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(純)250ml甲醇

(純)250ml●吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好?！裾麄€染色液配制時間不能少于5個小時吉氏染液(原液)的配置吉氏染粉(AzureB102血片的染色染色用水和沖洗用水配制常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水用pH7.0～pH7.2的緩沖液。血片的染色染色用水和沖洗用水配制103血片染色薄血膜的固定厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要點(diǎn)：甲醇不能觸碰到厚血膜）血片染色薄血膜的固定104操作1（快染）量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。操作2(慢染)量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。血片染色操作1（快染）量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)105將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，染色30分鐘。（如染液稀釋液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。成批血片染色將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染成批血片染色106厚血膜溶血染色放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進(jìn)行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。厚血膜溶血染色放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固107質(zhì)量好的染色

顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色，薄血膜平整，紅細(xì)胞單層排列

如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量好的染色外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)108配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；染液稀釋后使用時間：原液必須臨用時稀釋，隨配隨用；染液的稀釋濃度；染色時間。染色質(zhì)量影響因素配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；染109用水過酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來；用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍(lán)色，致使R的胞漿難以辨論。染色稀釋用水:PH7.0-7.2清潔水。染色質(zhì)量影響因素用水過酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來；染色稀釋用水:110固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；血膜在制備后應(yīng)盡量能在當(dāng)天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時,放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。染色質(zhì)量影響因素固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；染色質(zhì)量影響因素111瘧原蟲鏡檢●瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)●瘧原蟲密度計(jì)數(shù)方法●人體四種瘧原蟲的形態(tài)特征瘧原蟲鏡檢●瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)112●當(dāng)前分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被認(rèn)為是不可替代的確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”

●顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲實(shí)體并鑒別4種人體瘧原蟲原蟲鏡檢---金標(biāo)準(zhǔn)●當(dāng)前分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被113瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)114瘧原蟲密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲密度的三種方法：●白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法(厚血膜WHO)

優(yōu)點(diǎn)：可作為定性和定量分析●

半定量計(jì)數(shù)法(厚血膜)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便缺點(diǎn)：只能定性，不宜作為定量分析●

紅細(xì)胞感染密度計(jì)算法(薄血膜)瘧原蟲密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲密度的三種方法：115白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（200個白細(xì)胞中小于100個瘧原蟲），可增加白細(xì)胞，計(jì)數(shù)500個。密度單位:原蟲數(shù)/μl計(jì)算公式：瘧原蟲數(shù)÷計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)×患者每微升血白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血。如果不知患者的白細(xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國際標(biāo)準(zhǔn))。白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細(xì)116白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法從血膜的左上角開始，橫向。計(jì)數(shù)1個視野后，每次間隔5個視野,再計(jì)數(shù)。厚血膜白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法從血膜的左上角開始，橫向。厚血膜117×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計(jì)數(shù)的視野如果該視野無原蟲，則計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)

●看到第一個原蟲開始計(jì)數(shù)

白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)方法×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計(jì)數(shù)的視野白118白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法●例如計(jì)數(shù)200WBC中有135個瘧原蟲，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個白細(xì)胞計(jì)數(shù),由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲密度為：135（計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)）÷200（計(jì)數(shù)的白細(xì)胞）x8000（每微升血白細(xì)胞數(shù)）=5400/μl答：該患者的瘧原蟲密度為5400/μl。白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法●例如計(jì)數(shù)200WBC中有135個瘧原119用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野1～5個蟲，記錄“＋”4.平均每個視野6～10個蟲，記錄“++”5.平均每個視野11～100個蟲，記錄“+++”6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“++++”。

如：PvR+T++S5G少這種方法簡便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。半定量計(jì)數(shù)法用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密120如何確定瘧原蟲血片為陰性●

檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲●最少檢查100個厚血膜視野未查見瘧原蟲（臨床病人）如何確定瘧原蟲血片為陰性●檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲121人體四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢人體四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢122感染人的瘧原蟲有四種:

惡性瘧原蟲P.falciparum間日瘧原蟲P.vivax三日瘧原蟲P.malariae

卵形瘧原蟲P.ovale

感染人的瘧原蟲有四種:惡性瘧原蟲P.falcipar123惡性瘧P.falciparum

●分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病●我國流行區(qū)域?yàn)樵颇鲜『秃Ｄ鲜　袼姆N瘧原蟲中致病力最強(qiáng)，無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時治療可危及生命（腦型瘧）惡性瘧P.falciparum

●分布熱帶、亞熱帶，124間日瘧P.vivax

●間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū),主要是中部地區(qū)●病程良性,有復(fù)發(fā)●遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見間日瘧P.vivax●間日瘧原蟲分布于我國大部分地125三日瘧P.malariae

●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布●三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報(bào)告卵形瘧（蛋形瘧）P.ovale●主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報(bào)告●在我國已基本消滅三日瘧P.malariae●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特126

原蟲鏡檢原蟲鏡檢127血細(xì)胞紅細(xì)胞血小板白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）血細(xì)胞128紅細(xì)胞紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀邊緣較厚，而中間較薄紅細(xì)胞紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀129血小板血小板130各種血細(xì)胞模式圖

1.紅細(xì)胞

2.嗜酸性粒細(xì)胞

3.嗜堿性粒細(xì)胞

4.中性粒細(xì)胞

5.淋巴細(xì)胞

6.單核細(xì)胞

7.血小板12345671234567131瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件132瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色素；原蟲：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色；細(xì)胞漿：藍(lán)色或深藍(lán)色，隨著蟲體發(fā)育長大，細(xì)胞漿逐漸增多；核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。核胞漿斑點(diǎn)瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色133瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團(tuán)塊。間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲：呈細(xì)砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧色素瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在134紅細(xì)胞不漲大環(huán)狀體纖細(xì),常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個核環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣除環(huán)狀體，配子體外沒有其他發(fā)育期配子體呈新月形或臘腸形成熟裂殖體約含16-32個裂殖子，排列不規(guī)則可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞不漲大惡性瘧（P.falciparum）135瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件136瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件137瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件138瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件13921.AmemberoftheUNforcesinEastTimor.Presentedwithhightemperature.21.AmemberoftheUNforces140瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件141紅細(xì)胞明顯漲大薛氏點(diǎn)明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個裂殖子

間日瘧（P.vivax）鑒定要點(diǎn)間日瘧（P.vivax）1422.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.2.Intermittentfever;arrived143瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件144瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件145瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件146瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)課件147紅細(xì)胞不漲大或略小環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈