原核生物的轉(zhuǎn)錄

關(guān)于原核生物的轉(zhuǎn)錄第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日●基本概念；●原核生物轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶、啟動子；轉(zhuǎn)錄的基本過程；●真核生物轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶、啟動子；轉(zhuǎn)錄的基本過程；●真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工；●原核生物與真核生物mRNA的特征比較；●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)；第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)若干基本概念第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日

●

基因表達(dá)的第一步；●

以D.S.DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板；●

在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下進(jìn)行的；●

模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈

DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’；(書寫基因序列時(shí)，僅寫非模板序列，可不注明極性方向)DNA3’---TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand)template(antisensestrand)

●

按A

U，CG配對的原則，合成RNA分子；第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日●RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion,elongation,termination三過程

●從啟動子（promoter）到終止子（terminator）稱為

轉(zhuǎn)錄單位

（transcriptionalunit）

●轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值

●原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為polycistroninoperon

真核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron,Nooperon+1-10+10upstreamstartpointdownstream

位于起始位點(diǎn)之前的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位的上游(Upstream)，起始位點(diǎn)之后(在轉(zhuǎn)錄序列之內(nèi))的序列被稱為下游(Downstream)。第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄的不對稱性：

在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。編碼鏈與模板鏈與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上轉(zhuǎn)錄方向5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)原核生物的轉(zhuǎn)錄一、原核生物轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)；二、轉(zhuǎn)錄的起始，延伸；三、轉(zhuǎn)錄的終止；四、轉(zhuǎn)錄的抗終止。第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、原核生物轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)：（一）、RNA聚合酶：1、E.coli的聚合酶負(fù)責(zé)所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。一個(gè)E.coli細(xì)胞中約有7000個(gè)RNA聚合酶分子。任意時(shí)刻大概有2000~5000RNA聚合酶在合成RNA；2、E.coli的全酶是一個(gè)質(zhì)量約465kD的分子，由兩個(gè)α、β、β’、ω亞基及一個(gè)σ因子所組成。其中，α、β、β’、ω亞基構(gòu)成了核心酶，加上σ因子之后便構(gòu)成了全酶。即：全酶=核心酶+σ因子第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（1）α亞基的功能：當(dāng)噬菌體T4感染E.coli時(shí)，宿主α亞基被糖基化修飾。修飾導(dǎo)致了原來被全酶所識別的啟動子親和力下降，這就提示：3、各亞基的功能：α亞基在啟動子識別中起作用。第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日α亞基的作用：

位于前端的α因子使雙鏈解鏈為單鏈；

位于尾端的α因子使單鏈新聚合為雙鏈。

核心酶的組建順序：因子α+α→2α+β→+β’第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）δ亞基：★重復(fù)使用(Reusable)★使Holo-enzyme識別啟動子,并與模板鏈結(jié)合

★修飾RNApol構(gòu)型，降低全酶與DNA的非特異性結(jié)合力增強(qiáng)全酶與啟動子位點(diǎn)的特異性結(jié)合力RNA鏈合成達(dá)8~9個(gè)堿基時(shí)，σ因子釋放，離開核心酶，由核心酶負(fù)責(zé)延伸。σ因子能夠保證細(xì)菌RNA聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到某個(gè)特異的、唯一的DNA啟動子上。第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日例如：正常情況下負(fù)責(zé)大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的是σ70

。但σ32和σE在環(huán)境變化（熱激）時(shí)被表達(dá)。σ28用于正常生長時(shí)鞭毛基因的表達(dá)。

在大腸桿菌中，存在多種σ因子。不同的σ因子可以識別不同的啟動子序列，從而可以啟動不同基因的表達(dá)；第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日

大腸桿菌的熱激應(yīng)答基因的表達(dá)的調(diào)控是通過σ32實(shí)現(xiàn)的。溫度升高時(shí)σ32數(shù)量增加，而溫度恢復(fù),σ32活性降低來完成誘導(dǎo)。

σ32合成的基本信號是溫度增加導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)(部分變性蛋白質(zhì))在細(xì)胞內(nèi)累積。

另一組熱調(diào)控基因的表達(dá)是由σE

因子控制，它負(fù)責(zé)對比σ32更劇烈的溫度變化應(yīng)答。它是由熱變性蛋白質(zhì)的積聚所誘導(dǎo)的。

大腸桿菌細(xì)胞含有少量σ54

，當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏氮時(shí)被激活。在這些情況下，基因被開啟以便利用可替代氮源。第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日β因子：★促進(jìn)RNApol+NTP→RNAelongation；★完成NTP之間的磷酸脂鍵的連接；★與

Rho(ρ)因子競爭RNA3’-end。第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日β’

因子；★強(qiáng)堿性亞基★促使RNA聚合酶與

有義鏈（sensestrand）的結(jié)合

第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日總結(jié)：HoloEnzyme含有的功能位點(diǎn)

★sensestrandDNAbindingpoint(β’)★DNA/RNAhybridsite(β)★D.S.DNAunwindingpoint(α)★D.S.DNArewindingpoint(α)第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日原核生物RNApol(Core)的結(jié)構(gòu)與功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrand10-17bp

第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日總結(jié)：大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別。解螺旋及重新螺旋βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復(fù)能力無有第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）、啟動子1、啟動子的發(fā)現(xiàn)方法：PromoterregionidentifiedbyDNAasemethod

RNApolymerase(noNTP)DNAsequencing

DNase

digestionDNA+dissolve第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日

通過比較不同基因的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌具有四個(gè)保守位點(diǎn)：起始位點(diǎn)、-10區(qū)、-35區(qū)以及-10和-35區(qū)之間間隔距離。2、原核生物啟動子的特點(diǎn)：（1）、起始位點(diǎn)通常(>90%)都是嘌呤堿基。該堿基左右兩側(cè)的堿基通常是C（左側(cè)），T（右側(cè)），即：組成CAT序列。啟動子定義：指能被RNA聚合酶全酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）、在起始位點(diǎn)上游，在幾乎所有的啟動子中都可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)6bp的區(qū)域。六聚物的中心通?？拷鹗键c(diǎn)上游的10bp。該區(qū)稱為－10區(qū)。它的同源序列為TATAAT。

可被總結(jié)為如下形式：T(80)A(95)T(45)A(60)A(50)T(96)，其中，數(shù)字表示堿基出現(xiàn)最大頻率的百分?jǐn)?shù)。該區(qū)又稱為PribnowBox。

-10序列中開始的高度保守的TA

和最后一個(gè)幾乎完全保守的T

是最重要的堿基。第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日（3）、TTGACA區(qū)：大腸桿菌啟動子中另外一個(gè)保守區(qū)是以起始位點(diǎn)上游-35bp為中心的，稱-35區(qū)。其共有序列為TTGACA，各堿基出現(xiàn)的頻率為：T(82)T(84)G(78)A(65)C(54)A(45)。其中括號數(shù)字表示該堿基出現(xiàn)的頻率。該區(qū)又稱為SextamaBox

。第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（4）、在90%啟動子中，-35和-10區(qū)之間的分隔距離在16到18bp

之間，其中最適距離為17bp，這個(gè)距離對于啟動子啟動基因表達(dá)效率是最佳的。個(gè)別例外的可以小于15

或者大于20bp。盡管間隔區(qū)的真實(shí)序列并不重要，但間隔距離大小可以保持兩個(gè)區(qū)恰當(dāng)?shù)木嚯x，從而使兩個(gè)區(qū)適合于RNA聚合酶的幾何結(jié)構(gòu)，所以可以增加啟動子的啟動效率。第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日

原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)：第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日典型啟動子的結(jié)構(gòu)-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、SextamaBox與PribnowBox的功能：（2）、-10區(qū)序列的突變不影響轉(zhuǎn)錄閉合復(fù)合體的形成，但是其向轉(zhuǎn)錄開放復(fù)合體的轉(zhuǎn)變變慢。（1）、兩個(gè)區(qū)功能的研究方法：利用堿基突變來驗(yàn)證序列功能。該結(jié)果表明，-10區(qū)序列組成了啟動子的“解旋域”(Unwindingdomain)。第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（3）、-35區(qū)序列的突變使轉(zhuǎn)錄閉合復(fù)合體的形成速度減慢，但并不抑制其轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄開放復(fù)合體。因此-35區(qū)序列的功能是為RNA聚合酶的識別提供信號，因此，可以將-35區(qū)序列看作是“識別域”(Recognitiondomain)。第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日（4）、

SextamaBox與PribnowBox間距17bp,

有利于RNApol啟動17bp的間距較17bp的序列特異性對轉(zhuǎn)錄更為重要（5）、SextamaBoxorPribnowBoxmut.→

轉(zhuǎn)錄率下降100XSextamaBoxandPribnowBoxmut.→

轉(zhuǎn)錄率下降1000X第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日4、Promoter與δfactor間的作用●二者結(jié)合的專效性決定了某個(gè)啟動子是strongpromoter還是weakpromoter第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日★與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性愈高

→啟動強(qiáng)度愈大

與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性愈低→啟動強(qiáng)度愈小

若與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列差異很大→則由另一種δ因子啟動E.coli;4δfactor→recognition4promotersBacillus;10δfactor→recognition10promoters第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、原核生物基因轉(zhuǎn)錄的起始過程：1、全酶結(jié)合到啟動子序列上，形成一個(gè)閉合(Closed)的二元復(fù)合物而開始反應(yīng)；2、與酶結(jié)合的一小段DNA序列的“溶解”導(dǎo)致了閉合復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放(Open)復(fù)合體。對于強(qiáng)啟動子來說，閉合復(fù)合體向開放二元復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆轉(zhuǎn)的。（一）、轉(zhuǎn)錄的起始：第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、第三步是最開始的兩個(gè)核苷酸之間的連接。在它們之間會形成一個(gè)磷酸二酯鍵，這樣，所產(chǎn)生的三元復(fù)合物(Ternarycomplex)就包括RNA、DNA、聚合酶。4、當(dāng)起始過程完成后，聚合酶釋放出σ因子而轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵拿?，后者和DNA、新生RNA組成延伸三元復(fù)合物。

接下來加入的前九個(gè)核苷酸，聚合酶是一直不移動的，產(chǎn)生一條短RNA鏈，直到九個(gè)堿基為止。九個(gè)堿基中的任何一個(gè)加入后，聚合酶都有釋放RNA的可能性，導(dǎo)致流產(chǎn)起始(Abortiveinitiation)。但流產(chǎn)起始之后聚合酶又開始合成第一個(gè)堿基。流產(chǎn)起始常常產(chǎn)生一系列短的寡聚核苷酸(2~9個(gè)堿基)。第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日總結(jié)：轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄延伸之前，RNA聚合酶要經(jīng)過數(shù)個(gè)步驟。閉合二元復(fù)合物轉(zhuǎn)化為開放二元復(fù)合物，開放二元復(fù)合物再轉(zhuǎn)化為三元復(fù)合物。第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）、起始過程中的RNA聚合酶的形態(tài)變化：1、當(dāng)RNA聚合酶全酶最初結(jié)合到DNA上時(shí)，它覆蓋了從-55到+20大約75～80bp的長度。第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、伴隨σ因子的失去，聚合酶與-55到-35

的結(jié)合也失去，僅剩下約60bp的DNA被聚合酶所覆蓋。

這說明：啟動子的上游部分僅參與RNA聚合酶的起始識別，起始以后便不再起作用。第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、當(dāng)RNA鏈延伸到15～20

個(gè)堿基時(shí)，酶會發(fā)生進(jìn)一步的形態(tài)變化，轉(zhuǎn)變成負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄延伸的復(fù)合體，僅覆蓋30～40bp長度。第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日RNA聚合酶首先與-55到+20之間的區(qū)域接觸，當(dāng)σ因子解離下來后，核心酶與-30左右的序列結(jié)合。接著核心酶向前移動，結(jié)構(gòu)逐漸致密并最終形成延伸復(fù)合物。總結(jié)：轉(zhuǎn)錄起始過程中復(fù)合物的變化象蠕蟲一樣移動第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、轉(zhuǎn)錄的延伸：σ因子釋放后，進(jìn)入鏈的延長階段1、RNA合成在一個(gè)“轉(zhuǎn)錄泡(Bubble)”中進(jìn)行，在轉(zhuǎn)錄泡中，DNA被瞬間分離成單鏈，其中一條被作為RNA合成的模板。當(dāng)RNA聚合酶沿DNA移動時(shí)，空泡也隨之移動。第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日RNA鏈的延伸3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位DNA第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日RNA鏈的合成方向5′→3′

各種結(jié)果表明，RNA-DNA雜交區(qū)的長度在3~9

個(gè)堿基對之間。第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日所有核苷酸的合成都是從游離核苷酸的5￠-三磷酸基團(tuán)與RNA鏈末端的3￠-OH之間的縮合反應(yīng)。新加入核苷酸失去末端的兩個(gè)磷酸基(γ和β)；其α磷酸基與RNA鏈形成磷酸二酯鍵。這個(gè)反應(yīng)發(fā)生在催化位點(diǎn)。2、磷酸二酯鍵的形成：第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日37℃時(shí)反應(yīng)速度約為每秒40個(gè)核苷酸(細(xì)菌RNA聚合酶)；這與翻譯的速度(每秒15個(gè)氨基酸)大致相同，RNA聚合酶控制著下一個(gè)核苷酸的加入。該酶可能僅當(dāng)一個(gè)核苷酸與模板形成氫鍵互補(bǔ)配對時(shí)才允許磷酸二酯鍵的形成。如果該核苷酸與模板不匹配，則將其去除，接著另一個(gè)核苷酸加入。3、延伸的速度：4、核苷酸加入的控制：第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日四、細(xì)菌RNA轉(zhuǎn)錄的終止：1、一旦RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄，酶就沿模板向前移動合成RNA，直到遇到一個(gè)終止子(Terminator)，聚合酶停止向正在生長的RNA鏈添加核苷酸，釋放合成的RNA產(chǎn)物，從DNA模板上解離。

終止子：是RNA聚合酶停止RNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。終止過程需要所有維持RNA-DNA雜交的氫鍵斷裂，然后DNA重新形成雙螺旋。第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)中RNA聚合酶是否需要輔助蛋白質(zhì)參與終止，可將E.coli中的終止子分為兩種類型：

在體外，沒有任何其它因子參與，核心酶也能在某些位點(diǎn)終止轉(zhuǎn)錄，這些位點(diǎn)被稱為“內(nèi)源性終止子(Intrinsicterminator)”。“ρ因子依賴型終止子”：體外需要ρ因子的輔助；突變實(shí)驗(yàn)顯示體內(nèi)該因子參與了終止過程。第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日（1）、內(nèi)源性終止子：A、終止子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

內(nèi)源性終止子有兩個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一個(gè)二級結(jié)構(gòu)中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄單位最末端的連續(xù)約6個(gè)U殘基的區(qū)段。這兩個(gè)特點(diǎn)都是終止所必需的。

發(fā)夾的基底部通常包含一個(gè)富含G:C區(qū)。發(fā)夾和U區(qū)段的典型距離為7~9個(gè)堿基。有時(shí)U區(qū)段可以插有其它堿基。第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日終止子內(nèi)部包含能夠形成7-20bp長度發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)有富含尿嘧啶核苷酸的G-C區(qū)。內(nèi)源性終止子的結(jié)構(gòu)第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日B、內(nèi)源性終止子終止的機(jī)理：

RNA聚合酶遇到發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成速度會減慢(或者是暫停)；

正確位置的一段U殘基是RNA聚合酶遇到發(fā)夾而暫停時(shí)從模板解離下來所必需的。

rU:dA(RNA-DNA雜交)是一個(gè)不常見的弱堿基配對結(jié)構(gòu)，對它的破壞所需能量最少。當(dāng)聚合酶暫停時(shí)，RNA-DNA雜交鏈從終止區(qū)的弱鍵rU:dA處解開。第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日

ρ-依賴型終止作用所需的序列長50~90個(gè)堿基，該區(qū)域的共同特征是RNA富含C殘基而G殘基很少?？梢栽谛潞铣傻腞NA中形成松散的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。一個(gè)ρ-依賴型終止子的終止效率隨“富C/少G”區(qū)域的長度而增加。A、終止子序列特征：（2）、ρ-依賴型終止子：第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日ρ因子是ρ基因編碼的蛋白質(zhì)，是一種酶，它具有ATPase的活性和解鏈酶的活性。6聚化的ρ因子在水解ATP的情況下，它沿著5′→3′方向轉(zhuǎn)錄物的3′端前進(jìn)，直到遇到暫停在終止點(diǎn)位置的RNA聚合酶（因?yàn)樵搮^(qū)有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聚合酶的暫停）。隨后ρ因子通過解鏈酶的活性解開轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）上的RNA/DNA形成的雜交雙螺旋，使RNA轉(zhuǎn)錄物得到釋放，從而終止轉(zhuǎn)錄。

B、ρ因子終止機(jī)理：第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日B、依賴因子的終止模型：因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月2