發(fā)酵染菌及防治

關(guān)于發(fā)酵染菌及防治第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日目的要求：

了解染菌對(duì)發(fā)酵工業(yè)的危害掌握染菌的檢查方法熟悉染菌的途徑掌握染菌的防治方法掌握噬菌體污染的防治方法第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日幾個(gè)問題：1、染菌2、染菌途徑3、染菌檢查的方法4、染菌防治的方法第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日發(fā)酵染菌防治的意義：現(xiàn)代發(fā)酵利用的是微生物的純培養(yǎng)技術(shù)。要嚴(yán)格無菌操作技術(shù)。防止發(fā)酵過程中的染菌有著重要的意義：保證產(chǎn)品的質(zhì)量、收率的穩(wěn)定。保證發(fā)酵生產(chǎn)的有序進(jìn)行。有利于節(jié)約型社會(huì)的建立。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌分析一、發(fā)酵的異?，F(xiàn)象二、染菌檢查三、染菌的原因及分析四、染菌隱患的處理第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、發(fā)酵的異?，F(xiàn)象（一）種子培養(yǎng)的異常現(xiàn)象（二）發(fā)酵的異?，F(xiàn)象第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）種子培養(yǎng)的異?，F(xiàn)象1、菌體生長緩慢原因：種子質(zhì)量差、培養(yǎng)基成分不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件沒有控制到位。2、菌絲結(jié)團(tuán)原因：種子、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基。3、代謝不正常原因：培養(yǎng)基不合適、培養(yǎng)環(huán)境不良、接種量少、污染雜菌。第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）發(fā)酵的異?，F(xiàn)象（p184-185）1、消耗緩慢（菌體生長差）（1）原因：產(chǎn)生菌孢子和種子質(zhì)量不好、發(fā)酵條件差、培養(yǎng)基質(zhì)量差（滅菌不當(dāng)）等。（2）措施：補(bǔ)充合適的氮源，或磷酸鹽，提高發(fā)酵溫度。2、pH異常發(fā)酵過程中一般pH是有一定規(guī)律的。如不符合規(guī)律則是發(fā)酵異常。（1）原因：培養(yǎng)基原料差、滅菌不徹底、加糖過于集中等。（2）措施：可通過加酸或堿調(diào)節(jié)。最好加入一些生理酸性或堿性鹽或緩沖液來調(diào)節(jié)。第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、溶氧水平異常（p164）正常發(fā)酵過程的溶氧水平是由一定規(guī)律的。如果溶氧水平與一般規(guī)律不一致即發(fā)生了異常變化。（1）原因：染菌。染菌的種類：好氧菌、厭氧菌。菌體代謝異常、某些設(shè)備或工藝發(fā)生故障或變化。（2）措施：檢查無菌空氣、管道是否滲漏。攪拌設(shè)備是否正常運(yùn)行等。第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日4、泡沫過多發(fā)酵過程中泡沫的消長是有一定規(guī)律的。（1）原因：種子過嫩或過老，致使菌體生長差、代謝速度慢，蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)多。培養(yǎng)基滅菌溫度過高或時(shí)間過長，培養(yǎng)基成分受到破壞。（2）措施：接種優(yōu)質(zhì)種子、對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行合理滅菌。第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日5、菌體濃度過高或過低由于溫度、氧氣、培養(yǎng)基、種子質(zhì)量、菌體自溶等影響微生物的生長，或感染噬菌體等，導(dǎo)致發(fā)酵液中微生物的濃度過高或過低。微生物的濃度過低，發(fā)酵液轉(zhuǎn)稀：指發(fā)酵尚未進(jìn)入放罐階段，發(fā)酵液就變稀。（1）原因：感染噬菌體、培養(yǎng)條件不合適。（2）措施：防噬菌體、控制合適培養(yǎng)條件。未知的其它原因：可補(bǔ)充氮源促菌絲生長，或補(bǔ)充碳源也可。微生物的濃度過高，發(fā)酵液過濃：（1）原因：氮源過多，菌絲生長快、濃度大，從而降低發(fā)酵液中溶解氧的濃度，影響發(fā)酵正常進(jìn)行。（2）措施：補(bǔ)入大量的水。第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、染菌檢查（p185-186）在發(fā)酵過種中，對(duì)雜菌污染的及早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)處理，是免除染菌造成嚴(yán)重?fù)p失的重要手段。因此，要求有確切、迅速的方法來檢測出污染的雜菌。目前常用的方法：（一）顯微鏡檢查（二）肉湯培養(yǎng)檢查法（三）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法（四）發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）顯微鏡檢查

1、細(xì)菌用革蘭氏染色，必要時(shí)進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接觀察。第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）肉湯培養(yǎng)檢查法1、方法液體培養(yǎng)基的檢查:將需要檢查的樣品接入經(jīng)滅菌，并經(jīng)過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基中，放置37℃和27℃分別培養(yǎng)24h，進(jìn)行觀察，觀察肉湯是否渾濁。并取樣鏡檢。無菌空氣的檢查:將葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基裝在吸氣瓶中，滅菌后，37℃培養(yǎng)24h，若培養(yǎng)液未變渾濁，表明吸氣瓶中的培養(yǎng)液是無菌的，把過濾后的空氣引入吸氣瓶中，培養(yǎng)后，若培養(yǎng)液變混或變黃色，表明空氣中仍有雜菌，說明過濾系統(tǒng)有問題。第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、應(yīng)用（1）空氣過濾系統(tǒng)。（2）液體培養(yǎng)基。（3）噬菌體檢查，此時(shí)使用生產(chǎn)菌作為指示菌。第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法１、平板劃線培養(yǎng)固體平板置培養(yǎng)箱中37℃，保溫24h，檢查無菌即可使用。將需要檢查的樣品在無菌的平板上劃線，分別置37℃、27℃培養(yǎng)，以適應(yīng)嗜中溫和低溫菌的生長，一般在8h后即可觀察。培養(yǎng)后，若出現(xiàn)與生產(chǎn)菌株形態(tài)不一的菌落，表明可能被雜菌污染。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日２、噬菌體檢查——雙層平板培養(yǎng)法：底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基，上層減少瓊脂用量，先將滅菌的底層培養(yǎng)基溶后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基溶解并保持40℃，加生長菌作為指示菌和待測樣品混合后迅速倒在底層平板上，置培養(yǎng)箱保溫經(jīng)12～20h觀察有無噬菌斑。第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日（四）發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象觀察法

（p186）如可從溶解氧、pH值、排氣中CO2含量、菌體酶活力等變化來判斷。1、溶解氧水平異常變化顯示染菌。2、pH異常變化顯示染菌。

3、排氣中CO2異常變化顯示染菌。第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日谷氨酸正常發(fā)酵和異常發(fā)酵溶氧水平曲線：第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、發(fā)酵染菌的原因（一）發(fā)酵染菌率

是指一年內(nèi)發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。發(fā)酵染菌批數(shù)總?cè)揪?——————100％總投料批數(shù)發(fā)酵染菌率是指在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率，包括染菌后被挽救不了導(dǎo)致倒罐的批數(shù)，但種子罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導(dǎo)致發(fā)酵染菌的另行計(jì)算。第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）染菌原因及分析歸納發(fā)酵中染菌的主要原因有以下幾方面：無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、種子帶菌、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善等。但還要具體問題具體分析?？蓮奈廴镜碾s菌種類、污染的時(shí)間、污染的程度等方面進(jìn)行綜合分析，才能作出正確的判斷，從而采取相應(yīng)的對(duì)策和措施。（p186-188）第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日1、染菌的雜菌種類分析雜菌不同染菌的原因不同：（p187）雜菌原因耐熱的芽孢桿菌養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備存在死角球菌、無芽孢桿菌等真菌設(shè)備滲漏、無菌操作不當(dāng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底等第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、發(fā)酵染菌規(guī)模的分析（1）大批發(fā)酵罐染菌A發(fā)酵前期：種子帶菌、連消設(shè)備染菌。B發(fā)酵中后期：如是同一種菌則是無菌空氣出問題。（2）部分發(fā)酵罐A發(fā)酵前期：種子帶菌、連消設(shè)備染菌。B發(fā)酵后期：中間補(bǔ)料染菌、補(bǔ)料管滲漏。（3）個(gè)別發(fā)酵罐染菌一般原因是設(shè)備滲漏造成的。第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、不同污染階段分析種子培養(yǎng)階段染菌：原因：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素。發(fā)酵開始階段染菌：原因：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素，無菌空氣等。發(fā)酵后期染菌：原因：無菌空氣、中間補(bǔ)料、設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題。第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、染菌隱患的處理（p188）嚴(yán)格按操作工藝進(jìn)行投產(chǎn)前進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的無菌測試嚴(yán)格工人的管理加強(qiáng)在線檢測技術(shù)定期對(duì)設(shè)備維修第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)染菌對(duì)發(fā)酵的影響（p189）絕大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵，無論是單菌發(fā)酵還是混合菌種發(fā)酵。都是純種發(fā)酵，除了菌種以外的微生物都被視為雜菌。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都可能遭受雜菌或噬菌體的污染，甚至由于染菌而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日染菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)率、提取收得率、產(chǎn)品質(zhì)量和三廢治理都有很大影響。一般生產(chǎn)不同品種污染不同種類和性質(zhì)的雜菌、污染時(shí)間、途徑、程度、培養(yǎng)條件等等，最終產(chǎn)生的后果不同。第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日染菌對(duì)發(fā)酵的影響：染菌對(duì)不同品種發(fā)酵的影響不同感染不同種類和性質(zhì)的雜菌對(duì)發(fā)酵的影響不同不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響不同染菌程度對(duì)發(fā)酵的影響不同染菌對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響發(fā)酵染菌也造成三廢處理困難和對(duì)環(huán)境的污染

第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響不同：種子培養(yǎng)期染菌：危害大，如發(fā)現(xiàn)染菌后應(yīng)滅菌后棄去。發(fā)酵前期染菌：易使雜菌迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)和氧分。因此，應(yīng)迅速重新滅菌。發(fā)酵中期染菌：將嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的合成。因此，應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)、快處理。發(fā)酵后期染菌：如雜菌量不太多，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵；如污染量大，可提前放罐。此期染菌對(duì)不同產(chǎn)物的影響不同：如抗生素、檸檬酸影響不大；而肌苷、肌苷酸、谷氨酸等將影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量。第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)雜菌污染后的挽救和處理

(p190）1、種子罐染菌的處理及時(shí)用高壓蒸汽直接滅菌后排放。2、發(fā)酵罐染菌的處理前期染菌：污染的菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害大，蒸汽滅菌后放掉；污染的菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害不大，重新滅菌重新接種；污染的菌少，且生長慢，繼續(xù)運(yùn)行，并進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)的控制。中后期染菌：加殺菌劑；培養(yǎng)溫度或控制補(bǔ)料量來控制染菌的生長速度。如產(chǎn)品含量達(dá)到一定值可以放罐。3、染菌后設(shè)備處理用化學(xué)物質(zhì)處理（如甲醛熏蒸）或徹底清洗，再用蒸汽滅菌（120℃，30min以上）。第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)染菌的途徑及預(yù)防措施（p190-198）（一）種子帶菌的原因及防治（二）無菌空氣帶菌及防治（三）設(shè)備滲漏或設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治（四）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治（五）操作問題第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）種子帶菌的原因及防治1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底2、菌種在移接過程中受污染3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底原因：菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在殺菌鍋中進(jìn)行，造成滅菌不徹底的原因是滅菌鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時(shí)溫度達(dá)不到要求。防止方法：滅菌時(shí)鍋內(nèi)排氣完全。第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、菌種在移接過程中受污染原因：當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)，或無菌室管理不嚴(yán)，就可能引起污染。防止方法：合理設(shè)計(jì)無菌室，嚴(yán)格無菌室管理制度，嚴(yán)格無菌操作接種。第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染原因：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污染。防止：試管的棉塞應(yīng)有一定的松緊度，不宜太松且有一定的長度；培養(yǎng)和保藏溫度變化不宜太大；每一級(jí)種子經(jīng)檢查合格后才能使用。第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）無菌空氣帶菌及防治在好氧發(fā)酵中通入的無菌空氣帶菌是發(fā)酵污染菌的主要原因之一防止：空氣凈化流程和設(shè)備的設(shè)計(jì)要合理，過濾介質(zhì)的選用和裝填過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面都要適用、有效、合理。第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日（三）設(shè)備滲漏或設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治1、設(shè)備滲漏引起的染菌及防治發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、磨擦和振動(dòng)等原因，往往造成滲漏，從而引起染菌。防治辦法：選用優(yōu)質(zhì)材料，并經(jīng)常進(jìn)行檢查。如冷卻蛇管的微小滲漏不易被發(fā)現(xiàn)，可以壓入堿性水，在可疑的地方，用浸濕的酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時(shí)白布即顯紅色。第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治“死角”：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該達(dá)到的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的要求。這些部位即為“死角”。其防治：主要從清洗和滅菌來防治?！八澜恰笨梢允窃O(shè)備、管道的某一部位，也可以是培養(yǎng)基或其它物料的某一部分，如發(fā)酵罐中可存在許多死角。（1）不銹鋼襯里破裂形成“死角”。（2）發(fā)酵罐底部培養(yǎng)基的沉積污垢形成“死角”。（4）管道轉(zhuǎn)彎處形成的“死角”。（5）法蘭連接不當(dāng)造成“死角”。第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日（四）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治1、原料性狀稀薄的培養(yǎng)基易滅菌徹底；而淀粉質(zhì)原料特別是有顆粒時(shí)易滅菌不徹底或是升溫過快或混合不均時(shí)，易結(jié)塊，使中心部位在滅菌時(shí)“夾生”，導(dǎo)致在發(fā)酵過程中團(tuán)塊散開而染菌。防止措施：淀粉質(zhì)培養(yǎng)基以實(shí)罐滅菌為好，在升溫時(shí)先攪拌均勻，并加入一定量的a－淀粉酶進(jìn)行液化，并將原料大顆粒篩去。第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣此種情況造成“假壓”使罐頂局部溫度達(dá)不到滅菌要求，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染。防止措施：在實(shí)罐滅菌升溫時(shí)，應(yīng)打開排氣閥門有關(guān)相連接管的邊閥、壓力表接管邊閥等，使蒸汽通氣達(dá)到徹底滅菌。3、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時(shí)蒸汽壓力波動(dòng)大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底而受污染。防止措施：培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制滅菌溫度，最好采用自動(dòng)控制裝置。第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日（五）操作問題在發(fā)酵過程中由于操作不當(dāng)而引起雜菌污染：如移種時(shí)或發(fā)酵過程，罐內(nèi)壓力跌零，使外界空氣進(jìn)入而染菌；泡沫頂蓋而造成污染；壓縮空氣壓力突然下降，使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成污染等等。防止措施：科學(xué)嚴(yán)密的管理，加強(qiáng)工人技術(shù)培訓(xùn)和責(zé)任心的教育，提高工人的素質(zhì)。第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第五節(jié)噬菌體染菌及防治（p198）（一）噬菌體的污染（二）噬菌體的檢查方法（三）噬菌體污染原因及防治措施第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）噬菌體的污染1、噬菌體的污染在發(fā)酵生產(chǎn)中常會(huì)遇到噬菌體（bacteriaphage）污染，引起溶菌，并隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止發(fā)酵等異?，F(xiàn)象。尤其是利用細(xì)菌或放線菌進(jìn)行的發(fā)酵易受噬菌體的污染，由于噬菌體的感染率非常強(qiáng)，傳播蔓延迅速，且較難防治，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)有很大的威脅。第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、噬菌體污染的特征（1）發(fā)酵液光密度上升緩慢，甚至下降，肉眼可見發(fā)酵液逐漸變清。（2）耗糖速度緩慢或停止，產(chǎn)物生成量少，發(fā)酵液中殘?zhí)歉摺＃?）產(chǎn)生大量泡沫，發(fā)酵液呈粘稠狀。（4）菌體不規(guī)則，甚至出現(xiàn)畸形。第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、噬菌體污染的途徑噬菌體的直徑約0.1μm，可通過環(huán)境污染、設(shè)備滲漏或“死角”、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底、補(bǔ)料過程及操作失誤、菌種帶進(jìn)噬菌體或本身是病原性菌株等途徑使發(fā)酵染菌。在實(shí)際生產(chǎn)中，常由于空氣的傳播使噬菌體潛入發(fā)酵的各個(gè)環(huán)節(jié)，而造成污染。第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）噬菌體的檢查方法

1、雙層瓊脂平板法（1）雙層瓊脂平板的制備：上層培養(yǎng)基中加入0.2mL發(fā)酵菌種懸液和0.1mL待檢發(fā)酵液；（2）在發(fā)酵菌的適宜溫度下培養(yǎng)；（3）檢查有無透明的噬菌斑。2、液體培養(yǎng)檢查法將培養(yǎng)基、發(fā)酵菌種及待檢發(fā)酵液三者混合，培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)液是否變清。

第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、斑點(diǎn)試驗(yàn)法先制備好涂布有發(fā)酵菌種的平板，再用接種環(huán)或無菌吸管取少許發(fā)酵液在平板上點(diǎn)種，培養(yǎng)后，觀察是否有噬菌斑。

4、玻片快速法