新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件

第二章蛋白質(zhì)和主要必需

氨基酸的測(cè)定第二章蛋白質(zhì)和主要必需

氨基酸的測(cè)定1第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是植物的重要組成成分，也是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)中最重要的成分。它的含量依作物種類、部位、生育時(shí)期、品種特性而有變化。植物各部位器官中蛋白質(zhì)含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆類可達(dá)45％-55％，其次是花、葉、莖和根。作物在不同的生育階段根部位吸收的氮，不斷向新生組織輸送，在接近成熟時(shí)期，莖葉中的氮向貯存器官輸送，合成的蛋白質(zhì)集中于種子中。

第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是植物的重要組成成分，也是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)中最重2各種農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量水平（%）

作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(仁)棉籽(仁)小麥黑麥15.0~30.524.6~34.122.0~34.027.0~35.029.4~50.42.0~30.821.1~30.228.6~42.019.3~30.014.4~24.1大麥燕麥稻米玉米小米(仁)高梁蕎麥(仁)10.6~20.48.0~17.37.8~14.59.0~13.210.2~21.59.5~15.312.8~19.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜番茄0.7~2.71.0~1.50.7~1.40.6~1.20.6~1.91.9~2.86.72.31.3~3.60.3~0.8茄辣椒南瓜黃瓜甘藍(lán)花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.6~1.20.7~1.10.4~1.00.5~0.91.2~2.62.40.3~1.916.1~28.912.4~17.54.0~7.5各種農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量水平（%）作物蛋白質(zhì)作物蛋白質(zhì)作物3蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。測(cè)定植物各部分中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)其品質(zhì)鑒定、品種選育、改善作物生育條件和調(diào)節(jié)作物體內(nèi)新陳代謝和提高蛋白質(zhì)含量等有重要意義。對(duì)產(chǎn)品加工方式及其產(chǎn)品質(zhì)量有影響。在育種、食品和飼料等工作中常常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

為什么要測(cè)定蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)4氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。氨基酸的分析測(cè)定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸兩種?！暗谝?、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人類和動(dòng)物自身無(wú)法合成，須從食物中直接吸收。氨基酸的含量是衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。為什么要測(cè)定氨基酸？氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。為什么要5蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類：

(1)利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量；

(2)利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸(堿)性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。最常用的方法是開(kāi)氏（凱氏）法——測(cè)定含氮量。粗蛋白質(zhì)：開(kāi)氏法測(cè)定結(jié)果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白質(zhì)氮，故稱“粗蛋白質(zhì)”純蛋白質(zhì)：開(kāi)氏法測(cè)定中，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測(cè)定6籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)蛋白質(zhì)測(cè)定方法介紹籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定方法介紹7一、籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定

H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（開(kāi)氏法）方法原理：植物中的蛋白質(zhì)含量基本上是不變的?？捎瞄_(kāi)氏法消煮定氮，再將測(cè)得的含氮值乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得粗蛋白質(zhì)含量。換算系數(shù)：平均6.25——蛋白質(zhì)平均含氮16%，不同植物籽粒換算系數(shù)見(jiàn)P286表14-2。一、籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定H2SO4-K2SO4-CuS8注意問(wèn)題籽粒樣品在開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的。因此，蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，然后用開(kāi)氏分解測(cè)定總氮量，同時(shí)用離子電極法測(cè)定硝態(tài)氮的含量，再?gòu)目偟繙p去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。注意問(wèn)題籽粒樣品在開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的9開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾(J.Kjeldahl)于1883年用來(lái)研究蛋白質(zhì)變化的，后來(lái)被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。設(shè)備簡(jiǎn)單易得，結(jié)果可靠，為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。至今尚無(wú)別的方法能與其比擬或?qū)⑵淙〈?。因此?guó)際谷物化學(xué)協(xié)會(huì)(ICC)和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)以及我國(guó)都把開(kāi)氏法作為標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。開(kāi)氏法介紹開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾(J.Kjeld10開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾于1883年用來(lái)研究蛋白質(zhì)變化的，后來(lái)被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。開(kāi)氏定氮法：(Kjeldahldetermination)：在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并為過(guò)量的酸液（硼酸）吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，即可計(jì)算出樣品中的氮量。開(kāi)氏法介紹有機(jī)氮銨鹽NH3NH4+開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾于1883年用來(lái)11新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件12開(kāi)氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用較高。近年已出現(xiàn)幾種以開(kāi)氏法原理為基礎(chǔ)的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開(kāi)氏定氮儀。瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開(kāi)氏1030分析儀(KjeltecAuto1030Analyzer)、日本生產(chǎn)的kjel-Auto自動(dòng)氮和蛋白質(zhì)分析儀和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel—FOSS自動(dòng)蛋白質(zhì)分析儀等。開(kāi)氏法介紹開(kāi)氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用13新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件14二、儀器設(shè)備消煮爐或電爐消煮管(或開(kāi)氏瓶)100mL或50mL半微量定氮裝置半微量滴定管二、儀器設(shè)備消煮爐或電爐15三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3BO3

(分析純)20g溶于1L水中。每升H3BO3溶液加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑20mL，并用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)至紫紅色(pH=4.5)。0.01mol·L

-1(1/2H2SO4)或0.02mol·L

-1

HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液。其他試劑同第四章(土壤全氮的測(cè)定)。三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3B16(1)樣品的消煮

稱取烘干樣品(過(guò)0.25mm篩)0.3000~0.5000g置于50mL或100mL開(kāi)氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤(rùn)后，加5mL濃H2SO4，小心輕搖后(最好加塞放置過(guò)夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐上，開(kāi)始時(shí)用小火加熱，待消煮液呈棕色時(shí)，可提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍(lán)色時(shí)，再加熱約10min，取下冷卻至溫?zé)釙r(shí)，將消煮液無(wú)損地轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后定容并放置澄清。

四、操作步驟(1)樣品的消煮四、操作步驟17新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件18（2）氮的測(cè)定用移液管吸取澄清待測(cè)液5.00或10.00mL放入半微量定氮儀中進(jìn)行定氮。同時(shí)作空白試驗(yàn)和核對(duì)試驗(yàn)。

見(jiàn)教材P46四、操作步驟（2）氮的測(cè)定見(jiàn)教材P46四、操作步驟19凱氏定氮儀半自動(dòng)凱氏定氮儀半自動(dòng)20新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件21氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16%為根據(jù)導(dǎo)出的值，但不同植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)也稍有不同，P286。以定量蛋白質(zhì)為目的的總氮量測(cè)定中，開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開(kāi)氏分解測(cè)定總氮量;同時(shí)用其他方法測(cè)定硝態(tài)氮的含量，再?gòu)目偟繙p去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。

注意問(wèn)題氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均22本法測(cè)定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量。如要測(cè)定純蛋白質(zhì)的含量，則樣品應(yīng)先用蛋白質(zhì)沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、200g·L-1~250g·L-1單寧或100g·L-1三氯乙酸等處理，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)，再測(cè)定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)即可得：“純蛋白質(zhì)”量。注意問(wèn)題本法測(cè)定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量。注意問(wèn)題23

方法原理

蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH=2～3的酸性緩沖液體系中呈陽(yáng)離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質(zhì)如橘黃G等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò)合物而沉淀下來(lái)，通過(guò)測(cè)定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計(jì)算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)方法原理二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC24主要儀器試劑操作步驟結(jié)果計(jì)算參見(jiàn)教材P286二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)主要儀器二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)25該法是間接測(cè)定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法的相關(guān)性較好，但準(zhǔn)確性較差，適用于大批同類樣品的篩選工作。不適用隨意混合物的樣品的測(cè)定。如在篩選同種作物種子的大批樣品時(shí)，不必知道蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，只要測(cè)定樣品的染料結(jié)合量即可進(jìn)行比較。注意問(wèn)題該法是間接測(cè)定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法26方法原理

蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)，具有類似于雙縮脲的反應(yīng)基團(tuán)。在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶性絡(luò)合物，蛋白質(zhì)含肽鍵多時(shí)反應(yīng)呈紫色，反之肽鍵少時(shí)，反應(yīng)呈紅色。這種顏色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(或稱縮二脲反應(yīng))。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)溶液濃度在1-15mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系。故可用此反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定。三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)方法原理三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)27樣品處理與測(cè)定

參見(jiàn)教材P289。三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)樣品處理與測(cè)定三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)28適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質(zhì)測(cè)定。一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質(zhì)的分析，因?yàn)樗环€(wěn)定，而且會(huì)浸出有色物質(zhì)、脂肪及一些淀粉物質(zhì)，干擾比色測(cè)定。而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質(zhì)的溶解，排除干擾。本法對(duì)溫度及時(shí)間的要求嚴(yán)格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫20-25℃，須于120～190min內(nèi)比色；40℃為15-70min顯色穩(wěn)定；而在60℃連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應(yīng)時(shí)間縮短為5min。注意問(wèn)題適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質(zhì)測(cè)定。注意問(wèn)題29第三節(jié)氨基酸的測(cè)定氨基酸分析方法包括測(cè)定氨基酸的總含量及測(cè)定全氨基酸中每種氨基酸的含量?jī)蓚€(gè)方面。測(cè)定氨基酸總量的方法與蛋白質(zhì)分析有密切的關(guān)系。許多測(cè)定蛋白質(zhì)含氮含量的方法如開(kāi)氏定氮法及各種比色法均可用于測(cè)定氨基酸的總含量。測(cè)定氨基酸總含量的方法還有甲醛滴定法，方法簡(jiǎn)單，快速，廣泛應(yīng)用于實(shí)際工作中。

第三節(jié)氨基酸的測(cè)定氨基酸分析方法包括測(cè)定氨基酸的總含量及測(cè)30全氨基酸：色譜法測(cè)定。薄層層析色譜法：60年代發(fā)展起來(lái)的分析方法，操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應(yīng)用于分離和測(cè)定氨基酸。氣相色譜法：氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，儀器的成本也比氨基酸自動(dòng)分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對(duì)映異構(gòu)物及超微量(ng)樣品中氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動(dòng)分析儀：應(yīng)用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是離子交換柱層析。第三節(jié)氨基酸的測(cè)定全氨基酸：色譜法測(cè)定。第三節(jié)氨基酸的測(cè)定31一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

——氨基酸分析儀法方法原理

氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當(dāng)流動(dòng)相(緩沖溶液)推動(dòng)氨基酸流經(jīng)裝有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的色譜柱時(shí)(磺酸型Na+柱)，氨基酸與樹(shù)脂中的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換，當(dāng)用不同的pH值的緩沖溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開(kāi)，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100℃下反應(yīng)生成紫色物質(zhì)茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，顯色（570nm）后的氨基酸由光度計(jì)檢測(cè)。一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

32氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀33(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。(2)胱氨酸及色氨酸的水解（鹽酸分解過(guò)程中破壞，需另行制備）。(3)植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。(4)上機(jī)測(cè)定。操作步驟(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。操作步驟34二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法

賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為第一限制氨基酸。對(duì)人體的作用：1．提高智力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)。2．增進(jìn)食欲、改善營(yíng)養(yǎng)不良狀況。3．改善失眠，提高記憶力。4．幫助產(chǎn)生抗體、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。5．幫助鈣的吸收，治療防止骨質(zhì)疏松癥6．降低血中甘油三酯的水平，預(yù)防心腦血管疾病的產(chǎn)生。二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

35賴氨酸在谷物貯存、加工過(guò)程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質(zhì)而破壞，變成營(yíng)養(yǎng)上的“無(wú)效”。測(cè)定方法：2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2,4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法(CNPY法)等。這類方法操作手續(xù)繁長(zhǎng)費(fèi)時(shí)，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。染料結(jié)合法-DBL法：國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的、簡(jiǎn)便易行。二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法賴氨酸在谷物貯存、加工過(guò)程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧36原理：染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的?；诒?，使其失去和染料結(jié)合的能力。然后分別測(cè)定?；昂蟮娜玖辖Y(jié)合量DBC值：?；暗臏y(cè)定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而?；笾皇墙M氨酸+精氨酸，以上兩項(xiàng)測(cè)定結(jié)果的差值，就可計(jì)算之賴氨酸的含量。

二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法原理：染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，37樣品處理：稱取已粉碎過(guò)60目篩酰化和不?；瘶悠犯鲀煞?，重量見(jiàn)下表。分別加30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標(biāo)明為A、B管(?；瘶悠?和C、D管(不?；瘶悠?。同時(shí)應(yīng)另稱樣品測(cè)定水分含量。樣品種類稱樣量（mg）?；瘶悠凡货；瘶悠匪钧滎惼胀ㄓ衩赘哔嚢彼嵊衩赘吡汗茸哟蠖蛊渌诡惢ㄉ氏蛉湛用拮?00或800500800700或5001000900180275300200125500或600400600400或50070070010017520015090樣品處理：稱取已粉碎過(guò)60目篩?；筒货；瘶悠犯鲀煞?，重量見(jiàn)38色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人與動(dòng)物的新陳代謝中起著重要的作用，某些代謝產(chǎn)物對(duì)人類的大腦功能及生長(zhǎng)發(fā)育影響很大，公認(rèn)為“第二限制性氨基酸”。預(yù)防糙皮病：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類缺乏色氨酸會(huì)患糙皮?。ㄆぱ祝Ｊ秤衩讜?huì)發(fā)生。調(diào)節(jié)情緒：色氨酸是腦部化學(xué)物質(zhì)5-羥色胺的重要前體，能幫助調(diào)節(jié)情緒。

改善睡眠：色氨酸生成的5-羥色胺，能改變睡眠持續(xù)時(shí)間。三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

——乙醛酸法色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人與動(dòng)物的新陳代謝中起著重39在我們所吃的食物中，每100克食物色氨酸含量較高的有：海蟹（含801毫克）豆腐皮（含715毫克）肉松（含710毫克）生西瓜子（含631毫克）黃豆（含485毫克）黑芝麻（含402毫克）全脂奶粉（含372毫克）生葵花子（含365毫克）。

三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

——乙醛酸法在我們所吃的食物中，每100克食物色氨酸含量較高的有：海蟹（40目前提出的測(cè)定方法很多，歸結(jié)起來(lái)有三類：一是找出一種理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一樣，且用離子交換色譜進(jìn)行測(cè)定；二是暴露具有反應(yīng)活性的吲哚環(huán)，然后與某些試劑反應(yīng)生成帶色化合物，進(jìn)行比色測(cè)定；三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，對(duì)色氨酸進(jìn)行分光光度或熒光測(cè)定。其中乙醛酸法具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

——乙醛酸法目前提出的測(cè)定方法很多，歸結(jié)起來(lái)有三類：三、谷物和飼料中色氨41方法原理谷物中蛋白質(zhì)經(jīng)木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在濃硫酸存在的情況下，F(xiàn)e3+可將乙酸氧化為乙醛酸，2mol色氨酸能與1mol乙醛酸縮合，產(chǎn)生hopkins-cole反應(yīng)，生成紅紫色的化合物，其紅紫色的強(qiáng)度與色氨酸的含量在一定范圍內(nèi)成正比，其最大的吸收峰在545nm，進(jìn)行比色測(cè)定。三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

——乙醛酸法Fe3+混合顯色劑方法原理谷物中蛋白質(zhì)經(jīng)木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在濃硫42主要儀器試劑操作步驟結(jié)果計(jì)算注意事項(xiàng)

見(jiàn)教材P298三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

——乙醛酸法主要儀器三、谷物和飼料中色氨酸的測(cè)定

43思考題1.什么是粗蛋白質(zhì)？如何測(cè)得純蛋白質(zhì)的含量？2.主要農(nóng)作物的蛋白質(zhì)換算系數(shù)是多少，為什么不同作物的籽粒其蛋白質(zhì)換算系數(shù)會(huì)有差異？3.含硝態(tài)氮高的樣品，如何測(cè)定其蛋白質(zhì)含量？4.為什么染料結(jié)合法、雙縮脲法能用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量？其方法原理，適用范圍是什么？為什么它們都不能直接測(cè)得蛋白質(zhì)的含量？5.氨基酸含量測(cè)定有哪些方法？思考題1.什么是粗蛋白質(zhì)？如何測(cè)得純蛋白質(zhì)的含量？44第二章蛋白質(zhì)和主要必需

氨基酸的測(cè)定第二章蛋白質(zhì)和主要必需

氨基酸的測(cè)定45第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是植物的重要組成成分，也是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)中最重要的成分。它的含量依作物種類、部位、生育時(shí)期、品種特性而有變化。植物各部位器官中蛋白質(zhì)含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆類可達(dá)45％-55％，其次是花、葉、莖和根。作物在不同的生育階段根部位吸收的氮，不斷向新生組織輸送，在接近成熟時(shí)期，莖葉中的氮向貯存器官輸送，合成的蛋白質(zhì)集中于種子中。

第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是植物的重要組成成分，也是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)中最重46各種農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量水平（%）

作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(仁)棉籽(仁)小麥黑麥15.0~30.524.6~34.122.0~34.027.0~35.029.4~50.42.0~30.821.1~30.228.6~42.019.3~30.014.4~24.1大麥燕麥稻米玉米小米(仁)高梁蕎麥(仁)10.6~20.48.0~17.37.8~14.59.0~13.210.2~21.59.5~15.312.8~19.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜番茄0.7~2.71.0~1.50.7~1.40.6~1.20.6~1.91.9~2.86.72.31.3~3.60.3~0.8茄辣椒南瓜黃瓜甘藍(lán)花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.6~1.20.7~1.10.4~1.00.5~0.91.2~2.62.40.3~1.916.1~28.912.4~17.54.0~7.5各種農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量水平（%）作物蛋白質(zhì)作物蛋白質(zhì)作物47蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。測(cè)定植物各部分中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)其品質(zhì)鑒定、品種選育、改善作物生育條件和調(diào)節(jié)作物體內(nèi)新陳代謝和提高蛋白質(zhì)含量等有重要意義。對(duì)產(chǎn)品加工方式及其產(chǎn)品質(zhì)量有影響。在育種、食品和飼料等工作中常常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

為什么要測(cè)定蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)48氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。氨基酸的分析測(cè)定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸兩種?！暗谝?、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人類和動(dòng)物自身無(wú)法合成，須從食物中直接吸收。氨基酸的含量是衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。為什么要測(cè)定氨基酸？氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。為什么要49蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類：

(1)利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量；

(2)利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸(堿)性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。最常用的方法是開(kāi)氏（凱氏）法——測(cè)定含氮量。粗蛋白質(zhì)：開(kāi)氏法測(cè)定結(jié)果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白質(zhì)氮，故稱“粗蛋白質(zhì)”純蛋白質(zhì)：開(kāi)氏法測(cè)定中，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測(cè)定50籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)蛋白質(zhì)測(cè)定方法介紹籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定方法介紹51一、籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定

H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（開(kāi)氏法）方法原理：植物中的蛋白質(zhì)含量基本上是不變的。可用開(kāi)氏法消煮定氮，再將測(cè)得的含氮值乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得粗蛋白質(zhì)含量。換算系數(shù)：平均6.25——蛋白質(zhì)平均含氮16%，不同植物籽粒換算系數(shù)見(jiàn)P286表14-2。一、籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定H2SO4-K2SO4-CuS52注意問(wèn)題籽粒樣品在開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的。因此，蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，然后用開(kāi)氏分解測(cè)定總氮量，同時(shí)用離子電極法測(cè)定硝態(tài)氮的含量，再?gòu)目偟繙p去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。注意問(wèn)題籽粒樣品在開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的53開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾(J.Kjeldahl)于1883年用來(lái)研究蛋白質(zhì)變化的，后來(lái)被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。設(shè)備簡(jiǎn)單易得，結(jié)果可靠，為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。至今尚無(wú)別的方法能與其比擬或?qū)⑵淙〈?。因此?guó)際谷物化學(xué)協(xié)會(huì)(ICC)和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)以及我國(guó)都把開(kāi)氏法作為標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。開(kāi)氏法介紹開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾(J.Kjeld54開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾于1883年用來(lái)研究蛋白質(zhì)變化的，后來(lái)被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。開(kāi)氏定氮法：(Kjeldahldetermination)：在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并為過(guò)量的酸液（硼酸）吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，即可計(jì)算出樣品中的氮量。開(kāi)氏法介紹有機(jī)氮銨鹽NH3NH4+開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開(kāi)道爾于1883年用來(lái)55新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件56開(kāi)氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用較高。近年已出現(xiàn)幾種以開(kāi)氏法原理為基礎(chǔ)的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開(kāi)氏定氮儀。瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開(kāi)氏1030分析儀(KjeltecAuto1030Analyzer)、日本生產(chǎn)的kjel-Auto自動(dòng)氮和蛋白質(zhì)分析儀和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel—FOSS自動(dòng)蛋白質(zhì)分析儀等。開(kāi)氏法介紹開(kāi)氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用57新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件58二、儀器設(shè)備消煮爐或電爐消煮管(或開(kāi)氏瓶)100mL或50mL半微量定氮裝置半微量滴定管二、儀器設(shè)備消煮爐或電爐59三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3BO3

(分析純)20g溶于1L水中。每升H3BO3溶液加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑20mL，并用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)至紫紅色(pH=4.5)。0.01mol·L

-1(1/2H2SO4)或0.02mol·L

-1

HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液。其他試劑同第四章(土壤全氮的測(cè)定)。三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3B60(1)樣品的消煮

稱取烘干樣品(過(guò)0.25mm篩)0.3000~0.5000g置于50mL或100mL開(kāi)氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤(rùn)后，加5mL濃H2SO4，小心輕搖后(最好加塞放置過(guò)夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐上，開(kāi)始時(shí)用小火加熱，待消煮液呈棕色時(shí)，可提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍(lán)色時(shí)，再加熱約10min，取下冷卻至溫?zé)釙r(shí)，將消煮液無(wú)損地轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后定容并放置澄清。

四、操作步驟(1)樣品的消煮四、操作步驟61新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件62（2）氮的測(cè)定用移液管吸取澄清待測(cè)液5.00或10.00mL放入半微量定氮儀中進(jìn)行定氮。同時(shí)作空白試驗(yàn)和核對(duì)試驗(yàn)。

見(jiàn)教材P46四、操作步驟（2）氮的測(cè)定見(jiàn)教材P46四、操作步驟63凱氏定氮儀半自動(dòng)凱氏定氮儀半自動(dòng)64新編-第2章蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定課件65氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16%為根據(jù)導(dǎo)出的值，但不同植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)也稍有不同，P286。以定量蛋白質(zhì)為目的的總氮量測(cè)定中，開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開(kāi)氏分解測(cè)定總氮量;同時(shí)用其他方法測(cè)定硝態(tài)氮的含量，再?gòu)目偟繙p去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。

注意問(wèn)題氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均66本法測(cè)定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量。如要測(cè)定純蛋白質(zhì)的含量，則樣品應(yīng)先用蛋白質(zhì)沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、200g·L-1~250g·L-1單寧或100g·L-1三氯乙酸等處理，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)，再測(cè)定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)即可得：“純蛋白質(zhì)”量。注意問(wèn)題本法測(cè)定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量。注意問(wèn)題67

方法原理

蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH=2～3的酸性緩沖液體系中呈陽(yáng)離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質(zhì)如橘黃G等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò)合物而沉淀下來(lái)，通過(guò)測(cè)定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計(jì)算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)方法原理二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC68主要儀器試劑操作步驟結(jié)果計(jì)算參見(jiàn)教材P286二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)主要儀器二、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)69該法是間接測(cè)定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法的相關(guān)性較好，但準(zhǔn)確性較差，適用于大批同類樣品的篩選工作。不適用隨意混合物的樣品的測(cè)定。如在篩選同種作物種子的大批樣品時(shí)，不必知道蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，只要測(cè)定樣品的染料結(jié)合量即可進(jìn)行比較。注意問(wèn)題該法是間接測(cè)定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法70方法原理

蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)，具有類似于雙縮脲的反應(yīng)基團(tuán)。在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶性絡(luò)合物，蛋白質(zhì)含肽鍵多時(shí)反應(yīng)呈紫色，反之肽鍵少時(shí)，反應(yīng)呈紅色。這種顏色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(或稱縮二脲反應(yīng))。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)溶液濃度在1-15mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系。故可用此反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定。三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)方法原理三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)71樣品處理與測(cè)定

參見(jiàn)教材P289。三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)樣品處理與測(cè)定三、同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)72適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質(zhì)測(cè)定。一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質(zhì)的分析，因?yàn)樗环€(wěn)定，而且會(huì)浸出有色物質(zhì)、脂肪及一些淀粉物質(zhì)，干擾比色測(cè)定。而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質(zhì)的溶解，排除干擾。本法對(duì)溫度及時(shí)間的要求嚴(yán)格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫20-25℃，須于120～190min內(nèi)比色；40℃為15-70min顯色穩(wěn)定；而在60℃連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應(yīng)時(shí)間縮短為5min。注意問(wèn)題適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質(zhì)測(cè)定。注意問(wèn)題73第三節(jié)氨基酸的測(cè)定氨基酸分析方法包括測(cè)定氨基酸的總含量及測(cè)定全氨基酸中每種氨基酸的含量?jī)蓚€(gè)方面。測(cè)定氨基酸總量的方法與蛋白質(zhì)分析有密切的關(guān)系。許多測(cè)定蛋白質(zhì)含氮含量的方法如開(kāi)氏定氮法及各種比色法均可用于測(cè)定氨基酸的總含量。測(cè)定氨基酸總含量的方法還有甲醛滴定法，方法簡(jiǎn)單，快速，廣泛應(yīng)用于實(shí)際工作中。

第三節(jié)氨基酸的測(cè)定氨基酸分析方法包括測(cè)定氨基酸的總含量及測(cè)74全氨基酸：色譜法測(cè)定。薄層層析色譜法：60年代發(fā)展起來(lái)的分析方法，操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應(yīng)用于分離和測(cè)定氨基酸。氣相色譜法：氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，儀器的成本也比氨基酸自動(dòng)分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對(duì)映異構(gòu)物及超微量(ng)樣品中氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動(dòng)分析儀：應(yīng)用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是離子交換柱層析。第三節(jié)氨基酸的測(cè)定全氨基酸：色譜法測(cè)定。第三節(jié)氨基酸的測(cè)定75一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

——氨基酸分析儀法方法原理

氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當(dāng)流動(dòng)相(緩沖溶液)推動(dòng)氨基酸流經(jīng)裝有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的色譜柱時(shí)(磺酸型Na+柱)，氨基酸與樹(shù)脂中的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換，當(dāng)用不同的pH值的緩沖溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開(kāi)，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100℃下反應(yīng)生成紫色物質(zhì)茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，顯色（570nm）后的氨基酸由光度計(jì)檢測(cè)。一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

76氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀77(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。(2)胱氨酸及色氨酸的水解（鹽酸分解過(guò)程中破壞，需另行制備）。(3)植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。(4)上機(jī)測(cè)定。操作步驟(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。操作步驟78二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法

賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為第一限制氨基酸。對(duì)人體的作用：1．提高智力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)。2．增進(jìn)食欲、改善營(yíng)養(yǎng)不良狀況。3．改善失眠，提高記憶力。4．幫助產(chǎn)生抗體、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。5．幫助鈣的吸收，治療防止骨質(zhì)疏松癥6．降低血中甘油三酯的水平，預(yù)防心腦血管疾病的產(chǎn)生。二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

79賴氨酸在谷物貯存、加工過(guò)程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質(zhì)而破壞，變成營(yíng)養(yǎng)上的“無(wú)效”。測(cè)定方法：2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2,4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法(CNPY法)等。這類方法操作手續(xù)繁長(zhǎng)費(fèi)時(shí)，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。染料結(jié)合法-DBL法：國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的、簡(jiǎn)便易行。二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法賴氨酸在谷物貯存、加工過(guò)程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧80原理：染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的?；诒危蛊涫ズ腿玖辖Y(jié)合的能力。然后分別測(cè)定?；昂蟮娜玖辖Y(jié)合量DBC值：?；暗臏y(cè)定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而?；笾皇墙M氨酸+精氨酸，以上兩項(xiàng)測(cè)定結(jié)果的差值，就可計(jì)算之賴氨酸的含量。

二、谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定

——染料結(jié)合法-DBL法原理：染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣