肺癌開題報(bào)告-課件

黃芪對(duì)肺癌小鼠模型的干預(yù)機(jī)制研究

導(dǎo)師:孫廣仁教授學(xué)生：黃芪對(duì)肺癌小鼠模型的干預(yù)機(jī)制研究導(dǎo)師:孫廣仁教授1選題依據(jù)選題目的：通過(guò)建立小鼠肺癌模型，探討黃芪對(duì)肺癌的抑制和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，以期在臨床上能有效的運(yùn)用黃芪對(duì)肺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立肺癌小鼠肺模型，觀察黃芪對(duì)小鼠生存時(shí)間，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對(duì)小鼠腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機(jī)制研究黃芪對(duì)小鼠肺癌的作用機(jī)制，為臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。選題依據(jù)選題目的：2選題意義根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國(guó)腫瘤發(fā)病率和十大惡性腫瘤發(fā)病率排序顯示，肺癌居男性惡性腫瘤發(fā)病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌[2]。2000年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料表明，每年全球的肺癌新發(fā)病例位1.2百萬(wàn)，占全部惡性腫瘤的12.3％，死亡1.1百萬(wàn)，占腫瘤全部死因的17.8％。更為嚴(yán)重的是，凡是煙草消費(fèi)大國(guó)，其肺癌新發(fā)病率乃在不斷增長(zhǎng)，成為越來(lái)越嚴(yán)重的危害人民生命和健康的常見疾病[3]。原發(fā)性肺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家的主要腫瘤，以美國(guó)為例，1997年全美國(guó)肺癌的發(fā)生數(shù)男性為98300例，女性為79800例，分別是男女腫瘤發(fā)病率第二位。1997年因肺癌死亡的人數(shù)為160400人，居惡性腫瘤死亡率第1位，占全美國(guó)腫瘤死亡病人的29％[4]。選題意義根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國(guó)腫瘤3中醫(yī)藥在治療肺癌上有其自己的優(yōu)勢(shì)，近幾年來(lái)應(yīng)用辨證論治、專方、專藥及新藥新劑型等方法治療肺癌均有一定的進(jìn)展，在穩(wěn)定病灶、改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等方面都具有一定的療效和優(yōu)勢(shì)。因此研究中醫(yī)藥在肺癌治療中的作用有其很高的應(yīng)用價(jià)值，能更好的服務(wù)于臨床中肺癌的治療。肺癌屬“肺積”、“息責(zé)”等范疇，屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“咳嗽”、“咯血”、“肺積”，這與肺癌的臨床表現(xiàn)有相似之處。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌是由于人體正氣不足，尤其是肺脾腎虛損，再加上六淫和七情等因素長(zhǎng)期作用，導(dǎo)致肺氣不足，肺陰虧虛，升降失調(diào)，氣血瘀滯，內(nèi)結(jié)于肺，形成積塊而發(fā)生的[6]。中醫(yī)藥在治療肺癌上有其自己的優(yōu)勢(shì)，近幾年來(lái)應(yīng)用辨證論治、專方4本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎(chǔ)上用黃芪對(duì)該病進(jìn)行治療，通過(guò)觀察小鼠的一般情況，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對(duì)荷瘤小鼠腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機(jī)制研究黃芪對(duì)小鼠肺癌的作用機(jī)制。預(yù)期成果不僅可為防治該病證提供新思路和理論依據(jù)，指導(dǎo)臨床對(duì)肺癌的預(yù)防、治療和康復(fù)，同時(shí)為的深層次機(jī)制和研究中藥微觀作用機(jī)制的研究進(jìn)行資料積累，提供新思路和理論支撐。本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎(chǔ)上用黃芪對(duì)該病進(jìn)行5課題設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容與研究方法：以小鼠轉(zhuǎn)移肺癌模型為研究對(duì)象，采用中西藥對(duì)比進(jìn)行治療，動(dòng)態(tài)觀察小鼠的體重改變、抑瘤率的比較、肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細(xì)胞因子的變化，從細(xì)胞分子水平闡釋這些變化，及黃芪和紫杉醇對(duì)肺癌的作用的相關(guān)性，觀察探討黃芪對(duì)肺癌的干預(yù)作用的動(dòng)態(tài)變化及時(shí)效性，為防治肺癌提供新思路和理論依據(jù)。課題設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容與研究方法：6技術(shù)路線動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.肺癌的臨床診斷：肺癌的臨床診斷必須依據(jù)臨床表現(xiàn)和各種影像結(jié)果進(jìn)行綜合分析，但最后的確診必須取得細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)的證據(jù)。任何沒有病理學(xué)或病理組織學(xué)證據(jù)的診斷，都不能為最后的診斷結(jié)果。依據(jù)這樣的原則，肺癌的診斷可分為肺癌的定位診斷和肺癌的定性診斷兩種，所有的影像學(xué)診斷法方可認(rèn)為是定位診斷，而所有以獲取細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)為目的的診斷科認(rèn)為是定性診斷。定位診斷是基礎(chǔ)，定性診斷是關(guān)鍵。技術(shù)路線動(dòng)物實(shí)驗(yàn)72.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，無(wú)菌操作，取肺癌瘤小鼠腹水，稀釋至含瘤細(xì)胞2×1010/L，置冰上，每小鼠右腋皮下接種0.2ml，分別給模型組、中藥組和西藥組接種。接種次日24h后進(jìn)行藥物抑藥瘤試驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組和模型對(duì)照組，中藥組和西藥組。模型對(duì)照組中，每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，中藥組中每只小鼠腹灌胃0.4ml，100mg/ml。西藥對(duì)照組中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml，20mg/ml。每只小鼠每天用藥1次，連續(xù)用藥15天，停藥次日處死小鼠，剝離腫瘤，稱體重及瘤重，計(jì)算抑瘤率。2.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級(jí)動(dòng)物8（2）藥物干預(yù)階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥物干預(yù)，以生理鹽水灌胃。中藥治療組小鼠黃芪煎湯灌胃。藥物制備：黃芪25g加8倍水，浸泡半小時(shí)，頭次煎煮半小時(shí)，濾出藥渣后加水至藥面以上3ml，再煎20分鐘。將兩次藥液混合、過(guò)濾，加壓濃縮至100%（即每毫升含生藥1.0g）的水提劑。用藥方法：將藥物按成人日服量換算，計(jì)算出小鼠日服量，每日對(duì)治療組小鼠灌服中藥煎劑0.4ml/100g體重，對(duì)空白組及肺癌模型組小鼠灌服生理鹽水0.4ml/100g體重。連續(xù)用藥15天，第16天處理所有小鼠。后脫頸處死小鼠,完整剖取接種的瘤塊,電子天平稱重，按公式:抑瘤率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。小鼠處死后，將整個(gè)肺取下。在雙盲條件下,計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶的數(shù)目，按公式:肺轉(zhuǎn)移抑制率=(空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目-給藥組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目)/空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目×100%。（2）藥物干預(yù)階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥93.檢測(cè)指標(biāo)（1）整體觀測(cè)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠癥狀、體重、生存時(shí)間、呼吸、被毛情況、食量、飲水量，胸腔，縱膈，胸水。（2）瘤體重測(cè)定：小鼠處死后，去腫瘤組織，精密電子天平稱重。（3）血生化指標(biāo)檢測(cè)：小鼠腹主動(dòng)脈取血，以ELISA法測(cè)定、TNF-α的含量，放免法測(cè)定血漿中MMP-9的含量（4）瘤組織處理：腫瘤組織用福爾馬林液充分固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察期組織學(xué)變化。肺組織用福爾馬林固定12h,進(jìn)行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察讀片,以進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)及特征。3.檢測(cè)指標(biāo)（1）整體觀測(cè)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠癥狀、體重104.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異，均用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分11技術(shù)路線圖SPF級(jí)昆明級(jí)小鼠55只隨機(jī)分組空白組10只模型組15只中藥組15只實(shí)驗(yàn)全過(guò)程觀察小鼠的體重、一般情況、生存時(shí)間、胸腔、縱隔、胸水腫瘤接種血生化指標(biāo)檢測(cè)：TNF-α、MMP-9的蛋白表達(dá)肺組織切片：肺病理觀察瘤體重的測(cè)定14天后停止用藥西藥組15只24h后開始用藥，模型組用生理鹽水，中藥組用黃芪，西藥組用紫杉醇技術(shù)路線圖SPF級(jí)昆明級(jí)小鼠55只隨機(jī)分組空白組10只模型組12可行性分析1．根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而化生萬(wàn)物矣”，“五氣入鼻，藏于心肺”，“肺者，氣之本?！?，“諸氣者，皆屬于肺。”等論述，腫瘤的病因不外乎內(nèi)因和外因兩個(gè)方面?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。所以肺癌的發(fā)生也不外乎是氣虛所致。以此采用以補(bǔ)氣為主的黃芪治療。肺癌的發(fā)生與人體的免疫力下降有很大的關(guān)系，而現(xiàn)代的藥理研究顯示黃芪具有提高人體免疫力的作用，故采用黃芪干預(yù)肺癌的形成機(jī)制是可行的。所以理論上通過(guò)腫瘤種植建立轉(zhuǎn)移性肺癌的造模方法，建立肺癌的模型是可行的?？尚行苑治?．根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而132．實(shí)驗(yàn)方法：本課題針對(duì)中醫(yī)對(duì)腫瘤的病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，在建立肺癌小鼠模型的基礎(chǔ)上，并對(duì)模型進(jìn)行了病理檢查、炎癥因子等方面的檢測(cè)以及方藥驗(yàn)證。研究的思路和方法注重中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和相應(yīng)對(duì)策也是從中醫(yī)學(xué)中氣的本源出發(fā)，立足于病藥相應(yīng)的原則。3．實(shí)施保障：我們依托于山東中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，屬國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，為開放實(shí)驗(yàn)室，具備完成該項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)條件和所用儀器設(shè)備基本能夠滿足，實(shí)驗(yàn)室操作人員經(jīng)驗(yàn)豐富，具體實(shí)驗(yàn)操作熟練，預(yù)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目的預(yù)期目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中所涉及到的材料和試劑均為商品，在國(guó)內(nèi)能夠買到。2．實(shí)驗(yàn)方法：本課題針對(duì)中醫(yī)對(duì)腫瘤的病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)14本課題特色、預(yù)期取得的結(jié)果創(chuàng)新點(diǎn)：1．采用中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相比較的治療的方法，在肺癌病因和臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，用直接種植腫瘤的辦法建立轉(zhuǎn)移性肺癌的小鼠模型。2．在肺癌小鼠模型建立的基礎(chǔ)上用單味中藥黃芪和紫杉醇相比較對(duì)該病證進(jìn)行對(duì)照治療，分析小鼠肺改變，明確肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細(xì)胞因子的變化規(guī)律，從微觀角度闡釋該病證在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，并初步明確藥物的作用機(jī)制或作用靶點(diǎn)。3．該課題觀察肺癌小鼠模型在黃芪的干預(yù)下的變化，以評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性和確定中藥干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)，具有創(chuàng)新性。本課題特色、預(yù)期取得的結(jié)果創(chuàng)新點(diǎn)：15國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)1．小鼠肺癌模型研究概況目前常用的小鼠肺癌動(dòng)物模型有：（1）將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。（2）將小鼠的氣管分離，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理，然后將肺癌細(xì)胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后[12]，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下。（3）切開胸壁皮膚，將肺癌細(xì)胞或肺癌組織直接種植到肺內(nèi)[13-14]。此方法有一定的創(chuàng)傷性和死亡率，肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)在肺實(shí)質(zhì)內(nèi)，但只能使70%-90%的接種小鼠產(chǎn)生腫瘤，對(duì)進(jìn)行進(jìn)一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細(xì)胞直接注入重度復(fù)合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細(xì)支氣管內(nèi)的肺癌模型[15]。國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)1．小鼠肺癌模型研究概況16有學(xué)者采用將人類癌組織或腫瘤細(xì)胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨床特征，但是其技術(shù)要求較高，成功率較低[8-9]。也有人采用外科手術(shù)移植方法，同樣也是成功率低于10%[10]。彭鵬[11]采用清潔級(jí)小鼠C57BL/6小鼠的腋后線第6肋間胸腔(胸腔模型組)或小鼠腋部皮下（皮下模型組）分別移植鼠源性Lewis肺癌細(xì)胞0.2ml可作為晚期肺癌動(dòng)物模型。。有學(xué)者采用將人類癌組織或腫瘤細(xì)胞懸液直接植入支氣管的方法，可17現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)移性肺癌動(dòng)物模型有：①將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。②將小鼠的氣管分離,經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理,然后將肺癌細(xì)胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下[21]。③胸壁皮膚，將肺癌細(xì)胞或肺癌組織直接種植到肺臟內(nèi)[22，23]。也有經(jīng)靜脈注射或心室內(nèi)注射等，建立肺癌轉(zhuǎn)移模型。現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)移性肺癌動(dòng)物模型有：①將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他182．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據(jù)病人的身體情況及肺癌的類型和分期采取不同的治療方案。一般而言，非小細(xì)胞肺癌采取手術(shù)為主的綜合治療，小細(xì)胞肺癌則采用以化療放療為主的綜合治療[3]。在化療方面，臨床上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種化療方案。小細(xì)胞癌被列入有可能用化療治愈的疾病，目前的標(biāo)準(zhǔn)化療方案是CAV(環(huán)磷酰胺CTX，阿霉素ADR，長(zhǎng)春新堿VCR)和EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療不敏感，常用的化療方案有EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）NP（去長(zhǎng)春花堿NVB,順鉑DDP）GP(吉西他濱GEM，順鉑和卡鉑Carboplatin）TP(紫杉醇TAX，順鉑和卡鉑Carboplatin）DP（多西紫杉醇DOP，順鉑和卡鉑Carboplatin）。并且21世紀(jì)惡性腫瘤一個(gè)重要的治療方向是分子靶向治療，目前應(yīng)用于肺癌的分子靶向藥物有表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼和埃羅替尼。這類藥物有一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)是靶人群，如吉非替尼對(duì)女性不吸煙的肺腺癌有特別的效果[3]。2．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據(jù)病人的身體情況及肺癌的19從中醫(yī)理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發(fā)生腫瘤。周延峰用消瘤方治療非小細(xì)胞肺癌顯示消瘤方能提高機(jī)體免疫功能，降低患者血液粘度，抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)突變性P53基因[27]。陳璐[7]指出補(bǔ)腎化癖解毒方藥對(duì)小鼠移植性肺癌及小鼠肺轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用并且補(bǔ)腎化癖解毒方藥能提高西藥順鉑(DDP)對(duì)兩者的抑制率。黃健飛[28]指出極低濃度的丹參注射液對(duì)荷瘤小鼠的移植瘤有明顯抑制作用，其余濃度的丹參注射液對(duì)荷瘤小鼠的移植瘤無(wú)明顯抑制作用，不同濃度的丹參注射液無(wú)明顯抑制荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移的作用，但低濃度和中濃度的丹參注射液能降低轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9的表達(dá)。李保國(guó)[29]指出復(fù)方紫杉醇注射液對(duì)移植于C57BL/6小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。裘維焰[30]等指出四君子湯與IFN-γ，合用時(shí)免疚調(diào)節(jié)作用有著明顯影響，并可提高抑瘤率。王立強(qiáng)[31]等指出蘆薈苦素是蘆薈抗腫瘤、抗白血病的有效成分之一。其抗腫瘤機(jī)制可能為促進(jìn)分裂中期微管聚集，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程和提高機(jī)體免疫力。從中醫(yī)理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發(fā)生腫瘤。周延峰用203．黃芪、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的變化癌的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段復(fù)雜的過(guò)程，不僅有外因，還有遺傳因素，免疫狀態(tài)等宿主因素。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，中國(guó)死于惡性腫瘤的前五位癌癥主要依次為：胃癌，肝癌，食管癌，肺癌，大腸癌[32]。目前每年全世界至少有700萬(wàn)人死于癌癥，我國(guó)約130萬(wàn)。因此21世紀(jì)攻克癌癥這一世界難題，具有十分重要的意義。3．黃芪、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的變化癌的發(fā)生是一個(gè)多21（1）黃芪現(xiàn)代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調(diào)節(jié)包括對(duì)抗免疫抑制劑、增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能、調(diào)整補(bǔ)體系統(tǒng)、提高紅細(xì)胞的免疫功能等方面作用。研究證實(shí)，黃芪能增加脾臟的重量、細(xì)胞數(shù)及抗體反應(yīng)，對(duì)抗由強(qiáng)的松造成的免疫抑制及由環(huán)磷酞胺造成的脾臟重量下降，并能提高“虛證”小鼠血漿cAMP含量，加速淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)T細(xì)胞功能，顯著提高E一玫瑰花結(jié)形成率，還有誘生和促誘生干擾素、增強(qiáng)NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性的功能。黃芪的有效成分黃芪多糖能提高抗體形成細(xì)胞數(shù)，抑制Ts細(xì)胞，其對(duì)正常人及腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外分泌腫瘤壞死因子具有明顯的促進(jìn)作用[32]。（1）黃芪現(xiàn)代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調(diào)節(jié)包括對(duì)抗免疫抑22黃芪免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為黃芪的作用多系整體調(diào)節(jié)的結(jié)果，即所謂“虛者補(bǔ)之，損者益之”。黃芪在生長(zhǎng)過(guò)程中從土壤中選擇性吸收硒，因而黃芪富含硒。硒對(duì)各種金屬如福、汞、甲基汞等一些化學(xué)致癌物質(zhì)有拮抗作用；硒是谷膚甘膚過(guò)氧化酶的一個(gè)組成部分，此酶可以保護(hù)細(xì)胞免受生物氧化過(guò)程的損害;硒還能抑制癌細(xì)胞的氧化磷酸化作用。最近一項(xiàng)對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠的研究顯示黃芪能顯著抑制過(guò)敏性哮喘豚鼠氣道壁細(xì)胞NF-kB的表達(dá)，此可為黃芪的作用機(jī)制之一[37]。此外黃芪總貳可使小鼠肝癌(HepA)和肉瘤(5180)細(xì)胞阻止于GO/G1期，并可誘導(dǎo)其凋亡[38]；使活化T淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加并增強(qiáng)鈣離子內(nèi)流的驅(qū)動(dòng)力[39]通過(guò)提高細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞再循環(huán)[40]。柏長(zhǎng)青等[41]指出黃芪提取物注射液能夠明顯降低肺癌患者化療期間常見毒副反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，改善患者化療期間的生存質(zhì)量。趙鐵華[42]等指出黃芪等中草藥具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。黃芪免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為黃芪的作用多系整23（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細(xì)胞分泌，局部注射TNF-α?xí)T導(dǎo)小鼠腫瘤壞死，因此被命名為腫瘤壞死因子（TNF）。TNF-α為一種重要的炎癥介質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等釋放，能激活中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等促進(jìn)炎癥顆粒釋放，而且還能與香煙煙霧、LPS等協(xié)同活化炎癥細(xì)胞的核因子-κB(NF-κB)系統(tǒng)，促使炎性細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄，從而合成炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-8、TNF-α等，而這些炎癥因子又可以反過(guò)來(lái)活化炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的合成及釋放炎性介質(zhì)。這就構(gòu)成了炎癥細(xì)胞-細(xì)胞因子之間的逐步放大環(huán)，促使炎癥慢性化。TNF-α最初是在移植腫瘤的小鼠血清中被發(fā)現(xiàn)的[43]。腫瘤壞死因子（TNF）是體內(nèi)具有多種生物活性的細(xì)胞因子，根據(jù)其來(lái)源不同可分為兩種，TNF-α和TNF-β。（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細(xì)胞24TNF-α水平升高可以促進(jìn)腫瘤血管新生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還激活金屬基質(zhì)蛋白酶等某些降解酶的活性，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[55-56]。有研究表明TNF-α表達(dá)的強(qiáng)弱與腫瘤細(xì)胞的分化程度，臨床分期有關(guān)[57-58]，但其機(jī)制尚不清楚。Selfart等[59]研究了117名肺癌患者（包括77名非小細(xì)胞肺癌患者和40名小細(xì)胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態(tài)性與對(duì)照組相比有顯著性差異，而小細(xì)胞肺癌組與對(duì)照組相比則無(wú)明顯差異。TNF-α水平升高可以促進(jìn)腫瘤血管新生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還25（3）基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶(martixmetalloproteinase，MMp)是一組具有相同功能、結(jié)構(gòu)高度同源、依賴鋅離子的內(nèi)肽酶的總稱，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜。在正常肺組織中ECM能維持肺泡結(jié)構(gòu)，其合成與降解保持動(dòng)態(tài)平衡以保證正常肺功能。平衡破壞時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生以肺結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鞯姆闻菁膊?，如肺癌、肺纖維化(IPF)等。基質(zhì)金屬蛋白酶具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，因此是腫瘤細(xì)胞向周圍生長(zhǎng)乃至向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要工具[60-61]，幾乎所有類型的人類腫瘤包括肺癌和食管癌中都有MMp尤其是MMP-l、MMP-2、MMP-3和MMP-9的高表達(dá)[62-66]。大多數(shù)MMP由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，但腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞也能產(chǎn)生MMP。研究表明，MMP高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展，癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移程度，病人的生存期等臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，是腫瘤病人預(yù)后的重要指標(biāo)之一[67-69]。（3）基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶(martixmetall26MMPs是一大組金屬離子依賴的蛋白酶，它能降解ECM中的各種蛋白成分。在肺癌的研究中，大多數(shù)結(jié)果顯示MMPS的過(guò)度表達(dá)與肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，尤其是MMp-2和MMP-9與肺癌關(guān)系密切[70]。MMPs在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程的機(jī)制：①降解ECM：由膠原、糖蛋白、蛋白多糖等構(gòu)成的EcM是細(xì)胞生存的重要內(nèi)環(huán)境，其中含有大量的細(xì)胞因子、砧附分子、蛋白酶等。MMP是降解ECM最重要的酶類，大量的研究證明MMP活性上調(diào)與許多實(shí)體瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[71-72]。②促進(jìn)新生血管形成：MMP在以下幾方面促進(jìn)血管形成：l)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)的能力；2)作為促進(jìn)血管形成的因子直接參與新生血管的形成；3)MMP通過(guò)提高促血管生成因子如VEGF、bFGF、TGF2a的作用，間接參與血管的形成；4)MMP降解ECM的作用，使細(xì)胞間質(zhì)的空隙增大，為腫瘤血管的形成提供有利的空間。③調(diào)節(jié)細(xì)胞間的勃附：MMP以及勃附分子的相互作用，改變了腫瘤細(xì)胞之間及宿主細(xì)胞之間的載附性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移MMPs是一大組金屬離子依賴的蛋白酶，它能降解ECM中的各種27綜上所述，國(guó)內(nèi)外雖然對(duì)黃芪和肺癌做了大量研究，積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，也指導(dǎo)了臨床的治療用藥。但迄今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道黃芪單味藥直接給肺癌的動(dòng)物模型灌胃研究。所以在小鼠肺癌模型的基礎(chǔ)上用黃芪和紫杉醇對(duì)其干預(yù)，并進(jìn)行比較，可為中醫(yī)藥治療提供肺癌提供理論依據(jù)，以提高臨床診治水平，并為研制預(yù)防和治療肺癌的中成藥搭建一個(gè)研究平臺(tái)，以便探索中藥的作用機(jī)制或作用靶點(diǎn)。綜上所述，國(guó)內(nèi)外雖然對(duì)黃芪和肺癌做了大量研究，積累了一定的經(jīng)28謝謝!謝謝!29黃芪對(duì)肺癌小鼠模型的干預(yù)機(jī)制研究

導(dǎo)師:孫廣仁教授學(xué)生：黃芪對(duì)肺癌小鼠模型的干預(yù)機(jī)制研究導(dǎo)師:孫廣仁教授30選題依據(jù)選題目的：通過(guò)建立小鼠肺癌模型，探討黃芪對(duì)肺癌的抑制和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，以期在臨床上能有效的運(yùn)用黃芪對(duì)肺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立肺癌小鼠肺模型，觀察黃芪對(duì)小鼠生存時(shí)間，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對(duì)小鼠腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機(jī)制研究黃芪對(duì)小鼠肺癌的作用機(jī)制，為臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。選題依據(jù)選題目的：31選題意義根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國(guó)腫瘤發(fā)病率和十大惡性腫瘤發(fā)病率排序顯示，肺癌居男性惡性腫瘤發(fā)病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌[2]。2000年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料表明，每年全球的肺癌新發(fā)病例位1.2百萬(wàn)，占全部惡性腫瘤的12.3％，死亡1.1百萬(wàn)，占腫瘤全部死因的17.8％。更為嚴(yán)重的是，凡是煙草消費(fèi)大國(guó)，其肺癌新發(fā)病率乃在不斷增長(zhǎng)，成為越來(lái)越嚴(yán)重的危害人民生命和健康的常見疾病[3]。原發(fā)性肺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家的主要腫瘤，以美國(guó)為例，1997年全美國(guó)肺癌的發(fā)生數(shù)男性為98300例，女性為79800例，分別是男女腫瘤發(fā)病率第二位。1997年因肺癌死亡的人數(shù)為160400人，居惡性腫瘤死亡率第1位，占全美國(guó)腫瘤死亡病人的29％[4]。選題意義根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國(guó)腫瘤32中醫(yī)藥在治療肺癌上有其自己的優(yōu)勢(shì)，近幾年來(lái)應(yīng)用辨證論治、專方、專藥及新藥新劑型等方法治療肺癌均有一定的進(jìn)展，在穩(wěn)定病灶、改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等方面都具有一定的療效和優(yōu)勢(shì)。因此研究中醫(yī)藥在肺癌治療中的作用有其很高的應(yīng)用價(jià)值，能更好的服務(wù)于臨床中肺癌的治療。肺癌屬“肺積”、“息責(zé)”等范疇，屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“咳嗽”、“咯血”、“肺積”，這與肺癌的臨床表現(xiàn)有相似之處。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌是由于人體正氣不足，尤其是肺脾腎虛損，再加上六淫和七情等因素長(zhǎng)期作用，導(dǎo)致肺氣不足，肺陰虧虛，升降失調(diào)，氣血瘀滯，內(nèi)結(jié)于肺，形成積塊而發(fā)生的[6]。中醫(yī)藥在治療肺癌上有其自己的優(yōu)勢(shì)，近幾年來(lái)應(yīng)用辨證論治、專方33本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎(chǔ)上用黃芪對(duì)該病進(jìn)行治療，通過(guò)觀察小鼠的一般情況，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對(duì)荷瘤小鼠腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機(jī)制研究黃芪對(duì)小鼠肺癌的作用機(jī)制。預(yù)期成果不僅可為防治該病證提供新思路和理論依據(jù)，指導(dǎo)臨床對(duì)肺癌的預(yù)防、治療和康復(fù)，同時(shí)為的深層次機(jī)制和研究中藥微觀作用機(jī)制的研究進(jìn)行資料積累，提供新思路和理論支撐。本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎(chǔ)上用黃芪對(duì)該病進(jìn)行34課題設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容與研究方法：以小鼠轉(zhuǎn)移肺癌模型為研究對(duì)象，采用中西藥對(duì)比進(jìn)行治療，動(dòng)態(tài)觀察小鼠的體重改變、抑瘤率的比較、肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細(xì)胞因子的變化，從細(xì)胞分子水平闡釋這些變化，及黃芪和紫杉醇對(duì)肺癌的作用的相關(guān)性，觀察探討黃芪對(duì)肺癌的干預(yù)作用的動(dòng)態(tài)變化及時(shí)效性，為防治肺癌提供新思路和理論依據(jù)。課題設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容與研究方法：35技術(shù)路線動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.肺癌的臨床診斷：肺癌的臨床診斷必須依據(jù)臨床表現(xiàn)和各種影像結(jié)果進(jìn)行綜合分析，但最后的確診必須取得細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)的證據(jù)。任何沒有病理學(xué)或病理組織學(xué)證據(jù)的診斷，都不能為最后的診斷結(jié)果。依據(jù)這樣的原則，肺癌的診斷可分為肺癌的定位診斷和肺癌的定性診斷兩種，所有的影像學(xué)診斷法方可認(rèn)為是定位診斷，而所有以獲取細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)為目的的診斷科認(rèn)為是定性診斷。定位診斷是基礎(chǔ)，定性診斷是關(guān)鍵。技術(shù)路線動(dòng)物實(shí)驗(yàn)362.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，無(wú)菌操作，取肺癌瘤小鼠腹水，稀釋至含瘤細(xì)胞2×1010/L，置冰上，每小鼠右腋皮下接種0.2ml，分別給模型組、中藥組和西藥組接種。接種次日24h后進(jìn)行藥物抑藥瘤試驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組和模型對(duì)照組，中藥組和西藥組。模型對(duì)照組中，每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，中藥組中每只小鼠腹灌胃0.4ml，100mg/ml。西藥對(duì)照組中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml，20mg/ml。每只小鼠每天用藥1次，連續(xù)用藥15天，停藥次日處死小鼠，剝離腫瘤，稱體重及瘤重，計(jì)算抑瘤率。2.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級(jí)動(dòng)物37（2）藥物干預(yù)階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥物干預(yù)，以生理鹽水灌胃。中藥治療組小鼠黃芪煎湯灌胃。藥物制備：黃芪25g加8倍水，浸泡半小時(shí)，頭次煎煮半小時(shí)，濾出藥渣后加水至藥面以上3ml，再煎20分鐘。將兩次藥液混合、過(guò)濾，加壓濃縮至100%（即每毫升含生藥1.0g）的水提劑。用藥方法：將藥物按成人日服量換算，計(jì)算出小鼠日服量，每日對(duì)治療組小鼠灌服中藥煎劑0.4ml/100g體重，對(duì)空白組及肺癌模型組小鼠灌服生理鹽水0.4ml/100g體重。連續(xù)用藥15天，第16天處理所有小鼠。后脫頸處死小鼠,完整剖取接種的瘤塊,電子天平稱重，按公式:抑瘤率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。小鼠處死后，將整個(gè)肺取下。在雙盲條件下,計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶的數(shù)目，按公式:肺轉(zhuǎn)移抑制率=(空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目-給藥組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目)/空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目×100%。（2）藥物干預(yù)階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥383.檢測(cè)指標(biāo)（1）整體觀測(cè)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠癥狀、體重、生存時(shí)間、呼吸、被毛情況、食量、飲水量，胸腔，縱膈，胸水。（2）瘤體重測(cè)定：小鼠處死后，去腫瘤組織，精密電子天平稱重。（3）血生化指標(biāo)檢測(cè)：小鼠腹主動(dòng)脈取血，以ELISA法測(cè)定、TNF-α的含量，放免法測(cè)定血漿中MMP-9的含量（4）瘤組織處理：腫瘤組織用福爾馬林液充分固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察期組織學(xué)變化。肺組織用福爾馬林固定12h,進(jìn)行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察讀片,以進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)及特征。3.檢測(cè)指標(biāo)（1）整體觀測(cè)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠癥狀、體重394.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異，均用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分40技術(shù)路線圖SPF級(jí)昆明級(jí)小鼠55只隨機(jī)分組空白組10只模型組15只中藥組15只實(shí)驗(yàn)全過(guò)程觀察小鼠的體重、一般情況、生存時(shí)間、胸腔、縱隔、胸水腫瘤接種血生化指標(biāo)檢測(cè)：TNF-α、MMP-9的蛋白表達(dá)肺組織切片：肺病理觀察瘤體重的測(cè)定14天后停止用藥西藥組15只24h后開始用藥，模型組用生理鹽水，中藥組用黃芪，西藥組用紫杉醇技術(shù)路線圖SPF級(jí)昆明級(jí)小鼠55只隨機(jī)分組空白組10只模型組41可行性分析1．根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而化生萬(wàn)物矣”，“五氣入鼻，藏于心肺”，“肺者，氣之本?！保爸T氣者，皆屬于肺?！钡日撌?，腫瘤的病因不外乎內(nèi)因和外因兩個(gè)方面?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。所以肺癌的發(fā)生也不外乎是氣虛所致。以此采用以補(bǔ)氣為主的黃芪治療。肺癌的發(fā)生與人體的免疫力下降有很大的關(guān)系，而現(xiàn)代的藥理研究顯示黃芪具有提高人體免疫力的作用，故采用黃芪干預(yù)肺癌的形成機(jī)制是可行的。所以理論上通過(guò)腫瘤種植建立轉(zhuǎn)移性肺癌的造模方法，建立肺癌的模型是可行的。可行性分析1．根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而422．實(shí)驗(yàn)方法：本課題針對(duì)中醫(yī)對(duì)腫瘤的病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，在建立肺癌小鼠模型的基礎(chǔ)上，并對(duì)模型進(jìn)行了病理檢查、炎癥因子等方面的檢測(cè)以及方藥驗(yàn)證。研究的思路和方法注重中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和相應(yīng)對(duì)策也是從中醫(yī)學(xué)中氣的本源出發(fā)，立足于病藥相應(yīng)的原則。3．實(shí)施保障：我們依托于山東中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，屬國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，為開放實(shí)驗(yàn)室，具備完成該項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)條件和所用儀器設(shè)備基本能夠滿足，實(shí)驗(yàn)室操作人員經(jīng)驗(yàn)豐富，具體實(shí)驗(yàn)操作熟練，預(yù)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目的預(yù)期目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中所涉及到的材料和試劑均為商品，在國(guó)內(nèi)能夠買到。2．實(shí)驗(yàn)方法：本課題針對(duì)中醫(yī)對(duì)腫瘤的病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)43本課題特色、預(yù)期取得的結(jié)果創(chuàng)新點(diǎn)：1．采用中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相比較的治療的方法，在肺癌病因和臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，用直接種植腫瘤的辦法建立轉(zhuǎn)移性肺癌的小鼠模型。2．在肺癌小鼠模型建立的基礎(chǔ)上用單味中藥黃芪和紫杉醇相比較對(duì)該病證進(jìn)行對(duì)照治療，分析小鼠肺改變，明確肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細(xì)胞因子的變化規(guī)律，從微觀角度闡釋該病證在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，并初步明確藥物的作用機(jī)制或作用靶點(diǎn)。3．該課題觀察肺癌小鼠模型在黃芪的干預(yù)下的變化，以評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性和確定中藥干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)，具有創(chuàng)新性。本課題特色、預(yù)期取得的結(jié)果創(chuàng)新點(diǎn)：44國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)1．小鼠肺癌模型研究概況目前常用的小鼠肺癌動(dòng)物模型有：（1）將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。（2）將小鼠的氣管分離，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理，然后將肺癌細(xì)胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后[12]，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下。（3）切開胸壁皮膚，將肺癌細(xì)胞或肺癌組織直接種植到肺內(nèi)[13-14]。此方法有一定的創(chuàng)傷性和死亡率，肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)在肺實(shí)質(zhì)內(nèi)，但只能使70%-90%的接種小鼠產(chǎn)生腫瘤，對(duì)進(jìn)行進(jìn)一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細(xì)胞直接注入重度復(fù)合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細(xì)支氣管內(nèi)的肺癌模型[15]。國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)1．小鼠肺癌模型研究概況45有學(xué)者采用將人類癌組織或腫瘤細(xì)胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨床特征，但是其技術(shù)要求較高，成功率較低[8-9]。也有人采用外科手術(shù)移植方法，同樣也是成功率低于10%[10]。彭鵬[11]采用清潔級(jí)小鼠C57BL/6小鼠的腋后線第6肋間胸腔(胸腔模型組)或小鼠腋部皮下（皮下模型組）分別移植鼠源性Lewis肺癌細(xì)胞0.2ml可作為晚期肺癌動(dòng)物模型。。有學(xué)者采用將人類癌組織或腫瘤細(xì)胞懸液直接植入支氣管的方法，可46現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)移性肺癌動(dòng)物模型有：①將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。②將小鼠的氣管分離,經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理,然后將肺癌細(xì)胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下[21]。③胸壁皮膚，將肺癌細(xì)胞或肺癌組織直接種植到肺臟內(nèi)[22，23]。也有經(jīng)靜脈注射或心室內(nèi)注射等，建立肺癌轉(zhuǎn)移模型。現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)移性肺癌動(dòng)物模型有：①將肺癌細(xì)胞接種于裸鼠或其他472．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據(jù)病人的身體情況及肺癌的類型和分期采取不同的治療方案。一般而言，非小細(xì)胞肺癌采取手術(shù)為主的綜合治療，小細(xì)胞肺癌則采用以化療放療為主的綜合治療[3]。在化療方面，臨床上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種化療方案。小細(xì)胞癌被列入有可能用化療治愈的疾病，目前的標(biāo)準(zhǔn)化療方案是CAV(環(huán)磷酰胺CTX，阿霉素ADR，長(zhǎng)春新堿VCR)和EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療不敏感，常用的化療方案有EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）NP（去長(zhǎng)春花堿NVB,順鉑DDP）GP(吉西他濱GEM，順鉑和卡鉑Carboplatin）TP(紫杉醇TAX，順鉑和卡鉑Carboplatin）DP（多西紫杉醇DOP，順鉑和卡鉑Carboplatin）。并且21世紀(jì)惡性腫瘤一個(gè)重要的治療方向是分子靶向治療，目前應(yīng)用于肺癌的分子靶向藥物有表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼和埃羅替尼。這類藥物有一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)是靶人群，如吉非替尼對(duì)女性不吸煙的肺腺癌有特別的效果[3]。2．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據(jù)病人的身體情況及肺癌的48從中醫(yī)理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發(fā)生腫瘤。周延峰用消瘤方治療非小細(xì)胞肺癌顯示消瘤方能提高機(jī)體免疫功能，降低患者血液粘度，抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)突變性P53基因[27]。陳璐[7]指出補(bǔ)腎化癖解毒方藥對(duì)小鼠移植性肺癌及小鼠肺轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用并且補(bǔ)腎化癖解毒方藥能提高西藥順鉑(DDP)對(duì)兩者的抑制率。黃健飛[28]指出極低濃度的丹參注射液對(duì)荷瘤小鼠的移植瘤有明顯抑制作用，其余濃度的丹參注射液對(duì)荷瘤小鼠的移植瘤無(wú)明顯抑制作用，不同濃度的丹參注射液無(wú)明顯抑制荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移的作用，但低濃度和中濃度的丹參注射液能降低轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9的表達(dá)。李保國(guó)[29]指出復(fù)方紫杉醇注射液對(duì)移植于C57BL/6小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。裘維焰[30]等指出四君子湯與IFN-γ，合用時(shí)免疚調(diào)節(jié)作用有著明顯影響，并可提高抑瘤率。王立強(qiáng)[31]等指出蘆薈苦素是蘆薈抗腫瘤、抗白血病的有效成分之一。其抗腫瘤機(jī)制可能為促進(jìn)分裂中期微管聚集，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程和提高機(jī)體免疫力。從中醫(yī)理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發(fā)生腫瘤。周延峰用493．黃芪、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的變化癌的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段復(fù)雜的過(guò)程，不僅有外因，還有遺傳因素，免疫狀態(tài)等宿主因素。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，中國(guó)死于惡性腫瘤的前五位癌癥主要依次為：胃癌，肝癌，食管癌，肺癌，大腸癌[32]。目前每年全世界至少有700萬(wàn)人死于癌癥，我國(guó)約130萬(wàn)。因此21世紀(jì)攻克癌癥這一世界難題，具有十分重要的意義。3．黃芪、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的變化癌的發(fā)生是一個(gè)多50（1）黃芪現(xiàn)代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調(diào)節(jié)包括對(duì)抗免疫抑制劑、增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能、調(diào)整補(bǔ)體系統(tǒng)、提高紅細(xì)胞的免疫功能等方面作用。研究證實(shí)，黃芪能增加脾臟的重量、細(xì)胞數(shù)及抗體反應(yīng)，對(duì)抗由強(qiáng)的松造成的免疫抑制及由環(huán)磷酞胺造成的脾臟重量下降，并能提高“虛證”小鼠血漿cAMP含量，加速淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)T細(xì)胞功能，顯著提高E一玫瑰花結(jié)形成率，還有誘生和促誘生干擾素、增強(qiáng)NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性的功能。黃芪的有效成分黃芪多糖能提高抗體形成細(xì)胞數(shù)，抑制Ts細(xì)胞，其對(duì)正常人及腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外分泌腫瘤壞死因子具有明顯的促進(jìn)作用[32]。（1）黃芪現(xiàn)代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調(diào)節(jié)包括對(duì)抗免疫抑51黃芪免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為黃芪的作用多系整體調(diào)節(jié)的結(jié)果，即所謂“虛者補(bǔ)之，損者益之”。黃芪在生長(zhǎng)過(guò)程中從土壤中選擇性吸收硒，因而黃芪富含硒。硒對(duì)各種金屬如福、汞、甲基汞等一些化學(xué)致癌物質(zhì)有拮抗作用；硒是谷膚甘膚過(guò)氧化酶的一個(gè)組成部分，此酶可以保護(hù)細(xì)胞免受生物氧化過(guò)程的損害;硒還能抑制癌細(xì)胞的氧化磷酸化作用。最近一項(xiàng)對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠的研究顯示黃芪能顯著抑制過(guò)敏性哮喘豚鼠氣道壁細(xì)胞NF-kB的表達(dá)，此可為黃芪的作用機(jī)制之一[37]。此外黃芪總貳可使小鼠肝癌(HepA)和肉瘤(5180)細(xì)胞阻止于GO/G1期，并可誘導(dǎo)其凋亡[38]；使活化T淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加并增強(qiáng)鈣離子內(nèi)流的驅(qū)動(dòng)力[39]通過(guò)提高細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞再循環(huán)[40]。柏長(zhǎng)青等[41]指出黃芪提取物注射液能夠明顯降低肺癌患者化療期間常見毒副反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，改善患者化療期間的生存質(zhì)量。趙鐵華[42]等指出黃芪等中草藥具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。黃芪免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為黃芪的作用多系整52（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細(xì)胞分泌，局部注射TNF-α?xí)T導(dǎo)小鼠腫瘤壞死，因此被命名為腫瘤壞死因子（TNF）。TNF-α為一種重要的炎癥介質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等釋放，能激活中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等促進(jìn)炎癥顆粒釋放，而且還能與香煙煙霧、LPS等協(xié)同活化炎癥細(xì)胞的