DNA重組技術(shù)的基本工具王凱輝

生物選修3

現(xiàn)代生物科技專題目錄專題1基因工程專題2細(xì)胞工程專題3胚胎工程專題4生物技術(shù)的安全性和倫理問題專題5生態(tài)工程專題1基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。一、基因工程的概念由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程原理（實質(zhì)）結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組二、基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯二、基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯技術(shù)發(fā)明使基因工程的實施成為可能1.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2.工具酶的發(fā)現(xiàn)3.DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4.DNA體外重組的實現(xiàn)5.重組DNA表達(dá)實驗的成功6.第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7.PCR技術(shù)的發(fā)明問題探討：

蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉1.1DNA重組技術(shù)的基本工具想一想：需要做哪些關(guān)鍵工作？基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？1.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工工程培培育抗抗蟲棉棉的關(guān)關(guān)鍵步步驟：：關(guān)鍵步步驟一一：從蘇云云金桿桿菌細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)提取出出抗蟲蟲基因因關(guān)鍵步步驟二二：抗蟲基基因與與運載體體DNA拼拼接關(guān)鍵步步驟三三：抗蟲基基因?qū)胧苁荏w(棉花花)細(xì)細(xì)胞1.1DNA重組組技術(shù)術(shù)的基基本工工具準(zhǔn)確切切割DNA的工工具———““分分子手手術(shù)刀刀”DNA片片段的連連接工具具——““分子子縫合針針”基因轉(zhuǎn)移移工具———““分子運運輸車””基因的大大小以納納米計算算，要對對它進行行剪切、、拼接等等操作，，沒有非非常精細(xì)細(xì)的工具具是不行行的。進進行基因因操作最最少需要要以下三三種工具具：DNA重重組技術(shù)術(shù)的基本本工具思考：1.在自自然界中中有一些些生物的的DNA可能進進入另一一種生物物的細(xì)胞胞中。我我們有沒沒有學(xué)過過相關(guān)的的實例？？2,現(xiàn)今今存在的的生物為為什么沒沒有在長長期的進進化過程程中被外外源DNA的入入侵而滅滅絕，仍仍能保持持一種穩(wěn)穩(wěn)定狀態(tài)態(tài)？原核生物物細(xì)胞中中的限制制酶會將將外源DNA切切割掉，，使之失失效，以以保證自自身的安安全，但但是不會會切割自自身的DNA，，這是原原核生物物在長期期進化過過程中形形成的一一套防御御機制。。3.怎樣樣才能使使外來的的DNA失效從從而保護護自身？？限制酶常常常伴隨隨一到兩兩種修飾飾酶(甲甲基化酶酶)出現(xiàn)現(xiàn).后后者的作作用是保保護細(xì)胞胞自身的的DNA不被限限制酶破破壞.修修飾酶識識別的位位點與限限制酶識識別位點點相同,但只甲甲基化每每條鏈中中的一個個堿基,而不是是切開DNA鏈鏈,甲基基化的DNA無無法被限限制酶作作用.注:限制酶與與修飾酶酶在不同同的情況況下,可可能是兩兩種不同同的蛋白白質(zhì),也也可能是是同一蛋蛋白質(zhì)的的不同功功能部位位.一、限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶——““分子手手術(shù)刀””①來源：：主要從原核生物物中分離純純化出來來。②種類：：已從近300種微生物中中分離出約4000種限制酶。③作用：1.能識別雙鏈DNA的的某種特定核苷酸序序列2.使每條鏈鏈中特定部位的兩個核苷酸酸之間的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵：：具有特異性。一種限制酶只能識別一種種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，④作用特點：：大多數(shù)限制酶的識別別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序序列由4、5或8個核苷苷酸組成⑤限制酶的識識別序列：一、限制性核核酸內(nèi)切酶———“分子手手術(shù)刀”⑥形成兩種末端端粘性末端平末端EcoRI限制酶的的切割：SmaI限制酶的切割1.大腸桿菌菌的一種限制制酶（EcoRⅠ）能識識別GAATTC序列，，并在G和A之間切開形形成黏性末端端。2.SmaⅠⅠ能識別CCCGGG序序列，并在C和G之間切切割形成平末末端。GAATTC

CTTAAG

中軸線CTTAA

G

AATTCG

CCCGGG

GGGCCC

CCCGGG

GGGCCC

黏性末端平末端大腸桿菌的一一種限制酶（（EcoRⅠⅠ)能識別GAATTC序列，SmaⅠ識別CCCGGG序列:磷酸二酯鍵即脫氧核糖、、磷酸之間的的連接ATGGCATCTTCGAA切割DNA分分子時產(chǎn)生的的兩種不同末末端限制酶切割DNA后形成成的末端———黏性末端、、平末端是如如何形成的？？思考：什么叫黏性末末端？當(dāng)限制酶從識別序列的的中心軸線兩兩側(cè)切開時，，被限制酶切開開的DNA兩兩條單鏈的切切口，帶有幾幾個伸出的核苷酸酸，他們之間正正好互補配對，這樣的切口口叫黏性末端。什么叫平末端端？當(dāng)限制酶從識別序列的的中心軸線處處切開時，切開的DNA兩條單鏈的的切口，是平平整的，這樣樣的切口叫平末端。ＥcoRI限制酶SmaI限制酶識別序列－ＣＣＣＧＧＧＧ－切割位點Ｇ和Ａ之間Ｃ和Ｇ之間未端類型平末端黏性末端－ＣＴＴＡＡＡＧ－－ＧＧＧＣＣＣＣ－－ＧＡＡＴＴＴＣ－4、切割后的的形式：2種末端注：1.限制酶是一大大類酶，不是是一種酶。2.限制酶大多多可以專一性性識別雙鏈DNA分子上上的某種特定定核苷酸序列列，限制酶所所識別的序列列，無論是6個堿基還是是4個堿基，，都可以找到到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)側(cè)的雙鏈DNA上的堿基基是反向?qū)ΨQ稱，重復(fù)排列列的。3.如果所識別別的序列是奇奇數(shù)如5個堿堿基,則中軸軸線在中間的的堿基對上,除了中軸線線外,兩側(cè)的的雙鏈DNA上的堿基是是反向?qū)ΨQ黏性末端平末端1.要想獲得得某個特定性性狀的基因必必須要用限制制酶切幾個切切口？可產(chǎn)生生幾個黏性(平)末端？？要切兩個切口口，產(chǎn)生四個個黏性(平)末端。3.如果把兩兩種來源不同同的DNA用用同一種限制制酶來切割，，會怎樣呢？？會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者者的黏性(平平)末端黏合起來，就似乎乎可以合成重重組的DNA分子了。思考?2.切下的特特定片段上有有幾個黏性(平)末端?如果直接用DNA連接酶酶連接會出現(xiàn)現(xiàn)什么情形?兩個黏性(平平)末端;會會出現(xiàn)自身環(huán)環(huán)化現(xiàn)象4.如何避免免自身環(huán)化現(xiàn)現(xiàn)象?分別用不同的的限制酶切割割兩個部位,這樣就不會會出現(xiàn)相同的黏黏性(平)末末端.思考與探究為什么限制酶酶不剪切細(xì)菌菌本身的DNA？通過長期的進進化，細(xì)菌中中含有某種限限制酶的細(xì)胞胞，其DNA分子中或者者不具備這種限制酶的的識別切割序列列，或者通過甲甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到所識別序列列的堿基上上，使限制酶不不能將其其切開。這樣，，盡管細(xì)細(xì)菌中含含有某種種限制酶酶也不會會使自身身的DNA被切切斷，并并且可以以防止外外源DNA的入入侵。DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點DNA連連接酶與與DNA聚合酶酶是一回回事嗎?為什么么?1)只能能將單個核苷苷酸連接到已已有的核核酸片段段上，形形成磷酸酸二酯鍵鍵形成磷酸二酯酯鍵1)在兩個DNA片段段之間形成磷酸酸二酯鍵鍵2)以一條DNA鏈為為模板，將單個核苷苷酸通過磷酸酸二酯鍵鍵連接成一一條互補補的DNA鏈2)將DNA雙雙鏈上的的兩個缺口口同時連連接起來，不需要模模板二、DNA連接接酶———“分子縫縫合針””二、DNA連接接酶—““分子縫縫合針””1、作用用：形成磷酸酸二酯鍵鍵恢復(fù)被限限制酶切切開的兩兩個核苷苷酸之間間的磷酸酸二酯鍵鍵。2、類型型：類型E·coliDNA連連接酶T4DNA連連接酶來源功能大腸桿菌菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接接黏性末端端能連接黏性末端端和平末端(效率較較低)相同點差別二、DNA連接接酶—““分子縫縫合針””DNA聚聚合酶將外源基因因送入受體細(xì)胞胞。①載體的的作用：：三、基因因進入受受體細(xì)胞胞的載體體——“分分子運輸輸車”②作為載體體的必要要條件：：有切割位位點——供外外源DNA片段段(基因因)插入入。能自我復(fù)復(fù)制——并能能帶著插插入的目目的基因因一起復(fù)復(fù)制有遺傳標(biāo)標(biāo)記基因因——供重重組DNA的鑒鑒定和選選擇。載體DNA必需需是安全全的——不會對受受體細(xì)胞胞有害，，或不能能進入到到除受體體細(xì)胞外外的其他他生物細(xì)細(xì)胞中去去。載體DNA分子子大小應(yīng)應(yīng)適合——以便便提取和和在體外外進行操操作，太太大就不不便操作作。實際上自自然存在在的質(zhì)粒粒DNA分子并并不完全全具備上上述條件件，都要要進行人人工改造造后才能能用于基基因工程程操作。。質(zhì)粒：裸露的、、結(jié)構(gòu)簡簡單的、、獨立于細(xì)細(xì)菌擬核DNA之外外，并具具有自我復(fù)制制能力的很很小的雙雙鏈環(huán)狀DNA分子。三、基因因進入受受體細(xì)胞胞的載體體——“分分子運輸輸車”質(zhì)粒質(zhì)粒：能復(fù)制并并帶著插插入的目目的基因因一起復(fù)復(fù)制有切割位位點有標(biāo)記基基因的存存在，可可用含氨氨芐青霉霉素的培培養(yǎng)基鑒鑒別。三、基因因進入受受體細(xì)胞胞的載體體——“分分子運輸輸車”說明沒有有危害，，大腸桿桿菌是非非致病菌菌，且分分裂快，，也便于于從大量量復(fù)制個個體中分分離出來來。質(zhì)粒λ噬菌體的的衍生物物動植物病病毒等③載體的種種類：三、基因因進入受受體細(xì)胞胞的載體體——“分分子運輸輸車”小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具條件結(jié)構(gòu)小而穩(wěn)定能自我復(fù)制具多個限制酶切位點具標(biāo)記基因等質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等隨堂練習(xí)習(xí)1、關(guān)于于限制酶酶的說法法中，正正確的是是（））A、限制制酶是一一種酶，，只識別別GAATTC堿基序序列B、EcoRI切割的的是G——A之間間的氫鍵鍵C．限