WESTERN BLOT操作步驟圖課件

WESTERNBLOTTING

過程圖解

圖中綠色的是夾玻璃片的架子玻璃板對齊后放入架中，把兩側(cè)的夾子卡緊。要使短玻璃靠外，長玻璃靠內(nèi)。配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）

當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配4％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。

均勻插入梳子梳子已經(jīng)插好。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。

將玻璃板從夾子上取下，用水沖一下插入另一塊玻璃板，也是小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外

放入電泳槽中向內(nèi)槽中加電泳緩沖液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使內(nèi)外不交通。電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)的小玻璃板。

測完蛋白含量后，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15l，加樣孔的最大限度可加20l樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染電泳時間一般1-2h，電壓為100V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。

取出轉(zhuǎn)移槽兩塊玻璃板都已經(jīng)取下要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）

在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜，將夾子打開使白的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。

在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。合起夾子將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。

電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。

蓋上蓋子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋電轉(zhuǎn)移200mA2-3h后，打開蓋子，取出夾子打開夾子，取出膜，如果所用marker是預(yù)染marker,可見marker已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上,如果不是預(yù)染marker，可以把膜轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min，于脫色搖床上搖，然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。

將膜晾干備用。將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中

室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。

按所需稀釋濃度滴加一抗（直接加在封閉液里）4℃過夜或37℃3h。