利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽免疫性蛋白如課件

第十章外源基因表達與基因工程藥物

第十章第一節(jié)概述

第一節(jié)概述2

生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的成就是用于新型生物藥物的研制。之前，許多在疾病診斷、治療和預(yù)防中有重要價值的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)（激素、細胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類、凝血因子等）以及某些疫苗，由于①材料來源困難；②提取技術(shù)問題；或③因為造價太高使患者望而卻步；或④由于免疫抗原等緣故使傳統(tǒng)生物藥物的使用受到限制而應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以從根本上解決上述問題，它的應(yīng)用使人們在解決癌癥、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面取得明顯效果，它為上述疾病的預(yù)防、治療和診斷提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑

生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功3

基因工程技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)中為預(yù)防、診斷、治療癌癥、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等疑難病方面提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑；利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽①免疫性蛋白：如各種抗原和單克隆抗體②細胞因子：如干擾素、白介素、生長因子③激素：如胰島素、生長激素④酶類：如尿激酶、鏈激酶、超氧化物歧化酶

一、基因工程藥物的類型基因工程技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)中為預(yù)防、診斷、治療癌癥4二、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點1.可大量生產(chǎn)（過去難以獲得的）生理活性蛋白和多肽，以保障臨床供應(yīng)2.可提供足量的生理活性物質(zhì)，以便進行深入研究，從而擴大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍3.可以發(fā)現(xiàn)、挖掘出更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)4.可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對內(nèi)源生理活性物質(zhì)的不足之處進行改造和去除5.可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源

二、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點1.可大量生產(chǎn)（過去難以5

我國基因工程藥物研究和開發(fā)起步較晚，基礎(chǔ)較差，重點放在運用現(xiàn)代生物技術(shù)手段開發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)的醫(yī)藥產(chǎn)品，如1997年，我國自行研制開發(fā)的具有國際先進水平的生物高科技產(chǎn)品——α1b性干擾素三、國內(nèi)基因工程制藥現(xiàn)狀我國基因工程藥物研究和開發(fā)起步較晚，基礎(chǔ)較差，重點6第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程

第二節(jié)7

就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)通過基因工程技術(shù)，可以大規(guī)模生產(chǎn)很多從自然界很難或不能獲得的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)。如以E.Coli為宿主，表達病毒抗原基因，獲得病毒抗原，再通過一定手段除去抗原的反應(yīng)性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫苗一、基因工程技術(shù)的概念就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)8利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽免疫性蛋白如課件9二、基因工程藥物生產(chǎn)的主要程序①目的基因的分離與克?。康幕騺碓从谌梭w或病原體）②構(gòu)建DNA重組體（通常將目的基因與質(zhì)粒DNA整合，組建重組質(zhì)粒）③將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌④工程菌的發(fā)酵（在工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，目的基因同時表達）⑤外源基因表達產(chǎn)物的分離純化（用生物技術(shù)及化學(xué)、化學(xué)方法）⑥成品的檢驗及包裝等二、基因工程藥物生產(chǎn)的主要程序①目的基因的分離與克?。康幕?0附：制備基因工程藥物的一般程序

目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌培養(yǎng)工程菌除菌過濾產(chǎn)物分離純化半成品檢定成品檢定包裝表達系統(tǒng)：原核生物系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)。選擇表達系統(tǒng)主要考慮：①保證表達的蛋白質(zhì)的功能

②其次是表達量的多少和分離純化的難易

附：制備基因工程藥物的一般程序目的基因組建11說明上游階段：在實驗室完成，獲得目的基因后，用限制性內(nèi)切酶和連接酶將目的基因插入載體，并轉(zhuǎn)入宿主菌下游階段：將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，為獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的表達產(chǎn)物，需對影響表達及分離純化的因素進行分析（如新型生物反應(yīng)器、高效分離介質(zhì)及裝置、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)等）說明上游階段：在實驗室完成，獲得目的基因后，用限制性內(nèi)切酶12第三節(jié)目的基因的獲得

第三節(jié)目的基因的獲得13

對于原核生物，其基因總量不大，可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因，而真核生物的目的基因不能進行直接分離

①真核細胞中基因總量較大，單拷貝目的基因只是染色體DNA中很小的一部分，直接分離純化極為困難；另外，②真核基因一般都有內(nèi)含子，若以原核細胞作為表達系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細胞缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。

克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法

對于原核生物，其基因總量不大，可以選用合14一、逆轉(zhuǎn)錄法

逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成互補DNA，然后進行互補DNA的克隆表達。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補DNA，再以互補DNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA序列，該序列不含內(nèi)含子

一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基15

細胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA占RNA總量的2%-5%，相對分子量大小不一致，分離也有很大的困難，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸(polyA)組成的末端，長達20-250個腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纖維素上，從而可以用親和層析法將mRNA從細胞總RNA上分離出來，可得到純度較高的mRNA1.mRNA的純化細胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA占RNA總量16

mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脫氧胸苷酸為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始互補DNA的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計算出互補DNA的合成效率，在凝膠電泳后，進行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件2.互補DNA第一鏈的合成mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，17

先用堿解或核酸酶酶解(RNaseH酶活性)的方法除去互補DNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以互補DNA第一鏈為模板合成第二鏈，并用核酸酶S1專一性切除單鏈DNA

3.互補DNA第二條鏈的合成

先用堿解或核酸酶酶解(RNaseH酶活性18

載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互補DNA是否能夠表達、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達型載體和非表達型載體?；パaDNA插入片段小于10千堿基對，可選用質(zhì)粒載體，如大于10千堿基對則選用噬菌體作為載體

4.互補DNA克隆載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互19（1）載體的分類用于cDNA克隆的載體質(zhì)粒DNA，如PUC、PBR322等噬菌體DNA，如λgt10、λgt11等（1）載體的分類用于cDNA克隆的載體質(zhì)粒DNA，如PUC20（2）載體的特點①PUC和λgt11屬于表達型載體，而PBR322和λgt10屬于非表達型載體表達型載體：在cDNA插入位置的上游具有啟動子序列，重組后插入的cDNA能夠表達，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體非表達型載體：在cDNA插入位置的上游無啟動子序列，重組后插入的cDNA不能表達，不能經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體②質(zhì)粒載體容量小（只能插入小于10kb的cDNA片段）；而要插入大于10kb的外源cDNA片段時，只能選用噬菌體作為載體（噬菌體作為載體，克隆效率高，容量大）（2）載體的特點①PUC和λgt11屬于表達型載體，而P21（3）cDNA與載體的連接①加同聚尾連接法在3’-末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將載體和cDNA的3’-端加上互補的同型多聚體序列（A-T、G-C），借助同型多聚體的退火作用形成重組分子在T4DNA連接酶作用下，封口環(huán)化②加人工接頭連接法在T4DNA連接酶作用下，人為地在目的基因兩端接上人工接頭，使DNA發(fā)生連接的方法人工接頭：由人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切點的寡聚核苷酸片段。它能使目的基因產(chǎn)生粘性末端，從而與載體連接（3）cDNA與載體的連接①加同聚尾連接法225.將重組體導(dǎo)入宿主細胞此過程是一個非同源DNA重組的過程；即讓質(zhì)?；蚴删w轉(zhuǎn)化或感染感受態(tài)的大腸桿菌，從而將重組體引入宿主（E.Coli）細胞內(nèi)5.將重組體導(dǎo)入宿主細胞此過程是一個非同源DNA重組236.cDNA文庫的鑒定①根據(jù)重組體表型進行初步篩選②然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析等方法進一步篩選和鑒定抗性基因失活法菌落或噬菌體顏色改變法6.cDNA文庫的鑒定①根據(jù)重組體表型進行初步篩選抗性基因失247.目的cDNA克隆的分離純化①核酸探針雜交法

用層析和電泳技術(shù)純化目的蛋白，根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果人工合成相應(yīng)的單鏈寡聚核苷酸序列作為探針；然后從cDNA文庫中分離出特異cDNA克隆②免疫反應(yīng)鑒定法在無目的基因表型特征和核酸探針的情況下，本法是篩選特異cDNA克隆的重要途徑，即用目的蛋白的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆7.目的cDNA克隆的分離純化①核酸探針雜交法25二、化學(xué)合成法1.適用條件：①只能合成較小蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因

②目的基因的核苷酸序列必須清楚；或目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列清楚，然后按相應(yīng)的密碼子反推DNA堿基序列2.過程：用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因3.局限性：1.不能合成太長的基因，50-60個堿基對2.人工合成堿基對時，遺傳密碼的簡并性為選擇密碼子帶來很大的困難

3.費用較高二、化學(xué)合成法1.適用條件：①只能合成較小蛋白質(zhì)或多肽的編26第四節(jié)基因表達

第四節(jié)基因表達27是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程用基因工程制備藥物，必須使目的基因進行高效表達

一、基因表達目的產(chǎn)物產(chǎn)量高目的產(chǎn)物質(zhì)量高表達產(chǎn)量分離純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的生物學(xué)活性高效表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程一、基因表28二、宿主細胞的選擇（一）宿主細胞應(yīng)滿足以下要求1.容易獲得較高濃度的細胞2.能利用廉價易得的原料培養(yǎng)3.不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素4.發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)5.容易進行代謝調(diào)控6.容易進行DNA重組技術(shù)操作7.產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取

二、宿主細胞的選擇（一）宿主細胞應(yīng)滿足以下要求29（二）宿主細胞的分類1.原核細胞：如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌

2.真核細胞：如酵母菌、絲狀真菌、哺乳動物細胞（二）宿主細胞的分類1.原核細胞：如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌30（1）大腸桿菌

生長迅速、對其遺傳學(xué)背景研究比較深入、透徹，所以是目前基因工程研究中最常用的原核表達體系特點：①產(chǎn)物多為胞內(nèi)產(chǎn)物（因為大腸桿菌的表達產(chǎn)物不存在信號肽）

②真核蛋白質(zhì)常以不溶性包含體的形式存在（故下游處理過程必須經(jīng)過復(fù)雜的變性和復(fù)性等工藝才能恢復(fù)其生理活性）

③蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化（因為大腸桿菌的表達不存在翻譯后修飾作用）

④目的蛋白的N-端常帶有一個多余的Met殘基，易引起免疫反應(yīng)

⑤有時會產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素（陰性桿菌的細胞壁成分）

⑥有時會產(chǎn)生蛋白酶破壞目的蛋白1.原核細胞（1）大腸桿菌

生長迅速、對其遺傳學(xué)背景研究比31（2）枯草芽孢桿菌

特點：①分泌能力強，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中

②不形成包含體

③不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化

④有很強的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進行降解（2）枯草芽孢桿菌特點：①分泌能力強，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分32

鏈霉菌作為外源基因的表達體系，目前正逐步受到人們的重視主要特點：不致病、使用安全、分泌能力強、可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力（3）鏈霉菌鏈霉菌作為外源基因的表達體系，目前正逐步受332.真核細胞

（1）酵母是研究基因表達調(diào)控最有效的單細胞真核微生物特點

①繁殖迅速

②基因工程操作簡單（可以廉價地大規(guī)模培養(yǎng)，沒有毒性）

③能將表達產(chǎn)物直接分泌到胞外

④表達產(chǎn)物能糖基化2.真核細胞（1）酵母34特點

①有很強的蛋白質(zhì)分泌功能

②能正確進行翻譯后加工（包括肽剪切和糖基化等）

③糖基化方式與高等真核生物相似

④為無毒安全菌株如：胰島素原在分泌貯備小泡中向細胞外運送時，其中的C-肽被切除后才變成具有活性的胰島素（2）絲狀真菌（如霉菌）特點①有很強的蛋白質(zhì)分泌功能（2）絲狀真菌（如霉菌）35（3）哺乳動物細胞

特點：

①產(chǎn)物可分泌到胞外，細胞培養(yǎng)液成分完全可控制，使產(chǎn)物純化較容易

②表達產(chǎn)物能糖基化，接近或類似與天然產(chǎn)物

③動物細胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀

綜上所述，目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因為對它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合于它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方式，并且許多外源基因在這兩種宿主菌中得到表達成功（3）哺乳動物細胞特點：36三、不同宿主菌中的基因表達

（一）大腸桿菌中的基因表達

1.載體根據(jù)真核基因在原核細胞中表達的特點，表達載體應(yīng)具備下列條件：①載體能夠獨立復(fù)制，有復(fù)制起點，有嚴緊型和松弛型嚴緊型載體：伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細胞中拷貝少（1-3）松弛型載體：其復(fù)制可不依賴于宿主細胞，在宿主細胞中拷貝多達3000個②應(yīng)有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選③應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別④應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄⑤應(yīng)具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定⑥所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯起始信號

三、不同宿主菌中的基因表達（一）大腸桿菌中的基因表達37

2.影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素

外源基因在宿主中的表達受許多因素影響的，所以在建立表達體系時要綜合考慮各種因素的作用，建立一個合適的表達體系，從而使外源基因得到最大的表達量，獲得最多的表達產(chǎn)物

（1）外源基因的拷貝數(shù)

外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達水平非常有利

（2）外源基因的表達效率

啟動子的強弱—在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達、核糖體結(jié)合位點的有效性、SD序列和起始ATG的間距、密碼子的組成等都會不同程度地影響外源基因的表達2.影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外38基因表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄，要實現(xiàn)外源基因的高效表達，首先必須保證外源DNA向mRNA的高效轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄的順利進行，必須依靠強有效的啟動子，因此在載體的目的基因上游必須連有一個適當(dāng)?shù)膯幼?；另外，真核基因的啟動子不能被大腸桿菌的RNA-pol識別，故將真核基因的編碼區(qū)置于大腸桿菌RNA-pol能識別的強啟動子（如lac、trp等）控制下，并將其插入表達載體啟動子的下游，以增加表達的機會①啟動子的強弱基因表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄，要實現(xiàn)外源基因的高效表39②核糖體結(jié)合位點的有效性

核糖體結(jié)合位點是對真核基因在細菌中的高效表達十分重要；必須通過消除空間位阻等的影響增加其有效性②核糖體結(jié)合位點的有效性核糖體結(jié)合位點是對40③SD序列和起始ATG的間距

SD序列與起始密碼間的間距對非融合蛋白的合成水平有很大影響；距離過長或過短都不利于真核基因的表達（一般距離10~35bp較合適）③SD序列和起始ATG的間距SD序列與起始密41④密碼子的組成

tRNA對密碼子的“偏愛性”也是影響翻譯效率的因素之一。真核基因與原核基因在編碼同一氨基酸時所偏愛使用的密碼子不盡相同，為了實現(xiàn)真核基因在大腸桿菌中的高效表達，在設(shè)計引物和合成基因時，應(yīng)選擇使用大腸桿菌“偏愛”的密碼子④密碼子的組成tRNA對密碼子的“偏愛性”也是影42（3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

當(dāng)外源基因大量表達時，由于應(yīng)急反應(yīng)，細胞內(nèi)會迅速分泌大量降解該蛋白質(zhì)的酶，所以即使原始表達量很高，實際產(chǎn)量也不一定高，那就得看被酶降解的程度。為了提高產(chǎn)量，必須提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。具體措施如下：①組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白②利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解③采用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞

（3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性當(dāng)外源基因大量表達時，43（4）細胞的代謝負荷

外源基因在宿主細胞內(nèi)的大量表達，必然會影響宿主細胞正常的生長代謝，有些產(chǎn)物對宿主還會有毒害作用，將細胞殺死，為了減輕宿主細胞的代謝負荷，同時還得提高外源基因的表達水平，可采用兩步培養(yǎng)法[方法一]將細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段，當(dāng)宿主細胞的生物量達到飽和時，再進行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿主細胞的代謝負荷[方法二]將宿主細胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開，當(dāng)宿主細胞迅速生長時，抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制，當(dāng)細胞生長量累積到一定水平后，再誘導(dǎo)細胞中重組質(zhì)粒的復(fù)制，增加質(zhì)?？截悢?shù)

（4）細胞的代謝負荷外源基因在宿主細胞內(nèi)的44（5）工程菌的培養(yǎng)條件

優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達（5）工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達45（1）融合蛋白（2）非融合蛋白（3）分泌型

3.真核基因在大腸桿菌中的表達形式（1）融合蛋白3.真核基因在大腸桿菌中的表達形式46（1）融合蛋白

概念：是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起所形成的蛋白質(zhì)；其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列優(yōu)點：①基因操作簡便

②蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定

③蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好，不易被細菌酶類所降解

④容易實現(xiàn)高效表達缺點：不能作抗原使用（因為原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性；目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段）

（1）融合蛋白概念：是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一47（2）非融合蛋白

表達非融合蛋白的操縱子必須改建成

細菌或噬菌體的啟動子—細菌的核糖體結(jié)合位點（SD序列）—真核基因的起始密碼子—結(jié)構(gòu)基因—終止密碼（要求核糖體結(jié)合位點序列與翻譯起始密碼之間的距離要合適，稍有不適就會影響表達效率）優(yōu)點：能夠較好地保持原來的蛋白活性；缺點：①容易被蛋白酶破壞②N-末端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時可能會引起免疫反應(yīng)

（2）非融合蛋白表達非融合蛋白的操縱子必須改建成48

將外源基因連接到信號肽的下游，利用大腸桿菌的信號肽，構(gòu)建成分泌型表達質(zhì)粒；當(dāng)其在大腸桿菌中表達時，外源基因的表達產(chǎn)物（目的蛋白）在信號肽的幫助下，以生物活性形式被分泌到細胞外特點：①提高了易被細胞內(nèi)蛋白酶降解的表達產(chǎn)物的穩(wěn)定

②在細胞內(nèi)表達時無活性的蛋白質(zhì)，分泌表達時能按一定的方式折疊，形成具有活性的蛋白質(zhì)

③分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的Met（因為Met隨著信號肽被信號肽酶切割掉了）

（3）分泌型蛋白將外源基因連接到信號肽的下游，利用大腸桿菌的49（二）酵母中的基因表達

1.酵母載體

（1）概念：是可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA或RNA單位

（2）酵母載體分類：普通表達載體和精確表達載體

①普通表達載體——只能方便地引入外源基因并進行表達，對表達產(chǎn)物的組成，特別是對其N-末端氨基酸是否有增減并無嚴格要求

②精確表達載體——要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因，并使它在表達和加工后N-末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸

（二）酵母中的基因表達1.酵母載體

（1）概念：是可以攜帶50

由于從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段再轉(zhuǎn)入酵母中（3）克隆載體由于從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多51（二）影響目的基因在酵母菌中表達的因素

1.外源基因的拷貝數(shù)

拷貝數(shù)要適當(dāng)。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達，但會引起細胞生長量的降低；單拷貝的質(zhì)粒載體對細胞的最大生長沒有影響，但表達的效率不高，必須調(diào)節(jié)好這兩方面的關(guān)系（二）影響目的基因在酵母菌中表達的因素1.外源基因的拷貝數(shù)52

外源基因在酵母中表達效率與啟動子、分泌信號、終止序列有關(guān)（1）要使外源基因在酵母中表達，必須將外源基因克隆到酵母菌表達載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達框架（啟動子-外源基因-終止子）（2）分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達產(chǎn)物分泌出酵母細胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達產(chǎn)物（3）終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止，并加上polyA，形成的mRNA比較穩(wěn)定并被有效地翻譯2.外源基因的表達效率外源基因在酵母中表達效率與啟動子、分泌信號、533.外源蛋白的糖基化

外源蛋白在酵母中可發(fā)生N-糖苷鍵（Asn連接）和O-糖苷鍵（Ser或Thr連接）兩種不同的糖基化，并在分泌過程中正確識別外源蛋白的糖基化信號，使其進行正確折疊和分泌到細胞外酵母細胞分泌的“異源”蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全相同，這也是為什么酵母細胞被廣泛應(yīng)用生產(chǎn)各種醫(yī)用蛋白的原因3.外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母中可發(fā)生54

不同的酵母菌株及其生理狀態(tài)對外源基因的表達有明顯影響，用作表達的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求①菌體生長力強②菌體內(nèi)源蛋白酶較弱③菌體性能穩(wěn)定④分泌能力強

4.宿主菌株的影響不同的酵母菌株及其生理狀態(tài)對外源基因的表達有明55五、動物細胞中的基因表達

動物細胞表達的特點：產(chǎn)物可分泌到細胞外，培養(yǎng)液成分可人工調(diào)控，產(chǎn)物純化比較容易，產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物；但動物細胞生長慢，單位體積生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較小

五、動物細胞中的基因表達動物細胞表達的特點56第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性

第五節(jié)57

基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，有分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。不管是哪一種不穩(wěn)定，都將使不含目的基因的細胞成為優(yōu)勢菌，從而減少基因表達的產(chǎn)物①分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂增殖時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象②質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或突變，或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)58一、引起質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因

在基因工程菌培養(yǎng)過程中，質(zhì)粒的不穩(wěn)定通常表現(xiàn)為分裂不穩(wěn)定，主要與兩個因素有關(guān)①含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；②這兩種菌的比生長速率差異的大小1.對于含低拷貝質(zhì)粒的工程菌，若工程菌的比生長速率較快，則容易產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌（此時可通過降低工程菌的生長速率或增加工程菌中的質(zhì)?？截悢?shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性）2.含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢菌（因而對這類工程菌而言，進一步提高質(zhì)?？截悢?shù)反而會增加含質(zhì)粒菌的生長負勢，對質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利）一、引起質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因在基因工程菌培養(yǎng)過程中59將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，然后隨機挑出100個菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)，每一樣品應(yīng)取3次重復(fù)的結(jié)果，計算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗60二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

1.兩階段培養(yǎng)法：第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達2.選擇性壓力（如抗生素等）：通過向培養(yǎng)基中加入“壓力”，抑制質(zhì)粒丟失菌的生長3.間歇供氧法4.改變稀釋速率法

利用重組菌對發(fā)酵環(huán)境改變的反應(yīng)較質(zhì)粒丟失菌遲鈍的性質(zhì)，通過改變培養(yǎng)條件（如調(diào)控溫度、pH、培養(yǎng)基組分、溶解氧，通過間歇供氧和改變稀釋速率），抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，使工程菌生長速率具有優(yōu)勢

二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.兩階段培養(yǎng)法：第一階段先使菌體61第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點第六節(jié)62菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白質(zhì)的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補料或稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率都有重要意義對菌體生長的調(diào)控主要有兩種觀點①能量的供應(yīng)決定了菌體的最大比生長速率②小分子前體和催化組分（RNA聚合酶、核糖體）的限制決定了菌體的最大比生長速率這兩種觀點分別從能量和合成反應(yīng)的前體這兩個不同的角度研究菌體的生長

菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白質(zhì)63一、菌體生長與能量的關(guān)系（一）菌體生長與能量供應(yīng)的關(guān)系

菌體生長是由呼吸控制的，各種碳源通過有限的呼吸能力所提供的最大能量決定了菌體在這種培養(yǎng)基中的最大比生長速率

當(dāng)菌體生長所需能量超過菌體有氧代謝所能提供的能量時，菌體往往會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸一、菌體生長與能量的關(guān)系（一）菌體生長與能量供應(yīng)的關(guān)系64（二）如何實現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達水平①分批培養(yǎng)中選用不同的碳源②補料培養(yǎng)中控制補料速度③連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率④向培養(yǎng)基中補加甲硫氨酸和酵母提取物⑤適當(dāng)提高培養(yǎng)基的pH值，可減少乙酸的抑制作用

這些培養(yǎng)方法的實質(zhì)是控制菌體的糖酵解速度，使之低于三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的最大代謝能力，從而避免乙酰CoA的積累和乙酸的產(chǎn)生（二）如何實現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達水平①分65二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系（一）菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系

菌體中小分子前體和催化結(jié)構(gòu)（如氨基酰-tRNA）是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，限制了菌體的比生長速率在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長速率提高，使蛋白質(zhì)合成增加，對工程菌而言，由于質(zhì)粒的復(fù)制和外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯需要與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，從而進一步加劇了這些成分的不足。因此，在同等培養(yǎng)基條件下，工程菌的比生長速率低于其宿主細胞（特別是工程菌誘導(dǎo)后表現(xiàn)更明顯）二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系（一）菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系66（二）工程菌所含質(zhì)?？截悢?shù)與前體供應(yīng)的關(guān)系①在含中等拷貝質(zhì)粒（50~60拷貝）的工程菌中，一些與前體物合成有關(guān)的酶的相對水平增高②在含高拷貝質(zhì)粒的工程菌中（200拷貝以上），前體物、核糖體、一些與翻譯有關(guān)的酶及延長因子等產(chǎn)生“嚴緊反應(yīng)”嚴緊反應(yīng)：在高拷貝質(zhì)粒工程菌中，由于質(zhì)粒復(fù)制和外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯消耗了大量前體物和催化結(jié)構(gòu)，造成蛋白質(zhì)合成過程中，因前體物和氨基酰-tRNA的不足使核糖體在密碼子上停留，并合成“魔點”ppGpp現(xiàn)象

ppGpp是一個重要的調(diào)控因子，其濃度的增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時RNA-pol在模板上的移動停頓下來，RNA鏈延長速度減慢，并使游離RNA-pol濃度降低（轉(zhuǎn)錄過程抑制）（二）工程菌所含質(zhì)?？截悢?shù)與前體供應(yīng)的關(guān)系①在含中等拷貝質(zhì)粒67第七節(jié)基因工程菌的發(fā)酵

第七節(jié)基因工程菌的發(fā)酵68

不同的發(fā)酵條件，工程菌的代謝途徑也可能不一樣，對下游的純化工藝會造成不同影響。因此，在高表達、高密度的前提下，要盡可能建立有利于下游純化的發(fā)酵工藝，以提高產(chǎn)品的純度及改善其性質(zhì)不同的發(fā)酵條件，工程菌的代謝途徑也可能不一69一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1.補料分批培養(yǎng)將種子（基因工程菌）接種至發(fā)酵反應(yīng)器，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法在此培養(yǎng)方法中，為保持工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長對數(shù)生長期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料結(jié)合起來，根據(jù)工程菌的生長規(guī)律調(diào)節(jié)補料的流加速率一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1.補料分批培養(yǎng)702.連續(xù)培養(yǎng)

將種子（基因工程菌）接種至發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，啟動進料蠕動泵，以控制稀釋率進行不間斷地培養(yǎng)，為微生物提供一個相對恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率但由于基因工程菌不夠穩(wěn)定，連續(xù)培養(yǎng)比較困難，為了解決這一問題，人們研究出兩階段連續(xù)培養(yǎng)法在此培養(yǎng)系統(tǒng)中，應(yīng)控制的參數(shù)：誘導(dǎo)水平、稀釋率和細胞比生長速率Ⅰ階段：阻遏外源基因的表達，增加工程菌的生物量Ⅱ階段：消除阻遏子的阻遏作用，誘導(dǎo)外源基因高效表達2.連續(xù)培養(yǎng)將種子（基因工程菌）接種至發(fā)酵反713.透析培養(yǎng)原理：利用膜的半透性原理，使代謝物和培養(yǎng)基分離，去除培養(yǎng)液中代謝物對工程菌的不利影響如乙酸等代謝廢物的過高積累，會限制工程菌的生長及外源基因的表達，而用透析法培養(yǎng)時就可以解決這類問題3.透析培養(yǎng)原理：利用膜的半透性原理，使代謝物和培養(yǎng)基分離，724.固定化培養(yǎng)

此種方法特別適用于分泌型菌體的培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題就是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)工程菌固定化以后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于連續(xù)培養(yǎng)（兩階段連續(xù)培養(yǎng)），因此這種培養(yǎng)方法的研究進展很快4.固定化培養(yǎng)此種方法特別適用于分泌型菌體73二、基因工程菌的發(fā)酵工藝設(shè)計基因工程菌培養(yǎng)目的是為了使外源基因大量表達，盡可能減少宿主細胞本身蛋白的污染外源基因的高效表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因之間的相互關(guān)系，而且也與其所處的環(huán)境密切相關(guān)。不同的發(fā)酵條件，代謝途徑也不相同，對下游的純化工藝就會造成不同的影響二、基因工程菌的發(fā)酵工藝設(shè)計基因工程菌培養(yǎng)目的是為了741.培養(yǎng)基的影響

培養(yǎng)基為基因工程菌的生長和外源基因的表達提供一切能源物質(zhì)。培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，使外源基因能夠高效表達

①碳源：②有機氮源：酪蛋白水解物作為氮源有利于產(chǎn)物的合成與分泌③磷：無機磷是許多初級代謝的酶促反應(yīng)中的效應(yīng)因子，過量的無機磷會刺激葡萄糖的利用、菌體的生長和氧消耗；但它會影響到目的蛋白的表達。即低濃度時影響菌體生長，高濃度時外源基因不表達，故起始磷酸鹽濃度應(yīng)一般控制在0.15mol/L左右較適宜甘油——菌體得率較高葡萄糖——菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，且葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用甘露糖——不產(chǎn)生乙酸，但菌體的比生長速率和呼吸強度較小乳糖——在作碳源的同時，還對lac啟動子起誘導(dǎo)作用1.培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基為基因工程菌的生長和752.接種量的影響

①定義：指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例②接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期，量小，菌體生長的延遲期延長，不利于外源基因的表達；量大，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長延遲期，并使產(chǎn)生菌能迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機會，但會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物累積過多，反而會抑制后期菌體的生長；所以實際工作中，接種量的大小應(yīng)取決于工程菌種在發(fā)酵液中的繁殖速度2.接種量的影響①定義：指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比76

溫度對基因表達的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成上復(fù)制:可通過控制復(fù)制來改變基因拷貝數(shù)，影響基因的表達轉(zhuǎn)錄:可通過影響RNA聚合酶的作用或修飾RNA聚合酶，來調(diào)控基因表達翻譯：影響mRNA的修飾和翻譯水平小分子調(diào)節(jié)分子：通過影響其合成，也可影響ppGpp的量，從而調(diào)控基因表達

另外，溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成，T=30℃時，目的物表達量最高；T較低時，影響菌體生長，不利于目的產(chǎn)物的表達；T較高（37℃）時，由于細菌的熱休克系統(tǒng)被激活，大量蛋白酶被誘導(dǎo)，易使表達產(chǎn)物降解

3.溫度的影響溫度對基因表達的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、77例重組人生長激素在不同的溫度培養(yǎng)條件下，產(chǎn)物的表達形式不同：30℃時產(chǎn)物可溶，而在37℃時產(chǎn)物形成包含體，對后續(xù)分離純化帶來困難例重組人生長激素在不同的溫度培養(yǎng)條件下，產(chǎn)物的表達形式784.溶解氧的影響

菌體在大量擴增過程中，進行耗氧的氧化分解代謝，溶解氧是工程菌培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)（特別是在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期，營養(yǎng)和氧對菌群代謝繁殖影響尤為顯著

）采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。在發(fā)酵前期，采用較低轉(zhuǎn)速，即可滿足菌體生長；在培養(yǎng)后期，提高攪拌轉(zhuǎn)速才能滿足菌體繼續(xù)生長的要求4.溶解氧的影響菌體在大量擴增過程中，進行79

一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期誘導(dǎo)表達，有利于提高外源蛋白的產(chǎn)量。對數(shù)生長期，細胞快速繁殖，直到細胞密度達到109個每毫升為止，這時菌群數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧的需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素如將28~30℃培養(yǎng)的工程菌通過升溫（42℃），使阻遏蛋白失活，啟動子啟動轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平5.誘導(dǎo)時機的影響一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期誘導(dǎo)表達，有利806.pH的影響

培養(yǎng)液的pH值對工程菌的正常生長和外源基因的高效表達都有影響，應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值細胞生長的最佳pH范圍在pH6.8-7.4，而外源基因表達時的最佳pH范圍6.0-6.5。所以在兩階段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長條件，培養(yǎng)液的pH范圍值應(yīng)控制在6.8-7.4；而培養(yǎng)后期著重于優(yōu)化外源基因的表達，培養(yǎng)液的pH范圍值應(yīng)控制在6.0-6.56.pH的影響培養(yǎng)液的pH值對工程菌的正81三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備1.對發(fā)酵罐的特殊要求：①能提供菌體生長的最適條件②培養(yǎng)過程不得污染③能夠保證純菌培養(yǎng)④性質(zhì)穩(wěn)定，培養(yǎng)和消毒過程中不得游離出異物⑤不能干擾細菌的代謝活動三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備1.對發(fā)酵罐的特殊要求：822.發(fā)酵罐的組成罐體攪拌裝置溫控系統(tǒng)滅菌系統(tǒng)空氣濾菌裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測量與控制裝置培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置2.發(fā)酵罐的組成罐體83第八節(jié)基因工程藥物的分離純化第八節(jié)84一、基因工程藥物制備的特點1.目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低2.含目的產(chǎn)物在初始物料組成復(fù)雜3.目的產(chǎn)物為生物活性物質(zhì)，穩(wěn)定性差4.與目的產(chǎn)物共存的物質(zhì)種類繁多5.產(chǎn)物應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高（如無菌、無熱源等）一、基因工程藥物制備的特點1.目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低85二、建立分離純化工藝的依據(jù)1.含目的產(chǎn)物的初始物料的特點

①宿主的類型及代謝特性，如表達方式等

②培養(yǎng)基的組成

③生產(chǎn)工藝和條件，如滅菌方法、生產(chǎn)方式等

④初始物料的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性2.物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)包括雜質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)、分子量、帶電性、溶解性、分配系數(shù)、揮發(fā)性等3.目的產(chǎn)物的特性包括產(chǎn)物的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性4.產(chǎn)品質(zhì)量的要求根據(jù)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途不同，對產(chǎn)品的純度、比活、貯存條件等要求不同二、建立分離純化工藝的依據(jù)1.含目的產(chǎn)物的初始物料的特點86三、分離純化的基本過程

細胞破碎固液分離濃縮與初步純化高度純化（得到純品）成品加工基本過程三、分離純化的基本過程87

發(fā)酵液細胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎固液分離包含體細胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步純化高度純化制劑成品

88四、分離純化技術(shù)分離純化技術(shù)應(yīng)滿足的要求：①技術(shù)條件要溫和

②選擇性好

③收率要高

④各種技術(shù)能直接銜接

⑤整個分離純化過程要快四、分離純化技術(shù)分離純化技術(shù)應(yīng)滿足的要求：①技術(shù)條件要溫和89（一）細胞破碎1.細胞收集：常用離心分離法，也可用膜過濾法2.細胞破碎高速勻漿法：高速剪切及高壓擠壓超聲破碎法：超聲波的聲能作功機械破碎法高速珠磨法：類似球磨機原理高壓擠壓法：先冷卻至-25~-30℃，再用500MPa以破碎方法上的高壓沖擊，擠出高壓閥孔而壓破酶溶法非機械破碎法化學(xué)滲透法熱處理法滲透壓沖擊法（一）細胞破碎1.細胞收集：常用離心分離法，也可用膜過濾法90（二）固液分離

高速離心

離心沉淀法

超速離心微濾：分離細胞、細胞碎片、包含體、蛋白質(zhì)沉淀等固體顆粒膜過濾超濾：用于濃縮蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)反滲透：脫去抗生素、氨基酸等小分子中的水分

雙水相分配法：水溶性高聚物-無機鹽組成雙水相系統(tǒng)（如PEG-無機鹽）將混合物與雙水相混合，離心分相，則PEG、目的物和雜蛋白富集在上相，而細胞碎片、核酸、多糖等分布于下相（二）固液分離91（三）目的產(chǎn)物的分離純化常用的分離純化方法是色譜法，其優(yōu)點有：

①分離機制多種多樣，可供選擇②設(shè)備簡單，便于自動化控制③分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)——保證目的產(chǎn)物的活性蛋白質(zhì)純化方法的設(shè)計是根據(jù)產(chǎn)物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)以及生物學(xué)特性的差異而定的，特別是表面性質(zhì)的差異，如表面電荷、對配基的結(jié)合活性、分子大小等（三）目的產(chǎn)物的分離純化常用的分離純化方法是色譜法，其優(yōu)點有92色譜方法1.離子交換層析2.反相色譜：利用pro分子中非極性基團（氨基酸R側(cè)鏈）與非極性固定相之間的作用力大小、pro分子中極性基團（-COOH、-NH2、-OH等）與流動相之間的作用力大小的差異進行分離3.疏水色譜：利用pro分子表面的疏水區(qū)域與固定相的疏水基團之間的相互作用，用不同濃度的無機鹽溶液洗脫（濃?。?.親和層析5.凝膠過濾層析

色譜方法1.離子交換層析93五、分離純化方法的選擇（一）根據(jù)產(chǎn)物表達形式選擇1.分泌表達產(chǎn)物由于發(fā)酵液體積大，濃度低，純化前需用沉淀、超濾等方法進行濃縮2.E.Coli胞內(nèi)可溶性表達產(chǎn)物，破菌后上清液首選親和層析分離，也可用離子交換層析3.包含體：①用離心分離或過濾法與其他可溶性雜質(zhì)分離②分離出的包含體以促溶劑（尿素、SDS等）溶解，在適當(dāng)條件下復(fù)性（注：此法得到的pro產(chǎn)品活性不可靠，復(fù)性時易錯誤折疊）五、分離純化方法的選擇（一）根據(jù)產(chǎn)物表達形式選擇94（二）根據(jù)分離單元之間的銜接選擇

各分離單元之間應(yīng)該做到自然銜接，不能為了銜接，額外補加脫鹽、濃縮、稀釋等步驟。這就要求工藝設(shè)計時必須熟悉各分離純化方法的具體操作原理及適用條件。如親和層析由于選擇性強，且分離介質(zhì)昂貴，故一般不放在第一步，而應(yīng)放在較后面經(jīng)預(yù)處理后的關(guān)鍵步驟中（二）根據(jù)分離單元之間的銜接選擇各分離單元95（三）根據(jù)分離純化工藝的要求選擇分離純化工藝應(yīng)遵循的原則

1.具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性

2.盡可能減少工藝步驟

3.組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè)備也能相互適應(yīng)；從而減少步驟間對物料的處理和條件調(diào)整

4.盡可能少用試劑

5.分離純化工藝時間盡可能短，以免影響產(chǎn)品的生物活性

6.工藝和技術(shù)必須高效、高回收率、設(shè)備條件低、易操作、能耗低

7.工藝安全性好，保證產(chǎn)品安全、無菌、無熱源、無污染（三）根據(jù)分離純化工藝的要求選擇分離純化工藝應(yīng)遵循的原則96第九節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第九節(jié)97

用活細胞作為表達體系，所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，許多藥物是參與一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，所以任何藥物在性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能造成嚴重的后果，從原料開始每一步都要進行嚴格的控制

基因工程藥物的特點用活細胞作為表達體系，所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往98一、原料的質(zhì)量控制

原料的質(zhì)量控制是為了保證編碼pro的DNA序列的正確性，以及產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性

了解下列特征：目的基因的來源、克隆的經(jīng)過、并用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列等予以確證、應(yīng)提供表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組分（復(fù)制子、啟動子）的來源與功能、構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜、抗生素抗性標(biāo)志物、提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性，需闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體上及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細胞與載體結(jié)合后遺傳穩(wěn)定性，提供插入基因與表達載體倆側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞表達的方法與水平等

一、原料的質(zhì)量控制原料的質(zhì)量控制是為了保證編99二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制①儲存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定②培養(yǎng)中，工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變③在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物的污染

生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫。原始種子批需確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存以預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定在高允許傳代數(shù)；培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細胞系統(tǒng)和產(chǎn)品二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制①儲存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定100三、純化工藝過程的質(zhì)量控制

要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)都在規(guī)定的限度以下

在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)

三、純化工藝過程的質(zhì)量控制要有足夠的生理和生101四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制1.產(chǎn)品的鑒別

①肽圖分析：用酶法和化學(xué)方法降解目的蛋白，對生成的肽段進行分離分析，檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細微變化的最有效方法。靈敏、高效。高效液相色譜和毛細管電泳②氨基酸成分分析：小于50個氨基酸分析結(jié)果較可靠③部分氨基酸序列分析：氨基端15個氨基酸④重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子量測定：濃度，凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法。分子量，凝膠過濾法（完整）和SDS法（亞基）⑤蛋白質(zhì)二硫鍵分析：維持蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要共價鍵四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制1.產(chǎn)品的鑒別

①肽圖分析：用酶法和102

目的pro含量測定：SDS、等電點聚焦、HPLC、CE等菌體蛋白蛋白質(zhì)類雜質(zhì)降解蛋白聚合蛋白雜質(zhì)限量分析微生物——微生物學(xué)檢測法非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)熱源質(zhì)——家兔法內(nèi)毒素——鱟試驗

DNA——核酸雜交法2.純度分析目的pro含量測定：SDS、等電點聚1033.生物活性測定

體內(nèi)生物活性：根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型，進行測定體外生物活性：用細胞計數(shù)法等3.生物活性測定體內(nèi)生物活性：根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立1044.穩(wěn)定性考察穩(wěn)定性考察是評價藥品安全性的重要指標(biāo)，也是確定藥品儲藏條件和使用期限的主要依據(jù)。對溫度、氧化、光照、離子濃度和機械剪切等環(huán)境因素都很敏感

4.穩(wěn)定性考察穩(wěn)定性考察是評價藥品安全性的重要1055.產(chǎn)品一致性的保證

由于基因工程制藥的生產(chǎn)周期長，工藝復(fù)雜，影響因素多，必須對每一步都進行嚴格的控制和質(zhì)量檢定5.產(chǎn)品一致性的保證由于基因工程制藥的生產(chǎn)106五、產(chǎn)品的保存目的產(chǎn)物受多種因素的影響而失活，保存時要防止變性、降解、保護活性中心

低溫保存：對熱敏感。

在穩(wěn)定pH條件下保存：防止變性。

液態(tài)保存高濃度保存：高濃度時比較穩(wěn)定。

加保護劑保存：糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機溶劑等；有些需加鹽，加2-巰基乙醇在真空或惰性氣體中保存

固體保存固體蛋白質(zhì)比液體穩(wěn)定，在室溫或冰箱中保存比較穩(wěn)定，長期保存最好制成干粉或結(jié)晶五、產(chǎn)品的保存目的產(chǎn)物受多種因素的影響而失活，107第十節(jié)基因工程藥物制造實例第十節(jié)108

干擾素（interferonIFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為α、β、γ、ω等4個類型。α干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區(qū)別在于個別氨基酸的差異上，早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的，產(chǎn)量低、價格昂貴，不能滿足需要，現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達來進行生產(chǎn)

背景干擾素（interferonIFN）是人體109一、基因工程菌的組建①將生產(chǎn)干擾素的白細胞的mRNA分級分離，然后將不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母細胞，并測定合成干擾素的抗病毒活性②用活性最強的這部分mRNA合成cDNA③將其克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的幾千個重組子克隆，每個克隆都用粗提的干擾素的mRNA去進行雜交，把得到的雜交陽性克隆中的重組質(zhì)粒DNA放到一個無細胞蛋白合成體系中進行翻譯，對每一個翻譯體系的產(chǎn)物進行抗病毒的干擾素活性檢測，經(jīng)過多輪篩選獲得了產(chǎn)生干擾素的cDNA④將干擾素cDNA克隆入大腸桿菌表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行高效表達一、基因工程菌的組建①將生產(chǎn)干擾素的白細胞的mRNA分級分110二、基因工程干擾素的制備

啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提半成品制備半成品檢定成品包裝成品檢定凍干分裝二、基因工程干擾素的制備啟開種子制備種子液111人干擾素α2b基因工程菌為SW-IFNα-2b/E.coliDH5α,PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因，種子培養(yǎng)基含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉。分別接種人干擾素α2b基因工程菌到4個裝有250毫升種子培養(yǎng)基的1000毫升搖瓶中，30℃培養(yǎng)10小時，作為發(fā)酵罐種子用15升發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為10升，發(fā)酵培養(yǎng)基由1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.01%氯化銨、0.05%氯化鈉、0.6%磷酸氫二鈉、0.001%氯化鈣、0.3%磷酸二氫鉀0.01%硫酸鎂、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升氨芐青霉素、少量防泡劑組成，pH6.8。轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)每分，通氣量為1：1溶氧為50%。30℃發(fā)酵8小時，然后在42℃誘導(dǎo)2-3小時完成發(fā)酵。同時每隔不同時間取2毫升發(fā)酵液，10000轉(zhuǎn)每分離心除去上清夜，稱量菌體重量

1.發(fā)酵人干擾素α2b基因工程菌為SW-IFNα-2b/E.1122.產(chǎn)物的提取和純化

發(fā)酵完畢后，冷卻，進行4000rpm離心，離心30min，得濕菌體1000克左右。取100克濕菌體重新懸浮于500ml20mmol/LPBS（pH7.0），于冰浴條件下進行超聲波破碎，然后4000rpm，離心30min，取沉淀部分，用100ml含8mol/L尿素、20mmol/LPBS（pH7.0）

、0.5mmol/L二巰基蘇糖醇的溶液，室溫攪拌抽提2h，然后用15000rpm離心，30min，取上清夜，用20mmol/LPBS（pH7.0）稀釋至尿素濃度為0.5mmol/L，加二巰基蘇糖醇至0.1mmol/L，4℃攪拌，15h，15000rpm，離心30min除去不溶物。

上清夜經(jīng)截流量為10000相對分子量的中空纖維超濾器濃縮，將濃縮的人干擾素α2b溶液經(jīng)過SephadexG50分離，層析柱2cm*100cm，先用20mmol/LPBS（pH7.0）平衡，上柱后用同一緩沖液洗脫分離，收集人干擾素α2b部分，經(jīng)SDS檢查

將SephadexG50柱分離的人干擾素α2b組分，再經(jīng)DE-52柱（2厘米*50厘米）純化人干擾素α2b組分，上柱后用含0.05、0.1、0.15mmol/L氯化鈉的20mmol/LPBS（pH7.0）分別洗滌，收集含人干擾素α2b的洗脫液。

全過程蛋白回收率為20-25%，產(chǎn)品不含雜蛋白，DNA及熱源含量合格2.產(chǎn)物的提取和純化發(fā)酵完畢后，冷卻，進行113三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求

1.半成品檢定

效價測定、蛋白質(zhì)含量測定、活性測定、比活性測定、純度測定、相對分子量測定、核酸含量測定、鼠IgG含量測定、等電點測定、無菌試驗、熱源質(zhì)試驗等

2.成品檢定

外觀、活性、水分、無菌試驗、安全毒性、熱源質(zhì)三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求1.半成品檢定

效價測定、蛋白114四、人胰島素融合蛋白重組菌株的組建

選Lac啟動子，構(gòu)建了以牛凝乳酶原B前161個氨基酸的多肽基因與人胰島素原基因組成的融合基因的表達質(zhì)粒pJG202，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，表達受IPTG及溫度誘導(dǎo)。高表達時，按電泳掃描計算，表達的融合蛋白可占細胞總蛋白的20-35%。經(jīng)CNBr裂解，S-磺酸酸解，初步分離S-磺酸型的人胰島素原后再使之重組，可分離得到人胰島素原純品，其氨基酸組成、生物活性與人胰島素原標(biāo)準(zhǔn)相同四、人胰島素融合蛋白重組菌株的組建選Lac啟115五、乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建

將乙型肝炎表面抗原基因插入調(diào)控型啟動子PH05的乳酸克魯維表達載體中，構(gòu)建完整質(zhì)粒pLS1，轉(zhuǎn)化宿主菌CXJ1-7A。為了進一步提高表達水平，將pLS1中的乙型肝炎表面抗原表達單元插入帶完整pKD1序列的載體PE1，并將構(gòu)建成的質(zhì)粒pLS2轉(zhuǎn)化MW98-8C。在比較了CXJ-7A/pLS1和MW98-8C/pLS2后，發(fā)現(xiàn)MW98-8C/pLS2的穩(wěn)定性大大提高，表達量也增加了4-8倍五、乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建將乙型肝116六、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用

1.提高抗生素產(chǎn)量

工業(yè)使用的抗生素產(chǎn)生菌都是通過物理或化學(xué)方法誘變后得到的，如果利用基因工程技術(shù)有目的地定向改造基因，可提高基因的表達水平

（1）將產(chǎn)生菌基因隨即克隆到原株直接篩選高產(chǎn)菌

在克隆菌株中，增加某一與產(chǎn)量有關(guān)的基因劑量，使產(chǎn)量得到提高

（2）增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)

設(shè)法導(dǎo)入能提高這個階段酶系的基因拷貝數(shù)，可增加最終抗生素的產(chǎn)量

（3）通過調(diào)節(jié)基因的作用

調(diào)節(jié)基因的作用可增加或降低抗生素的產(chǎn)量，因此，增加正調(diào)節(jié)基因或降低負調(diào)節(jié)基因的作用，可增加抗生素的產(chǎn)量

（4）增加抗性基因

抗性基因可通過其產(chǎn)物滅活胞內(nèi)或胞外的抗生素，保護自身免受所產(chǎn)生的抗生素的殺滅作用六、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用1.提高抗生素產(chǎn)量

117

許多抗生素產(chǎn)生菌可產(chǎn)生多組分抗生素，由于這些組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，而其生物活性有時卻相差很大，這給有效組分的發(fā)酵、提取和精制帶來了很大不便隨著對抗生素生物合成途徑和深入了解及基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用基因工程技術(shù)可以定向地改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種2.改善抗生素組分許多抗生素產(chǎn)生菌可產(chǎn)生多組分抗生素，由于這些1183.改進抗生素生產(chǎn)工藝

抗生素的合成一般對氧的供應(yīng)較為敏感，不能大量供氧往往是高產(chǎn)發(fā)酵的限制因素。為了使細胞處于有氧呼吸狀態(tài)，傳統(tǒng)方法是：改變最適操作條件；降低細胞生長速率；培養(yǎng)密度。提高供氧水平只能從設(shè)備和操作角度考慮，提高溶氧水平或氣液傳質(zhì)系數(shù)，提高發(fā)酵罐中無菌空氣的通入量，并采用各種攪拌裝置，使空氣分散，滿足菌體生長的要求?？諝獾膲嚎s、冷卻或過濾、攪拌都要消耗大量的能源，但結(jié)果并不理想。進入液相的氧分子需要穿過幾層膜才能到達菌體，進入菌體后，還要經(jīng)物理擴散才能到達產(chǎn)生能量的呼吸細胞器如在菌體內(nèi)導(dǎo)入與氧有親和力的血紅蛋白，呼吸細胞就能容易的獲得足夠的氧，降低細胞對氧的敏感程度，利用它改善發(fā)酵過程中溶氧的控制程度。利用基因重組技術(shù)克隆血紅蛋白基因到抗生素產(chǎn)生菌中，在細胞中表達血紅蛋白，可以從提高細胞自身代謝功能入手解決溶氧供求矛盾

3.改進抗生素生產(chǎn)工藝抗生素的合成一般對氧的1194.產(chǎn)生雜合抗生素

不同抗生素合成基因重組；生物合成途徑中某個酶基因的突變；在生物合成途徑中引入一個酶基因；利用底物特異性不強的酶催化形成新產(chǎn)物

4.產(chǎn)生雜合抗生素不同抗生素合成基因重組120七、基因工程在氨基酸和維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用1.在氨基酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸是菌體的一系列酶作用的初級代謝產(chǎn)物?？寺∧承┟赶祷?，在大腸桿菌中進行表達

2.在維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用