轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件

轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物TransgenicAnimalandClonalAnimal

轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物TransgenicAnimal1內(nèi)容

轉(zhuǎn)基因動物克隆動物概述、方法、應(yīng)用體細胞克隆內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動物克隆動物概述、方法、應(yīng)用體細胞克隆2第一部分轉(zhuǎn)基因動物第一部分轉(zhuǎn)基因動物31974年Jaenisch等用病毒SV40轉(zhuǎn)化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宮內(nèi)，在小鼠的后代中檢測到SV40基因的存在，進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)嘗試，這是最早有關(guān)動物轉(zhuǎn)基因的報道。1980年，Gordon等首次采用受精卵原核顯微注射法，首次將皰疹病毒和SV40的DNA片段導(dǎo)入小鼠基因組，成功制作轉(zhuǎn)基因小鼠，開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動物的新紀元。一、研究概況1974年Jaenisch等用病毒SV40轉(zhuǎn)化的小鼠早期胚胎41982年P(guān)almiter-“超級巨鼠”

華盛頓大學(xué)的Palmiter將大鼠的生長激素基因注射到小鼠受精卵內(nèi),

培育出體型明顯大于正常小鼠的超級鼠,

成果轟動一時。1982年P(guān)almiter-“超級巨鼠”

華盛頓5轉(zhuǎn)基因小鼠A生長速度要比普通小鼠B的生長速度平均快50%。

轉(zhuǎn)基因小鼠A生長速度要比普通小鼠B的生長速度平均快50%。6

1982年P(guān)almiter“超級巨鼠”重組質(zhì)粒鼠金屬巰基蛋白啟動子之后

大鼠生長激素基因置于小

Plonucleus（雄原核）顯微注射小鼠子宮卵移植SOUTHERN雜交檢測超級巨鼠1982年P(guān)almiter“超級巨7轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件81987年

世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因

綿羊誕生(Roslin研究所)1989年

精子載體法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物2019年

轉(zhuǎn)基因克隆動物(Roslin研究所)轉(zhuǎn)基因克隆羊Polly:攜帶有人凝血因子Ⅸ

2019年

上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試

管牛“滔滔”誕生

1987年世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因

9三十幾年里，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因魚等陸續(xù)育成。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、畜牧學(xué)等研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件10轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因鼠115只克隆出的轉(zhuǎn)基因小豬Noel、Angel、Star、Joy和Mary。5只克隆出的轉(zhuǎn)基因小豬12全球首只轉(zhuǎn)基因猴“Andy”全球首只轉(zhuǎn)基因猴“Andy”13轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因魚14轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀鞭D(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀?5英國1990－2000年科研中使用轉(zhuǎn)基因動物的比例圖英國1990－2000年科研中使用轉(zhuǎn)基因動物的比例圖16

三十年來，轉(zhuǎn)基因動物經(jīng)歷了

興起——高潮——現(xiàn)在相對平穩(wěn)的過程。其重要意義在于人為實現(xiàn)動物物種之間，甚至動物與植物、微生物之間遺傳物質(zhì)的交換與重組。如：改變動物性狀

導(dǎo)入抗病基因三十年來，轉(zhuǎn)基因動物經(jīng)歷了17二、轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物（Transgenicanimal）嵌合體動物（Chimericanimal）指染色體基因組中整合有外源基

并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物部分組織細胞中整合有外源基因組的動物二、轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物（Transgenicani18三、轉(zhuǎn)基因動物培育原理

三、轉(zhuǎn)基因動物培育原理19四、方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒法ES（胚胎干細胞）法四、方法20

精子載體法脂質(zhì)體載體法電脈沖法基因槍法體細胞核移植技術(shù)（轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)）精子載體法脂質(zhì)體載體法電脈沖法基因槍法體21（一）顯微注射法

（以培育轉(zhuǎn)基因小鼠為例）（一）顯微注射法221.方法1.方法23顯微注射制作轉(zhuǎn)基因動物流程圖顯微注射制作轉(zhuǎn)基因動物流程圖242.具體步驟

（1）前期準備實驗動物：供體鼠、受體鼠、結(jié)扎雄鼠儀器設(shè)備：拉針儀、煅針儀、體視鏡、顯微注射儀實驗試劑耗材：超排激素：PMSG、HCG、透明質(zhì)酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培養(yǎng)液：M2、M16、注射用礦物油、注射針、持卵針

2.具體步驟（1）前期準備25顯微注射儀顯微注射儀26拉針儀煅針儀體視鏡拉針儀煅針儀體視鏡27（2）受精卵的采集

供體鼠超排：PMSG,ipHCG,ip

48hr輸卵管膨大部受精卵的采集受精卵消化、洗滌、培養(yǎng)（2）受精卵的采集供體鼠超排：輸卵管膨大部受28受精卵的采集受精卵的采集29受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后受精卵原核清晰的受精卵受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后受精卵原核清晰的受精卵30注射前注射后（3）受精卵的顯微注射注射中注射前注射后（3）受精卵的顯微注射注射中31（4）受精卵的移植受體假孕鼠的制備：母鼠與結(jié)扎公鼠合籠（與供體鼠同步）假孕鼠的挑選注射后收集卵的移植（4）受精卵的移植受體假孕鼠的制備：假孕鼠的挑選注射后32受精卵的移植受精卵的移植33（5）得到founder轉(zhuǎn)基因小鼠

（6）對founder轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定、篩選、雜交獲得純合轉(zhuǎn)基因小鼠（5）得到founder轉(zhuǎn)基因小鼠

（6）對f34（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒法（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒法35關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的病毒類的總稱。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的作用下可以將本身的單鏈RNA作為模板進行復(fù)制和遺傳信息的傳遞。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的36原理1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度整合的特性。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒能作為目的基因載體，通過感染早期胚胎細胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生嵌合體動物，再經(jīng)過雜交、篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。原理1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度37關(guān)鍵步驟（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

①提取病毒DNA②將DNA克隆載體中③酶切病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)④將外源目的基因克隆到載體⑤轉(zhuǎn)染細胞，測定外源基因的表達。

關(guān)鍵步驟（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

38（2）包裝細胞

決定著重組病毒效價及其宿主范圍。常用φ-2細胞株（3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎載體轉(zhuǎn)染包裝細胞后與8細胞胚胎共培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)染（4）胚胎移植（5）建系（2）包裝細胞

39（三）胚胎干細胞介導(dǎo)法（ES細胞法）（三）胚胎干細胞介導(dǎo)法40關(guān)于ES細胞1、胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）人或動物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干細胞，稱胚胎干細胞。2、它與早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織。關(guān)于ES細胞1、胚胎干細胞（embryonicstemc41原理

將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，便可獲得由胚胎干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動物。原理將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入胚泡期的宿主42關(guān)鍵步驟①ES細胞的分離培養(yǎng)②ES細胞基因操作

電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等方法

③獲取囊胚期胚胎④顯微操作ES細胞注射到囊胚期胚胎內(nèi)

⑤胚胎移植關(guān)鍵步驟①ES細胞的分離培養(yǎng)43三種轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較三種轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較44優(yōu)點：

1、整合率相對較高2、可導(dǎo)入基因片斷較長3、外源基因整合于所有的組織細胞中的概率高缺點：

1、整合率隨機2、有些動物原核看不清，需經(jīng)特殊處理才能有效導(dǎo)入3、需較精密儀器，費用昂貴顯微注射法優(yōu)點：顯微注射法45優(yōu)點：1、胚胎存活率高2、病毒DNA隨機單拷貝整合3、宿主范圍廣

缺點：

1、整合率不高，整合位點是隨機的2、后代多為嵌合體動物3、外源基因易發(fā)生重排或丟失4、病毒載體容量不大5、病毒DNA序列可能會干擾外源基因的表達

逆轉(zhuǎn)錄病毒法

優(yōu)點：逆轉(zhuǎn)錄病毒法46優(yōu)點：

1、整合率可控2、可用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，其細胞的鑒定和篩選比較方便3、ES細胞注入囊胚及囊胚移植到子宮，操作比較簡便

缺點：

1、ES細胞系培養(yǎng)、保存和維持不易2、后代多為嵌合體3、所需時間較長

ES細胞法

優(yōu)點：ES細胞法47五、轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)外源目的基因的制備外源目的基因的有效導(dǎo)入受精卵（胚胎）培養(yǎng)與移植外源目的基因表達的檢測等五、轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)外源目的基因的制備48六、應(yīng)用價值研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控建立人類疾病動物模型研究人類疾病基因治療

研制生物反應(yīng)器擴大移植供體來源改良動物品種

六、應(yīng)用價值研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控491、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控Geneknockout(基因敲除)：

是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。

1、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控Geneknocko502、動物疾病模型200多種動物模型建立（病毒、遺傳、腫癌及眼疾病等）800余種人為改造小鼠產(chǎn)生其中開發(fā)最成功的是轉(zhuǎn)基因小鼠2、動物疾病模型200多種動物模型建立（病毒、遺傳、腫癌及眼51HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩

HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩523.基因治療（genetherapy）

指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過調(diào)控目的基因表達，抑制、替代或補償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細胞、組織或器官的生理功能，達到疾病治療目的的一種方法。轉(zhuǎn)基因動物為人類疾病基因治療提供了良好的實驗依據(jù)和模型3.基因治療（genetherapy）534、研制生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器：

將藥用蛋白或具有特殊意義的蛋白質(zhì)基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?，培育成轉(zhuǎn)基因動物，使之在動物體內(nèi)（如乳腺、血液等）高效表達，生產(chǎn)出天然活性蛋白，這種轉(zhuǎn)基因動物就稱之為動物生物反應(yīng)器

4、研制生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器：54優(yōu)勢目標產(chǎn)品產(chǎn)量高，容易收獲目標產(chǎn)品質(zhì)量好生產(chǎn)成本相對較低目標產(chǎn)品的提取相對較容易優(yōu)勢目標產(chǎn)品產(chǎn)量高，容易收獲55主要動物牛、羊、豬、雞主要靶器容乳腺、血液系統(tǒng)、膀胱及雞輸卵管系統(tǒng)主要動物牛、羊、豬、雞主要靶器容乳腺、血液系統(tǒng)、膀胱56用動物乳腺表達外源基因的主要種類產(chǎn)品類別舉例血液產(chǎn)品第8因子、第9因子、C蛋白、凝血酶III、

抗胰蛋白酶、血纖蛋白原抗體單克隆抗體藥物干擾素、人生長激素、tPA、EPO疫苗Malaria組織維生物Collagen營養(yǎng)藥乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、人源化牛奶工業(yè)蛋白質(zhì)蜘蛛網(wǎng)蛋白、貝類分泌的黏蛋白用動物乳腺表達外源基因的主要種類57我國乳腺生物反應(yīng)器研究情況

目的基因名稱產(chǎn)品的主要功能承擔單位

人血清白蛋白血液溶脹劑中國農(nóng)業(yè)大學(xué)人干擾素抗病毒因子中國農(nóng)業(yè)大學(xué)雞法氏囊病毒VP雞疫苗中國農(nóng)業(yè)大學(xué)第九因子血友病治療上海兒童醫(yī)院

EPO細胞因子上海兒童醫(yī)院人胰島素原糖尿病治療新疆牧科院

TPA治療血栓軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院人生長激素生長激素不足揚州大學(xué)我國乳腺生物反應(yīng)器研究情況58現(xiàn)狀已有約10種基因在大動物上得到高表達（1g/L以上），其中抗胰蛋白酶、凝血酶Ⅲ和葡萄糖苷酶進入臨床實驗階段。世界上只有少數(shù)幾頭轉(zhuǎn)基因牛問世，還沒有生產(chǎn)出具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因?！，F(xiàn)狀已有約10種基因在大動物上得到高表達（1g/L以上），其59難點主要問題研制時間長、技術(shù)復(fù)雜、投資過大、風(fēng)險性高轉(zhuǎn)基因技術(shù)局限性基因調(diào)控機制難點主要問題研制時間長、技術(shù)復(fù)雜、轉(zhuǎn)基因技術(shù)局限性60攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因?！疤咸稀?/p>

攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因?！疤咸稀?1五、異種移植豬的器官大小、解剖生理特點與人類相似，其組織相容性抗原與人有較高的同源性。“三關(guān)”超急性排斥延緩性排斥、慢性排斥通過轉(zhuǎn)基因來解決異種器官排斥的問題

五、異種移植豬的器官大小、解剖生理特點與人類相似，其組織相容62英國：將人的CD55、CD59轉(zhuǎn)入豬中，在仔豬血管內(nèi)皮細胞表達CD55、CD59。

將此轉(zhuǎn)基因豬的心臟移植給猴，存活了10天。同濟：將人的DFA轉(zhuǎn)入豬中，此轉(zhuǎn)基因豬的心臟在猴體內(nèi)存活了90小時英國：將人的CD55、CD59轉(zhuǎn)入豬中，在63六、品種改良

?

生長相關(guān)基因?產(chǎn)毛性能相關(guān)基因?抗病毒相關(guān)基因六、品種改良64生長激素基因轉(zhuǎn)基因豬：生長速度提高了10~15%飼料報酬和瘦肉率提高了10%主要問題：

該轉(zhuǎn)基因豬傳了7代，仍未生產(chǎn)出純合的轉(zhuǎn)基因家系。生長激素基因轉(zhuǎn)基因豬：65七、主要設(shè)備七、主要設(shè)備66顯微操作儀顯微操作儀67拉針儀煅針儀拉針儀煅針儀68電融合儀電融合儀69電極杯電極杯70細胞融合操作界面細胞融合操作界面71CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱72體視顯微鏡體視顯微鏡73評述小鼠模型成功率高現(xiàn)轉(zhuǎn)基因方法存在局限性，轉(zhuǎn)基因率低現(xiàn)有的理論和技術(shù)還不能使人們隨心所欲操

作動物基因組轉(zhuǎn)基因動物仍具有商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?jié)摿υu述小鼠模型成功率高74第二部分克隆動物第二部分克隆動物75克?。–lone）WHO:遺傳上同一的機體或細胞系（株）的無性生殖?？寺游铮╟lonalanimal）

是指用人工方法得到無性繁殖的在遺傳上與親本動物完全相同的動物克隆（Clone）WHO:遺傳上同一的機體或細胞系（株）的無76動物克隆方法一、胚胎分割二、細胞核移植——胚胎細胞核移植——體細胞核移植動物克隆方法一、胚胎分割二、細胞核移植——胚胎細胞核移植77一、胚胎分割法

將未著床的早期胚胎經(jīng)顯微手術(shù)后，分割為二、四、六若干等份，給每個受體內(nèi)植入一部分胚胎而妊娠產(chǎn)仔，這樣由一個胚胎可以克隆出多個遺傳性能完全一樣的后代個體。

原理實質(zhì)多胞胎復(fù)制一、胚胎分割法將未著床的早期胚胎經(jīng)顯微手術(shù)后，分割為78

二、核移植法（nucleartransfer）

二、核移植法79（一）胚胎細胞核移植

把發(fā)育到后期的胚胎的細胞核取出通過顯微操作移植到另一去核卵中發(fā)育出新個體

1、基本思路

（一）胚胎細胞核移植把發(fā)育到后期的胚胎的細胞核取1、802、操作程序(1)卵母細胞去核：吸管吸除法紫外線照射法

(2)核供體的準備和移植:單個卵裂球(3)卵裂球與卵子的融合:電融合法(4)卵子的激活：電脈沖法(5)克隆胚胎的培養(yǎng)和移植2、操作程序813、存在問題

效率太低：

克隆胚胎的成活率只有10％～20％，成本太高3、存在問題82（二）體細胞核移植

2019年，《Nature》雜志發(fā)表了Roslin研究所的Wilmut等用乳腺細胞核移植培育克隆綿羊—“多莉(Dolly)”的實驗報告，引起世人矚目！

（二）體細胞核移植2019年，《Nature》雜志發(fā)表83Wilmut

andDollyWilmutandDolly84什么是體細胞克??？將體細胞核移入去核的卵母細胞中，使卵母細胞被刺激、分裂并發(fā)育成個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。什么是體細胞克隆？將體細胞核移入去核的卵母細胞中，使卵母細胞85體細胞克隆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)體細胞克隆的主要程序與胚胎細胞克隆基本相同，其主要差別在供體細胞的選擇血清饑餓法：在血清濃度從10℅降至0.5℅的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5d誘導(dǎo)至靜止期然后移入去核卵母細胞，恢復(fù)體細胞的全能性體細胞克隆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)體細胞克隆的主要程序與胚胎細胞克隆基本相86技術(shù)線路圖技術(shù)線路圖87劃時代意義理論上

證明了分化了的動物體細胞核也具有全能性，在分化過程中細胞核中的遺傳物質(zhì)沒有不可逆變化劃時代意義理論上證明了分化了的動物體細胞核也具有全能性88

證明了利用體細胞進行動物克隆的技術(shù)是可行的，將有無數(shù)相同的細胞可用來作為供體進行核移植，并且在與卵細胞相融合前可對這些供體細胞進行一系列復(fù)雜的遺傳操作，從而為大規(guī)模復(fù)制動物優(yōu)良品種和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物提供了有效方法。實踐上證明了利用體細胞進行動物克隆的技術(shù)是可行的，將有無數(shù)89克隆動物與克隆技術(shù)的應(yīng)用1、培育遺傳均一的實驗動物2、培育優(yōu)良畜種和拯救瀕危動物

3、制備轉(zhuǎn)基因克隆動物4、治療性克隆（therapeuticcloning）

克隆動物與克隆技術(shù)的應(yīng)用1、培育遺傳均一的實驗動物2、培育優(yōu)90

此外，克隆技術(shù)在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用也是很有意義的，它為研究配子和胚胎發(fā)生，細胞和組織分化，基因表達調(diào)控，核質(zhì)互作等機理提供了工具轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件91存在的問題克隆技術(shù)在理論和技術(shù)上都還很不成熟。在實踐中，克隆動物的成功率還很低。生出的部分個體表現(xiàn)出生理或免疫缺限。倫理道德的沖擊和公眾對此的強烈反應(yīng)也限制了克隆技術(shù)的應(yīng)用。存在的問題克隆技術(shù)在理論和技術(shù)上都還很不成熟。92謝謝大家！謝謝大家！93轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物TransgenicAnimalandClonalAnimal

轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物TransgenicAnimal94內(nèi)容

轉(zhuǎn)基因動物克隆動物概述、方法、應(yīng)用體細胞克隆內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動物克隆動物概述、方法、應(yīng)用體細胞克隆95第一部分轉(zhuǎn)基因動物第一部分轉(zhuǎn)基因動物961974年Jaenisch等用病毒SV40轉(zhuǎn)化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宮內(nèi)，在小鼠的后代中檢測到SV40基因的存在，進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)嘗試，這是最早有關(guān)動物轉(zhuǎn)基因的報道。1980年，Gordon等首次采用受精卵原核顯微注射法，首次將皰疹病毒和SV40的DNA片段導(dǎo)入小鼠基因組，成功制作轉(zhuǎn)基因小鼠，開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動物的新紀元。一、研究概況1974年Jaenisch等用病毒SV40轉(zhuǎn)化的小鼠早期胚胎971982年P(guān)almiter-“超級巨鼠”

華盛頓大學(xué)的Palmiter將大鼠的生長激素基因注射到小鼠受精卵內(nèi),

培育出體型明顯大于正常小鼠的超級鼠,

成果轟動一時。1982年P(guān)almiter-“超級巨鼠”

華盛頓98轉(zhuǎn)基因小鼠A生長速度要比普通小鼠B的生長速度平均快50%。

轉(zhuǎn)基因小鼠A生長速度要比普通小鼠B的生長速度平均快50%。99

1982年P(guān)almiter“超級巨鼠”重組質(zhì)粒鼠金屬巰基蛋白啟動子之后

大鼠生長激素基因置于小

Plonucleus（雄原核）顯微注射小鼠子宮卵移植SOUTHERN雜交檢測超級巨鼠1982年P(guān)almiter“超級巨100轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件1011987年

世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因

綿羊誕生(Roslin研究所)1989年

精子載體法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物2019年

轉(zhuǎn)基因克隆動物(Roslin研究所)轉(zhuǎn)基因克隆羊Polly:攜帶有人凝血因子Ⅸ

2019年

上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試

管?！疤咸稀闭Q生

1987年世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因

102三十幾年里，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因魚等陸續(xù)育成。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、畜牧學(xué)等研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)基因動物及克隆動物-精選課件103轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因鼠1045只克隆出的轉(zhuǎn)基因小豬Noel、Angel、Star、Joy和Mary。5只克隆出的轉(zhuǎn)基因小豬105全球首只轉(zhuǎn)基因猴“Andy”全球首只轉(zhuǎn)基因猴“Andy”106轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因魚107轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀?08英國1990－2000年科研中使用轉(zhuǎn)基因動物的比例圖英國1990－2000年科研中使用轉(zhuǎn)基因動物的比例圖109

三十年來，轉(zhuǎn)基因動物經(jīng)歷了

興起——高潮——現(xiàn)在相對平穩(wěn)的過程。其重要意義在于人為實現(xiàn)動物物種之間，甚至動物與植物、微生物之間遺傳物質(zhì)的交換與重組。如：改變動物性狀

導(dǎo)入抗病基因三十年來，轉(zhuǎn)基因動物經(jīng)歷了110二、轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物（Transgenicanimal）嵌合體動物（Chimericanimal）指染色體基因組中整合有外源基

并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物部分組織細胞中整合有外源基因組的動物二、轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物（Transgenicani111三、轉(zhuǎn)基因動物培育原理

三、轉(zhuǎn)基因動物培育原理112四、方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒法ES（胚胎干細胞）法四、方法113

精子載體法脂質(zhì)體載體法電脈沖法基因槍法體細胞核移植技術(shù)（轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)）精子載體法脂質(zhì)體載體法電脈沖法基因槍法體114（一）顯微注射法

（以培育轉(zhuǎn)基因小鼠為例）（一）顯微注射法1151.方法1.方法116顯微注射制作轉(zhuǎn)基因動物流程圖顯微注射制作轉(zhuǎn)基因動物流程圖1172.具體步驟

（1）前期準備實驗動物：供體鼠、受體鼠、結(jié)扎雄鼠儀器設(shè)備：拉針儀、煅針儀、體視鏡、顯微注射儀實驗試劑耗材：超排激素：PMSG、HCG、透明質(zhì)酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培養(yǎng)液：M2、M16、注射用礦物油、注射針、持卵針

2.具體步驟（1）前期準備118顯微注射儀顯微注射儀119拉針儀煅針儀體視鏡拉針儀煅針儀體視鏡120（2）受精卵的采集

供體鼠超排：PMSG,ipHCG,ip

48hr輸卵管膨大部受精卵的采集受精卵消化、洗滌、培養(yǎng)（2）受精卵的采集供體鼠超排：輸卵管膨大部受121受精卵的采集受精卵的采集122受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后受精卵原核清晰的受精卵受精卵的消化、培養(yǎng)消化、洗滌后受精卵原核清晰的受精卵123注射前注射后（3）受精卵的顯微注射注射中注射前注射后（3）受精卵的顯微注射注射中124（4）受精卵的移植受體假孕鼠的制備：母鼠與結(jié)扎公鼠合籠（與供體鼠同步）假孕鼠的挑選注射后收集卵的移植（4）受精卵的移植受體假孕鼠的制備：假孕鼠的挑選注射后125受精卵的移植受精卵的移植126（5）得到founder轉(zhuǎn)基因小鼠

（6）對founder轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定、篩選、雜交獲得純合轉(zhuǎn)基因小鼠（5）得到founder轉(zhuǎn)基因小鼠

（6）對f127（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒法（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒法128關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的病毒類的總稱。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的作用下可以將本身的單鏈RNA作為模板進行復(fù)制和遺傳信息的傳遞。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的129原理1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度整合的特性。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒能作為目的基因載體，通過感染早期胚胎細胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生嵌合體動物，再經(jīng)過雜交、篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。原理1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度130關(guān)鍵步驟（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

①提取病毒DNA②將DNA克隆載體中③酶切病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)④將外源目的基因克隆到載體⑤轉(zhuǎn)染細胞，測定外源基因的表達。

關(guān)鍵步驟（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

131（2）包裝細胞

決定著重組病毒效價及其宿主范圍。常用φ-2細胞株（3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎載體轉(zhuǎn)染包裝細胞后與8細胞胚胎共培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)染（4）胚胎移植（5）建系（2）包裝細胞

132（三）胚胎干細胞介導(dǎo)法（ES細胞法）（三）胚胎干細胞介導(dǎo)法133關(guān)于ES細胞1、胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）人或動物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干細胞，稱胚胎干細胞。2、它與早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織。關(guān)于ES細胞1、胚胎干細胞（embryonicstemc134原理

將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，便可獲得由胚胎干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動物。原理將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入胚泡期的宿主135關(guān)鍵步驟①ES細胞的分離培養(yǎng)②ES細胞基因操作

電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等方法

③獲取囊胚期胚胎④顯微操作ES細胞注射到囊胚期胚胎內(nèi)

⑤胚胎移植關(guān)鍵步驟①ES細胞的分離培養(yǎng)136三種轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較三種轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較137優(yōu)點：

1、整合率相對較高2、可導(dǎo)入基因片斷較長3、外源基因整合于所有的組織細胞中的概率高缺點：

1、整合率隨機2、有些動物原核看不清，需經(jīng)特殊處理才能有效導(dǎo)入3、需較精密儀器，費用昂貴顯微注射法優(yōu)點：顯微注射法138優(yōu)點：1、胚胎存活率高2、病毒DNA隨機單拷貝整合3、宿主范圍廣

缺點：

1、整合率不高，整合位點是隨機的2、后代多為嵌合體動物3、外源基因易發(fā)生重排或丟失4、病毒載體容量不大5、病毒DNA序列可能會干擾外源基因的表達

逆轉(zhuǎn)錄病毒法

優(yōu)點：逆轉(zhuǎn)錄病毒法139優(yōu)點：

1、整合率可控2、可用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，其細胞的鑒定和篩選比較方便3、ES細胞注入囊胚及囊胚移植到子宮，操作比較簡便

缺點：

1、ES細胞系培養(yǎng)、保存和維持不易2、后代多為嵌合體3、所需時間較長

ES細胞法

優(yōu)點：ES細胞法140五、轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)外源目的基因的制備外源目的基因的有效導(dǎo)入受精卵（胚胎）培養(yǎng)與移植外源目的基因表達的檢測等五、轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)外源目的基因的制備141六、應(yīng)用價值研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控建立人類疾病動物模型研究人類疾病基因治療

研制生物反應(yīng)器擴大移植供體來源改良動物品種

六、應(yīng)用價值研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控1421、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控Geneknockout(基因敲除)：

是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。

1、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達與調(diào)控Geneknocko1432、動物疾病模型200多種動物模型建立（病毒、遺傳、腫癌及眼疾病等）800余種人為改造小鼠產(chǎn)生其中開發(fā)最成功的是轉(zhuǎn)基因小鼠2、動物疾病模型200多種動物模型建立（病毒、遺傳、腫癌及眼144HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩

HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩1453.基因治療（genetherapy）

指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過調(diào)控目的基因表達，抑制、替代或補償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細胞、組織或器官的生理功能，達到疾病治療目的的一種方法。轉(zhuǎn)基因動物為人類疾病基因治療提供了良好的實驗依據(jù)和模型3.基因治療（genetherapy）1464、研制生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器：

將藥用蛋白或具有特殊意義的蛋白質(zhì)基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?，培育成轉(zhuǎn)基因動物，使之在動物體內(nèi)（如乳腺、血液等）高效表達，生產(chǎn)出天然活性蛋白，這種轉(zhuǎn)基因動物就稱之為動物生物反應(yīng)器

4、研制生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器：147優(yōu)勢目標產(chǎn)品產(chǎn)量高，容易收獲目標產(chǎn)品質(zhì)量好生產(chǎn)成本相對較低目標產(chǎn)品的提取相對較容易優(yōu)勢目標產(chǎn)品產(chǎn)量高，容易收獲148主要動物牛、羊、豬、雞主要靶器容乳腺、血液系統(tǒng)、膀胱及雞輸卵管系統(tǒng)主要動物牛、羊、豬、雞主要靶器容乳腺、血液系統(tǒng)、膀胱149用動物乳腺表達外源基因的主要種類產(chǎn)品類別舉例血液產(chǎn)品第8因子、第9因子、C蛋白、凝血酶III、

抗胰蛋白酶、血纖蛋白原抗體單克隆抗體藥物干擾素、人生長激素、tPA、EPO疫苗Malaria組織維生物Collagen營養(yǎng)藥乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、人源化牛奶工業(yè)蛋白質(zhì)蜘蛛網(wǎng)蛋白、貝類分泌的黏蛋白用動物乳腺表達外源基因的主要種類150我國乳腺生物反應(yīng)器研究情況

目的基因名稱產(chǎn)品的主要功能承擔單位

人血清白蛋白血液溶脹劑中國農(nóng)業(yè)大學(xué)人干擾素抗病毒因子中國農(nóng)業(yè)大學(xué)雞法氏囊病毒VP雞疫苗中國農(nóng)業(yè)大學(xué)第九因子血友病治療上海兒童醫(yī)院

EPO細胞因子上海兒童醫(yī)院人胰島素原糖尿病治療新疆牧科院

TPA治療血栓軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院人生長激素生長激素不足揚州大學(xué)我國乳腺生物反應(yīng)器研究情況151現(xiàn)狀已有約10種基因在大動物上得到高表達（1g/L以上），其中抗胰蛋白酶、凝血酶Ⅲ和葡萄糖苷酶進入臨床實驗階段。世界上只有少數(shù)幾頭轉(zhuǎn)基因牛問世，還沒有生產(chǎn)出具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因牛?，F(xiàn)狀已有約10種基因在大動物上得到高表達（1g/L以上），其152難點主要問題研制時間長、技術(shù)復(fù)雜、投資過大、風(fēng)險性高轉(zhuǎn)基因技術(shù)局限性基因調(diào)控機制難點主要問題研制時間長、技術(shù)復(fù)雜、轉(zhuǎn)基因技術(shù)局限性153攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛“滔滔”

攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因?！疤咸稀?54五、異種移植豬的器官大小、解剖生理特點與人類相似，其組織相容性抗原與人有較高的同源性?！叭P(guān)”超急性排斥延緩性排斥、慢性排斥通過轉(zhuǎn)基因來解決異種器官排斥的問題

五、異種移植豬的器官大小、解剖生理特點與人類相似，其組織相容155英國：將人的CD55、CD59轉(zhuǎn)入豬中，在仔豬血管內(nèi)皮細胞表達CD55、CD59。

將此轉(zhuǎn)基因豬的心臟移植給猴，存活了10天。同濟：將人的DFA轉(zhuǎn)入豬中，此轉(zhuǎn)基因豬的心臟在猴體內(nèi)存活了90小時英國：將人的CD55、CD59轉(zhuǎn)入豬中，在156六、品種改良

?

生長相關(guān)基因?產(chǎn)毛性能相關(guān)基因?抗病毒相關(guān)基因六、品種改良157生長激素基因轉(zhuǎn)基因豬：生長速度提高了10~15%飼料報酬和瘦肉率提高了10%主要問題：

該轉(zhuǎn)基因豬傳了7代，仍未生產(chǎn)出純合的轉(zhuǎn)基因家系。生長激素基因轉(zhuǎn)基因豬：158七、主要設(shè)備七、主要設(shè)備159顯微操作儀顯微操作儀160拉針儀煅針儀拉針儀煅針儀161電融合儀電融合儀162電極杯電極杯163細胞融合操作界面細胞融合操作界面164CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱165體視顯微鏡體視顯微鏡166評述小鼠模型成功率高現(xiàn)轉(zhuǎn)基因方法存在局限性，轉(zhuǎn)基因率低現(xiàn)有的理論和技術(shù)還不能使人們隨心所欲操

作動物基因組轉(zhuǎn)基因動物仍具有商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?jié)摿υu述小鼠模型成功率高167第二部分克隆動物第二部分