固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)

關(guān)于固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)第一頁，共八十三頁，2022年，8月28日2.酶在應(yīng)用中受到的限制因素：1.酶作為:生物催化劑的優(yōu)點(diǎn)①穩(wěn)定性差，易失活②反應(yīng)速度隨時(shí)間減慢（3分鐘內(nèi)吸光度的變化）③回收困難（淀粉酶水解廢棄淀粉）④經(jīng)濟(jì)上不合算：多不能重復(fù)使用。⑤一些酶價(jià)格昂貴（漆酶用于木板粘合）①反應(yīng)專一性強(qiáng)。②催化效率高（比一般催化劑高107-1013倍）。③反應(yīng)條件溫和（常溫常壓）。第二頁，共八十三頁，2022年，8月28日（1）人工合成酶：應(yīng)用化學(xué)合成法合成具有像酶那樣活性的催化劑。這是有機(jī)合成和聚合化學(xué)中的最新技術(shù)。但距實(shí)際應(yīng)用還有很大距離。（2）酶的人工“改性”、“修飾”：酶和細(xì)胞固定化是其中的一類。其它如基因工程、化學(xué)修飾等方法。3.克服上述限制性因素的途徑：

第三頁，共八十三頁，2022年，8月28日難得的報(bào)道：人工合成脂肪酶獲得成功

隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人類對環(huán)境逐步認(rèn)識，酶的廣泛用途越來越得到人類的重視，尤其脂肪酶，在日化洗滌劑領(lǐng)域、醫(yī)藥美容領(lǐng)域、能源領(lǐng)域生物柴油生產(chǎn)中顯得無可替代的優(yōu)勢。一般脂肪酶生產(chǎn)主要來源于發(fā)酵微生物生產(chǎn)法獲得，產(chǎn)量受到限制，成本較高，很難滿足工業(yè)需求。關(guān)于人工合成脂肪酶在中國乃至世界未曾有過相關(guān)報(bào)道。

經(jīng)過不懈努力，我公司通過人工合成的手段獲得成功，實(shí)屬國際首例。經(jīng)檢驗(yàn)它不僅具備生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、環(huán)境要求、毒化耐性各項(xiàng)指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通生物酶。生產(chǎn)成本不足普通酶的三分之一，而且不受產(chǎn)量的局限，可大規(guī)模投入生產(chǎn)。

石家莊市華北聯(lián)化科技有限公司第四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)固定化酶（ImmobilizedEnzyme）

一、發(fā)展概況

(1)1916，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶結(jié)合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人們重視。(2)1950前，研究不多，不超過10篇相關(guān)論文。有目的開展固定化研究始于50年代。1953，Grubhofer和Schloith將聚氨基聚苯乙烯樹脂重氮化后與淀粉酶、蛋白酶結(jié)合——最早固定化酶(3)60年代進(jìn)展較快：固定化酶投入工業(yè)化生產(chǎn)。(4)70年代為快速發(fā)展時(shí)期。固定化酶：連接于某種載體上或者限制在一定空間范圍內(nèi)、能連續(xù)使用的酶。第五頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、制備固定化酶的原則

1、保持酶原有專一性、高效催化能力和常溫常壓下起催化反應(yīng)的特點(diǎn)。制備盡可能在溫和條件下進(jìn)行（低溫、最適pH、水溶液中）。2、能回收、貯藏和反復(fù)使用－酶和載體結(jié)合牢固性問題。3、有一定機(jī)械強(qiáng)度，以利于機(jī)械化、自動化操作。4、酶與載體結(jié)合部位應(yīng)避開活性中心及與維持酶高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團(tuán)。且在制備過程盡可能保護(hù)這些基團(tuán)。5、最小的空間位阻：載體盡可能地不阻礙與底物的接近。6、穩(wěn)定性：載體不與底物、產(chǎn)物和反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。7、易與產(chǎn)物分離，便于回收和重復(fù)使用。8、盡量降低成本。第六頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、固定化酶的制備方法物理法:吸附法、包埋法化學(xué)法:交聯(lián)法、化學(xué)共價(jià)法

綜合法:逆膠束包囊法

（一）吸附法

采用固體吸附劑將酶吸附在它的表面使之固定的方法。第七頁，共八十三頁，2022年，8月28日（1）無機(jī)吸附載體：礦物質(zhì)和其它無機(jī)載體。

高嶺土：胰凝乳蛋白酶皂土：過氧化氫酶、核糖核酸酶氧化鋁：葡萄糖氧化酶二氧化硅（覆蓋卵磷脂/腦磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖變位酶。不銹鋼：直徑100-200粒子，以氧化鈦處理，可吸附β-半乳糖苷酶（17mg/g載體）。1、載體類型第八頁，共八十三頁，2022年，8月28日高嶺土性質(zhì)：良好粘結(jié)性粒度和細(xì)度較強(qiáng)結(jié)合能力離子吸附性及交換性

瓷土，現(xiàn)在世界上都把它叫做“高嶺土”，在很久很久以前，高嶺村有一家姓盛的窮苦夫妻，日子苦得就像黃連一樣。盛家夫妻心地卻特別善良。有一年冬天，天氣寒冷，屋檐下躺著個白發(fā)蒼蒼的老公公，盛家妻子端來了一碗熱開水，送到那老公公跟前，請他喝下暖暖身子。妻子借來米，男人生火熬粥，一會兒工夫，一大碗香噴噴，熱騰騰的米粥端到了老公公的面前。老公公見了，也不客氣，一口氣就把粥喝了下去。我沒有什么好報(bào)答你們，我走后，可到村后東南面的松山頂上一口氣挖它個九九八十一鋤，老公公早已不見蹤影。軟乎乎得就像糯米粉一樣：“松山頂上的石頭，可以拿來做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一樣的值錢哩！”將挖起的土石做成一個個碗和杯的坯子來，放進(jìn)窯里一燒，果然個個晶瑩潔白，真象玉器一樣。從此，高嶺村的窮人們在盛家夫妻的帶領(lǐng)下，改行挖土建窯燒瓷器了。松山因地處高嶺，就改名叫高嶺山，山上的瓷土，就叫做高嶺土了。第九頁，共八十三頁，2022年，8月28日9皂土：膨潤土、火山黏土。皂土是由天然膨潤土精制而成的無機(jī)礦物凝膠。膨潤土一般是指主要由蒙脫土組成的一種黏土巖。皂土的主要有效成分即為蒙脫土，含量大約90%。

蒙脫石是由兩個硅氧四面體夾一層鋁氧八面體膨潤土組成的2:1型晶體結(jié)構(gòu)，由于蒙脫石晶胞形成的層狀結(jié)構(gòu)存在某些陽離子如Cu、Mg、Na、K等,且這些陽離子與蒙脫石晶胞的作用很不牢固，易被其它陽離子交換，故具有較好的離子交換性。第十頁，共八十三頁，2022年，8月28日10（2）有機(jī)吸附載體

纖維素粉：糖苷水解酶

火棉膠：木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（70mg酶蛋白/cm2）)（3）離子交換劑作為吸附載體

CM-纖維素、DEAE（二乙胺基乙基）-纖維素、DEAE-葡聚糖。人工合成的陰離子、陽離子交換樹酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。陽離子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基團(tuán)陰離子型：季胺、仲胺、伯胺基團(tuán)。第十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日火棉膠：硝化棉溶液；硝化纖維素：用一種天然膠或合成膠增塑的樹脂與之相結(jié)合,通過溶劑蒸發(fā)而干燥后制成的材料。

對眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入人體，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。人接觸后有咽喉痛、頭痛、嗜睡、精神遲鈍、腹痛、嘔吐、皮膚及眼結(jié)膜充血、疼痛。本品極易燃。遇明火、高熱、氧化劑或胺能引起燃燒爆炸。長期貯存能自燃。CM-纖維素CM－cellulose即羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose）為陽離子交換纖維素之一。

第十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、影響因素pH：pH變化影響載體和酶蛋白的電荷，從而影響酶的吸附。一般在蛋白的等電點(diǎn)時(shí)可達(dá)最大吸附。(2)鹽：影響復(fù)雜。一般會阻止吸附。實(shí)際上已被用來洗脫從低鹽溶液吸附的酶。個別情況可促進(jìn)蛋白的吸附于原來不吸附的惰性支持物上。(3)溫度：隨溫度升高而增加吸附量。但酶失活會加速(4)載體：與載體表面積、多孔度、載體預(yù)處理有關(guān)。顆粒越小則吸附越好。多孔載體與孔的大小和表面積有關(guān)。另外載體的預(yù)處理是極為重要的：有的載體會影響酶的結(jié)合量、有的會引起酶變性、有的會降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有較高的酸性而易使酶變性，需要用緩沖液進(jìn)行予處理。

第十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、吸附法優(yōu)缺點(diǎn)(1)優(yōu)點(diǎn)①操作簡單;②可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體;③酶的純化和固定化可在吸附過程中一步完成;④酶使用過程的失活可重新活化;⑤載體可再生(2)缺點(diǎn)①pH、溫度、離子強(qiáng)度、時(shí)間等多因素對固定化酶影響復(fù)雜，不同酶、不同載體的情況各不相同。②最適酶量的選擇是經(jīng)驗(yàn)性的。③吸附程度和固定化酶的活力間不一定平行。④酶與載體結(jié)合力不強(qiáng)，易導(dǎo)致催化力喪失和污染反應(yīng)產(chǎn)物。第十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、方法舉例第十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日①酶的發(fā)酵生產(chǎn)

Aspergillusoryzae3042擴(kuò)大曲——40-50小時(shí)發(fā)酵——6倍冷蒸餾水抽提2次——壓濾——酶液（亮黃色）測活力。（25μM/小時(shí)/ml）②載體予處理：DEAE-sephadex25溶脹——0.05mol/LNaOH處理——洗滌。③固定化：酶液調(diào)節(jié)pH7.0-7.0——與載體混合（載體濕重：酶液=1g：60ml）——4-7℃冷庫攪拌吸附過夜——吸去上清液——用蒸餾水和0.15Mol/L醋酸鈉水溶液洗滌——水洗滌后4℃?zhèn)溆?。米曲霉氨基?；傅谑?，共八十三頁?022年，8月28日（二）共價(jià)結(jié)合法

在酶蛋白分子上功能團(tuán)與固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接而使酶固定的方法。固定化酶研究中最活躍的一大類方法

可供共價(jià)結(jié)合于載體的功能團(tuán)包括：氨基：N端α-氨基、賴氨酸殘基的ε-氨基羧基：C端羧基、門冬β-羧基、谷氨酸γ-COOH巰基：半胱氨酸-SH羥基：酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的-OH苯環(huán)：苯丙氨酸、酪氨酸咪唑基：組氨酸

吲哚基：色氨酸第十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日在進(jìn)行一種酶的固定時(shí)，首先要考慮酶的氨基酸組成、活性中心的氨基酸、立體結(jié)構(gòu)及專一化學(xué)修飾對酶活性和影響。實(shí)際上，共價(jià)偶聯(lián)中最普遍使用的基團(tuán)是：氨基、羧基、和苯環(huán)。

共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)注意的問題：

(1)共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)不影響酶的催化活性。(2)反應(yīng)盡可能溫和(3)最好能在水溶液中進(jìn)行(4)較高的反應(yīng)專一性：只對某一類功能基團(tuán)有很高的專一性，而對其它基團(tuán)或才水溶液幾乎無副反應(yīng)。第十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日載體選擇時(shí)的注意問題：(1)理化性質(zhì)：應(yīng)是親水性質(zhì)的，疏水載體往往對酶有變性的作用。(2)有盡能大的表面積：較細(xì)顆粒、多孔載體。(3)機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性(4)具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能團(tuán)。常用載體：

(1)天然高分子材料：纖維素、瓊脂糖、淀粉、葡聚糖凝膠、膠原及其衍生物。(2)合成高聚物：尼龍、多聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。(3)無機(jī)支持物：多孔玻璃、金屬氧化物等。

第十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日第二十頁，共八十三頁，2022年，8月28日按載體連接的基團(tuán)類型分為：(1)苯氨基載體(2)羧基載體(3)酯族氨基載體(4)硅烷化無機(jī)載體載體表面獲得反應(yīng)基的反應(yīng)類型：苯氨基：重氮法、異硫氰酸法羧基：疊氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法羧基、氨基：縮合法氨基：戊二醛活化法含羥基化合物：溴化氰法活潑鹵素、二硫化合物、醛基高聚物：直接與酶偶聯(lián)其它：硅烷化法、金屬鰲合法、四元縮合反應(yīng)第二十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、重氮法原理：帶芳氨基側(cè)鏈的聚合物用亞硝酸處理，形成重氮鹽，在中性偏堿性條件處（pH8-9），親電子的芳族重氮離子攻擊活潑的芳香環(huán)，如酪氨酸的酚基、組氨酸的咪唑基，形成相應(yīng)的偶氮衍生物。而與-NH2(N端α-氨基、賴氨酸殘基的ε-氨基)的反應(yīng)，須在過量重氮鹽存在下形成雙偶氮化合物。第二十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日pH8-9芳族重氮基具有疏水性，趨向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中區(qū)域。第二十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日重氮法常用的載體有：

帶苯氨基的珠狀聚丙烯酰胺帶苯氨基的多孔玻璃間氨基苯甲氧基纖維素對氨基苯纖維素。ABSE-多糖（對氨基苯磺酰乙基)制備過程：第二十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日例：ABSE-纖維素固定化胰蛋白酶

（1）堿性纖維素制備：24g干甘蔗芒桿纖維素，加48ml12%NaOH溶液，0℃攪拌1h，15倍水稀釋后過濾。（2）活化劑配制：對β-硫酸酯乙砜基苯胺24g，加60ml蒸餾水，40℃攪拌，加1mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5（約48ml），離心去沉淀，得到對β-硫酸酯乙砜基苯胺溶液。（3）ABSE纖維素制備：加堿性纖維素、活化劑溶液于反應(yīng)器，熱水浴保持溫度達(dá)60℃，立即用0.5MNaOH調(diào)節(jié)至pH13,溫度升至80℃,維持pH13保溫45min。以2L0.05MNaOH洗滌3次,再以水洗滌3次。得ABSE-纖維素（約75g）第二十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日（4）偶聯(lián)酶：A.配制酶液:20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05MCaCl2-0.03ml正丁胺(保護(hù)劑)混合液(預(yù)先以1MHCl調(diào)至pH9.5)；B.ABSE-纖維素處理：取5gABSE-纖維素，加10ml蒸餾水，冰水浴，邊攪拌邊加1MHCl、5%NaNO2各2.5ml，搖勻，冰浴15min抽濾，取出濾餅，迅速用預(yù)冷的0.05MHCl和蒸餾水各洗滌三次。(重氮化)C.偶聯(lián)：濾餅投入胰蛋白酶液中，立即用2MTris液調(diào)pH至，攪拌1h，抽濾。D.洗滌：固定化酶以50ml3%NaCl攪拌洗滌3次，水洗滌2次后，懸浮于0.05MCaCl2溶液中，冰箱保存?zhèn)溆谩５诙?，共八十三頁?022年，8月28日2、疊氮法

將載體上羧基活化成疊氮化合物，可以與酶分子上的-NH2、-OH、-SH發(fā)生共價(jià)結(jié)合。這是最早、也是經(jīng)常使用的一種共價(jià)結(jié)合的方法。該類方法所使用的載體有：CM-纖維素、CM-Sephadex、聚門冬氨酸、生物膠CM-100等。第二十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日反應(yīng)原理

即CM載體在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化，然后用水合肼肼解，再通過亞硝酸活化成疊氮化合物。可與酶-NH2基反應(yīng)形成肽鍵而偶聯(lián)（，高聚疊氮化合物易結(jié)合-NH2基）。第二十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、溴化氰法帶-OH基的多糖載體，通過溴化氰活化后連接酶.具有連位-OH基的高聚物（纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）都可用此法。反應(yīng)原理：

第二十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日多糖在高pH（10-11.5）用CNBr活化，在稍低pH條件下連接蛋白游離氨基。亞氨基碳酸鹽對蛋白的氨基的親核反應(yīng)十分敏感，生成N-取代異脲、N-取代亞胺碳酸酯、N-取代氨基甲酸酯的衍生物。實(shí)際連接過程很簡單，即載體先與CNBr短時(shí)間反應(yīng)，洗去未反應(yīng)CNBr，投入酶液即發(fā)生連接。該法優(yōu)點(diǎn)：1）可應(yīng)用不同的載體；2）酶連接量高；3）固定化活力高。注意問題：CNBr有毒，稱量、溶解及活化反應(yīng)均就在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。過量試劑可在pH11條件下，用過量漂白粉處理一晚后棄去。第三十頁，共八十三頁，2022年，8月28日HCl（鹽酸）

?。罕容^酸，感覺嘴里滑溜溜的，典型的嘔吐物感，微辣。

濃：極度的酸，吐掉以后回味苦，然后整個嘴里發(fā)涼，10分鐘后好轉(zhuǎn)。

H2SO4（硫酸）

?。旱乃嵛叮匚陡杏X油膩，微熱，甜，無任何不適感。

較濃的（40%左右的）：超燙，感覺喝燙稀飯了，然后微甜感和痛感并存，持續(xù)2天才退（98%的純正濃硫酸不敢喝）。

HNO3（硝酸）

?。合仁强?，然后整條舌頭麻了，然后痛，起了白斑，持續(xù)疼痛，3-4天后消退，同時(shí)嘴里感覺大吸了一口汽車尾氣。

濃：不敢喝（猜測是濃硫酸的加強(qiáng)版）。

NaOH（氫氧化鈉）

稀：基本上同濃Na2CO3（我嘗過，咸），多一些辣感（對蛋白質(zhì)腐蝕性強(qiáng)的都會有辣感）。

濃：含在嘴里十分的辣(可能是已經(jīng)反應(yīng)起來了)然后舌頭燒壞,呈黃色,肉腐爛，1個月不能說話,口里有赤痛感而且舌頭麻木有辛辣感半年后出院,說話變得不準(zhǔn),味覺幾乎消失,嘴部留下疤痕（這東西對蛋白質(zhì)的反應(yīng)不是鬧著玩的……）。

CuSO4（硫酸銅）

一開始沒味道，吐出后回味淡淡的苦澀（我的確嘗過）。

BaCl2（氯化鋇）：極苦咸，大約相當(dāng)于MgCl2的加強(qiáng)版

CCl4（四氯化碳）

這個最恐怖了，整個嘴里感到燒塑料的味道，極濃郁，吐掉以后出現(xiàn)說不出的怪異甜味，直感覺全身松軟（的確，聞起來還可以，嘗起來就郁悶了）。

Na2O2（過氧化鈉）

一般的咸（Na鹽基本都這個味道）。

無水酒精

嘴里完全沒味道，之后花露水的味道在鼻子里揮之不去。

FeCl3）（氯化鐵）

涼，然后酸，與硬幣放嘴里感覺差不多（Fe鹽都這味道）。

AgNO3（硝酸銀）

沒味道。。。

稀Br2（溴）水溶液

極其濃重味道，感覺像汽車尾氣與松節(jié)油混合的味（只能如此形容）

Hg(NO3)2（硝酸汞）

很淡的味道，有點(diǎn)像味精和醋混合了。

H2O2（雙氧水）

特辣，趕緊吐了，之后就沒什么事情了。

還有一個百度知道里面的：極其微量的氰化物是苦的，寶貴資料啊。

乙酰水楊酸我試過有點(diǎn)酸，有點(diǎn)澀，最后有點(diǎn)苦盡甘來的那種感覺。

我嘗過溴化氫，一不小心吸進(jìn)去的。味道上沒什么感覺，但是非常嗆，吸進(jìn)去很少，但是咳了一整個下午，一直到吃晚飯都反胃，印象深刻啊第三十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、硅烷化法

無機(jī)載體機(jī)械強(qiáng)度好、耐受有機(jī)溶劑的作用和微生物侵蝕能力強(qiáng)，可以再生，在廣泛范圍的pH、壓力、溫度下載體不改變結(jié)構(gòu)，同時(shí)來源豐富、價(jià)格低廉。

無機(jī)載體支持物表面采用硅烷化反應(yīng)引入功能團(tuán)，進(jìn)一步可通過不同的化學(xué)反應(yīng)制成帶有苯氨基、醛基等基團(tuán)成為活性載體。然后連接酶蛋白。

載體：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化鋁、磁性氧化鐵等第三十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日12第三十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日3第三十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日與支持物表面硅烷醇或O-離子連接，相鄰硅烷間還可以發(fā)生聚合。其產(chǎn)物烷胺基玻璃是帶有有機(jī)功能團(tuán)（氨基）的無機(jī)載體。進(jìn)一步可通過不同的化學(xué)反應(yīng)制成帶有苯氨基、醛基等基團(tuán)，成為活性載體。例如，乳酸脫氫酶可通過此法偶聯(lián)與多孔玻璃。上述方法制備的固定化酶，其穩(wěn)定性超過有機(jī)多聚物作為載體的固定化酶。第三十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日

利用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白分子間的交聯(lián)，酶分子與多功能試劑間形成共價(jià)鍵，得到立體交聯(lián)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。（三）交聯(lián)法

常用的交聯(lián)劑有：戊二醛雙重氮聯(lián)苯胺-2,2’-二磺酸1,5-二氟-2,4-二硝基苯已二酰亞胺二甲酯。第三十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日戊二醛可直接參與酶蛋白分子的交聯(lián)，便其作用機(jī)理不完全清楚。實(shí)驗(yàn)證明，酶蛋白分子中的賴氨酸參與了反應(yīng)?？赡苓^程如下：第三十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日多功能試劑制備固定化酶，可進(jìn)一步分為：（1）單獨(dú)與酶使用。(交聯(lián)酶法)（2）輔助蛋白、酶與之共同使用。(酶輔助蛋白交聯(lián)法)（3）酶吸附載體后再進(jìn)行交聯(lián)。(吸附交聯(lián))（4）先與載體反應(yīng)，形成多功能基團(tuán)載體，然后再連接酶。(載體交聯(lián)法)直接交聯(lián)酶法雖然操作簡便，但固定化顆粒太細(xì)，活力往往不高。第三十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日（四）包埋法將酶包裹于凝膠格子、或聚合物半透膜微膠囊中的方法?？煞譃槟z包埋法和微膠囊化法。1、凝膠包埋法（格子型）常用載體：海藻酸、K-角叉菜（卡拉膠）、瓊脂、三醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等。方法：混合單體、交聯(lián)劑和酶（于緩沖溶液中進(jìn)行），然后加入催化劑，系統(tǒng)開始聚合。固定化酶成型可分為凝膠后成型、邊凝聚邊成型兩種。前者是在凝膠聚合后，將其切成小塊，再經(jīng)擠壓后形成不規(guī)則顆粒。后者是在聚合過程中使之聚合成珠狀。第三十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日卡拉膠：鹿角菜膠、角叉菜膠。是從某些紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，化學(xué)結(jié)構(gòu)是由半乳糖及脫水半乳糖所組成的多糖類硫酸酯的鈣、鉀、鈉、銨鹽。由于硫酸酯結(jié)合形態(tài)的不同，可分K型、I型、L型。在果凍，軟糖，冰激凌等食品工業(yè)應(yīng)用廣泛。海藻酸：來自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的多糖?？梢种拼笫竽c道對鍶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等細(xì)菌亦產(chǎn)生藻酸類型的多糖。海藻酸為淡黃色粉末；無臭；幾乎無味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氫氧化堿溶液中溶解。有助懸、增稠、乳化、粘合等作用?？捎脼槲⒛夷也?，或作為包衣及成膜的材料。第四十頁，共八十三頁，2022年，8月28日以聚丙烯酰胺凝膠為例加以介紹：（1）單體：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸（2）雙功能交聯(lián)劑：N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)（3）催化系統(tǒng)：堿催化系統(tǒng)：TEMED（四甲基乙二胺）和過硫酸胺系統(tǒng)；β-二甲基丙腈和過硫酸鉀系統(tǒng)。光催化：核黃素過硫酸胺系統(tǒng)

γ輻射、冰凍無氧輻射等。（4）珠狀聚合包埋過程：酶、保護(hù)劑、單體、交聯(lián)劑、聚合催化劑混合后，立即在疏水相（一種乳化劑，與水有同樣密度）的有機(jī)溶劑中分散成珠狀凝膠。第四十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日舉例：制備珠狀聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶①酶液：酵母半乳糖苷酶100mg，溶于56ml磷酸緩沖液（0.05M,pH7.3）。其中含15-30%的單體、Bis5%。②催化劑：含TEMED0.6ml、200mg過硫酸銨的緩沖液4ml。③疏水相：1ml山梨聚糖倍半油酸與400ml甲苯-氯仿（290：110）混合.④反應(yīng)與成型：②與①混合后迅速加到疏水相，攪拌分散。反應(yīng)器為1L圓底燒瓶，一漿狀攪拌器，240rpm，反應(yīng)器中保持氮?dú)猓ūＷo(hù)物料不受氧化，保持產(chǎn)品質(zhì)量，還能保證安全）。4℃聚合反應(yīng)30min⑤過濾、洗滌：砂芯漏斗過濾；用500ml緩沖液洗滌，再在0.1MNH4HCO3中攪拌洗滌60min。過濾第四十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、微膠囊化法酶溶液被包裹在膜內(nèi)，膜既能使酶存在于類似于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，又阻止了酶的脫落或直接與外環(huán)境接觸。又分為界面沉淀法和界面聚合法。（1）界面沉淀法

某些高聚物在在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成皮膜（沉淀析出），從而將酶包裹的方法。酶溶液在與水互不相溶的有機(jī)相中乳化，使用油溶性表面活性劑，可形成油包水的微滴。再將溶于有機(jī)溶劑的高聚物加入攪拌著的乳化液中，然后加入一種不能溶解高聚物的有機(jī)溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形成膜，最后轉(zhuǎn)移入水相，制成固定化酶——即所謂“人工細(xì)胞”。第四十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日微囊直徑與乳化的程度有關(guān)，乳化分散的好壞又與攪拌的速度有關(guān)。制作膜材料的高聚物：

硝酸纖維素

聚苯乙烯

聚甲酯丙烯酸甲酯等優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，不引起酶的失活。缺點(diǎn)：除去膜上有機(jī)溶劑比較麻煩。第四十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日舉例：界面沉淀法制備“人工細(xì)胞”材料：10%血紅蛋白溶液(WhatmanNo42濾紙過濾)

酶液：懸浮于10%血紅蛋白溶液

有機(jī)相：100ml水飽和的乙醚加1mlSpan85（水-油乳化劑），用前配制。

硝酸纖維素溶液：4%硝酸纖維素的乙醇-乙醚（1：3）溶液，蒸發(fā)至原先重量的20%，然后加乙醚至原體積，重新溶解。

苯甲酸正丁酯-Span85溶液：1mlSpan85加于100ml苯甲酸正丁酯（用前配制）。

Tween20：50%和1%的水溶液（去乳化和洗滌）。磁力攪拌器、磁力攪棒、燒杯第四十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日方法：①血紅蛋白-酶液乳化：25ml酶液加等體積有機(jī)溶液，立即2600rpm磁力攪拌5秒鐘。②加成膜材料，乳化：25ml硝酸纖維素溶液，繼續(xù)磁力攪拌60秒。③微囊沉降：4℃放置45min。若全部沉降，去上清（約4ml），否則離心（350g，5min）去上清。④成膜：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯-Span85溶液30ml，1200rpm攪拌30秒。4℃放置30min。微囊沉降完全，否則離心（350g，5min），去上清。⑤微囊轉(zhuǎn)移至水相：加25ml50%Tween20，2900rpm攪拌分散30秒，減至1200rpm，同時(shí)加入25ml水，再攪拌30秒，用200ml水稀釋。離心（350g，5min），去上清。⑥洗滌：1%Tween20反復(fù)洗滌，直到不再含有血紅蛋白和苯甲酸正丁酯氣味。最后懸浮于0.9%NaCl溶液中第四十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日(2)界面聚合法：化學(xué)制微囊的方法。在油-水界面發(fā)生聚合反應(yīng)而成膜。成膜材料：尼龍610、聚酰胺、聚脲等。主要過程:(以尼龍膜制備為例)酶液與聚合單體混合：酶溶于10%血紅蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。乳化：分散相為含1%Span85的氯仿-環(huán)已烷。聚合：加溶于有機(jī)相的癸二酰氯。去乳化、洗滌：Tween去乳化和洗滌，轉(zhuǎn)移至水相。第四十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日表1固定化化酶制備方法及特性比較特性制備方法離子交換吸附物理吸附共價(jià)結(jié)合交聯(lián)法包埋法制備難易易易難難難（中）酶活力高低高中高底物特異性不變不變易變易變不變酶與載體結(jié)合能力中弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)再生性可能可能不可不可不可使用普遍性高低中中高成本低低高中中第四十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日四、固定化載體材料新進(jìn)展（1）傳統(tǒng)載體材料的改性

利用有機(jī)聚合物對傳統(tǒng)無機(jī)載體材料改性修飾：右旋糖苷對硅膠表面改性修飾可改善其表面的生物親和性，用于固定β-葡萄糖苷酶時(shí)可大大提高了酶的負(fù)載量。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法，在Si(111)表面進(jìn)行甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的接枝聚合則在硅表面形成刷狀P(GMA)，并可調(diào)節(jié)P(GMA)側(cè)鏈的長度第五十頁，共八十三頁，2022年，8月28日50上述復(fù)合載體的傳質(zhì)性能良好，側(cè)鏈富含能與酶共價(jià)連接的環(huán)氧基，故提高了固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的載酶量，達(dá)到0.2mg/cm2第五十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日51無機(jī)多孔材料硅藻土在低壓下強(qiáng)化吸附殼聚糖，經(jīng)戊二醛活化后共價(jià)固定化青霉素?；笗r(shí)，明顯提高了酶的儲存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。多孔且富含氨基的殼聚糖覆蓋在SiO2表面上并采用多種方式活化氨基時(shí)，共價(jià)偶聯(lián)胰蛋白酶的效果良好。第五十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日52有機(jī)高分子載體改性甲基丙烯酸甲酯(MMA)接枝聚合到尼龍膜上，或先把苯乙烯接枝聚合到尼龍膜上再將MMA接枝聚合到聚苯乙烯包覆層上，在膜表面引入了大量的反應(yīng)性酯基，再借助己二胺和戊二醛活化并共價(jià)固定化β-半乳糖苷酶，膜上的載酶量達(dá)到0.5mg/cm2。一種聚合物對另一種聚合物的表面改性修飾：Ye等先合成聚丙烯腈-順丁烯二酸超濾中空纖維膜，用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將低分子量的殼聚糖縮合覆蓋到膜表面，形成雙層仿生膜并用戊二醛將脂肪酶偶聯(lián)到殼聚糖上，從而有效地降低了膜骨架對酶促反應(yīng)的干擾，提高了酶對酸堿和熱的耐受性。第五十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日53第五十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日542、新型載體材料磁性載體：磁性載體具有特殊的磁響應(yīng)性，可以借助外部磁場從反應(yīng)體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化酶，從而可以隨時(shí)控制酶促反應(yīng)，提高酶的使用效率。納米級的鐵氧化物則是使用較為廣泛的一類磁性載體材料。磁性高分子微球可以通過共聚、表面改性等化學(xué)反應(yīng)在微球表面引入多種反應(yīng)性功能基，對酶進(jìn)行共價(jià)連接固定。第五十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日55第五十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日56環(huán)境敏感性載體：均相催化和異相分離特點(diǎn)的環(huán)境敏感性材料成為固定化酶的新型載體，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度或pH實(shí)現(xiàn)了這一目的。Kato等用N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酰胺(AAM)共聚合成了溫敏性凝膠載體，它具有低臨界溶解溫度(LCST)特性，即可通過升溫或降溫來調(diào)節(jié)凝膠在水中的沉淀或溶解，提高了固定化淀粉葡萄糖苷酶(AG)的催化能力。將適當(dāng)量的聚乙二醇(PEG)接枝到殼聚糖上而制得的溫敏性高分子水凝膠載體，隨著溫度的改變能在溶膠-凝膠之間轉(zhuǎn)變。先將木瓜蛋白酶與N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯(NAS)反應(yīng)，再利用自由基溶液聚合反應(yīng)，制備的固定化木瓜蛋白酶具有pH敏感相分離特性，兼有溶液酶和固相酶兩者的優(yōu)點(diǎn)第五十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日57導(dǎo)電載體：導(dǎo)電載體具有一定的電子傳導(dǎo)性，作為固定化酶的一類特殊載體，在基于酶電極的生物傳感器領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。導(dǎo)電載體材料主要包括兩類，導(dǎo)電高聚物載體和導(dǎo)電復(fù)合載體，前者一般是具有共軛結(jié)構(gòu)和導(dǎo)電能力的有機(jī)高聚物,如聚苯胺(PAn)、聚噻吩(PTh)、聚吡咯(PPy)及其衍生物等，后者則是在導(dǎo)電材料中復(fù)合一些特殊物質(zhì)而制得的導(dǎo)電復(fù)合載體。第五十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日58第五十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日59第二節(jié)固定化細(xì)胞

采用物理或化學(xué)的方法固定微生物細(xì)胞，是利用酶或酶系的一條捷徑。70年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)。沿用了固定化酶的方法，但其應(yīng)用速度超過的固定化酶。優(yōu)點(diǎn)：

（1）免去破碎細(xì)胞提取酶的復(fù)雜過程。（2）酶在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，穩(wěn)定性更高，固定后酶活損失較少。（3）可催化較復(fù)雜的反應(yīng)（復(fù)合酶系統(tǒng)）。（4）制備成本低。第六十頁，共八十三頁，2022年，8月28日缺點(diǎn)：（1）多適用于胞內(nèi)酶；（2）對底物和產(chǎn)物有一定限制：要求底物、產(chǎn)物易透過細(xì)胞膜。（3）產(chǎn)物較復(fù)雜，有副反應(yīng)，給提取增加了難度。制備方法與固定化酶相類似，但以吸附法、包埋法應(yīng)用最多。其它方法也有嘗試，如超過濾、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)法等。第六十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、包埋法載體：瓊脂、明膠、聚丙烯酰胺凝膠、卡拉膠、血纖維蛋白、環(huán)氧樹脂等。1、明膠包埋法:明膠—戊二醛包埋鏈霉菌細(xì)胞實(shí)例:葡萄異構(gòu)酶產(chǎn)生菌—玫瑰暗黃鏈霉菌固定化第六十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日（1）戊二醛處理菌體細(xì)胞：10克菌體（濕重），0.1ml25%戊二醛，混勻。（2）明膠液配制：1克明膠，加8ml 水溶解。（3）固定制膜：混合（1）和（2），鋪成2-3mm厚的膜，0-5℃凝固1h 。（4）戊二醛處理：0.25%戊二醛溶液75ml，浸泡24-48h。（5）成型：機(jī)械破碎，成10目大小，蒸餾水洗滌待用。第六十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、聚丙烯酰胺凝膠包埋法

大腸桿菌和產(chǎn)氨短桿菌已分別用于工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬氨酸、L-蘋果酸。聚丙烯酰胺凝膠包埋大腸桿菌（L-天冬氨酸酶）：（1）材料準(zhǔn)備：菌懸液：E.coliATCCII303，1kg菌體（濕重）加2L生理鹽水，冷至8℃。單體溶液：丙烯酰胺750g，N,N’甲叉雙丙烯酰胺40g，溶于2.4L水,冷至8℃。第六十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日（2）固定化ⅰ混合菌懸液與單體懸液,加入催化劑:100ml25%β-二甲基丙腈,500ml1%過硫酸鉀。ⅱ聚合：20-25℃，15-20min（聚合反應(yīng)約在5min后開始。溫度升高，當(dāng)溫度升至30℃時(shí)，迅速用冰水冷卻）。ⅲ成型：切成3-4mm顆粒，水洗。（3）活化細(xì)胞固定化細(xì)胞在含有1mMMg2+的1N反丁烯二酸銨（pH8.5）中，37℃24-48h。（天冬氨酸酶活力可提高9-10倍）。第六十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、海藻酸鹽包埋法

海藻酸為d-甘露糖醛酸和l-古羅糖醛酸通過1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的聚合物。（1）海藻酸鈉溶液配制：6g溶于96ml水（約6%濃度）。（2）混合菌體：0.3g濕菌體/ml(30%W/V)。（3）固化和成型：固化液（含Ca2+、Zn2+、Al3+等多價(jià)陽離子溶液，如0.1MCaCl2），將海藻酸鈉與菌體的混合液用針形管滴入固化液中。（4）硬化與洗滌：顆粒放置于0.1MCaCl2浸泡1小時(shí)進(jìn)一步固化。缺點(diǎn)：在高濃度的電解質(zhì)（K+、Na+等）中顆粒不穩(wěn)定。Ca2+等多價(jià)離子會在磷酸緩沖溶液沉淀，導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度降低，和重新溶解。第六十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、吸附法細(xì)胞表面帶有電荷，因此可以通過離子交換或吸附作用結(jié)合于載體。該法簡便，易于再生，但結(jié)合力弱，易脫落。工業(yè)應(yīng)用上較少。

陰離子樹脂：固定放線菌（葡萄糖異構(gòu)酶，生產(chǎn)果糖）

DEAE-纖維素：固定巨大芽孢桿菌（青霉素酰化酶，生產(chǎn)6-APA）。第六十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、其它

交聯(lián)法有少量嘗試，如含有天冬氨酸酶的大腸桿菌曾用多種雙功能試劑交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)只有戊二醛交聯(lián)能獲得有活力的制劑，但所得固定化細(xì)胞顆粒太細(xì)，機(jī)械強(qiáng)度差。

共價(jià)結(jié)合法：少數(shù)細(xì)菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亞胺脫水與CM-纖維素連接。細(xì)胞無生存能力，但仍保留組氨酸氨裂合酶的活性，故引起人們注意，有等進(jìn)一步的發(fā)展。第六十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用一、在工業(yè)方面的應(yīng)用1、氨基酸工業(yè)

（1）利用固定化?；福?xì)胞）生產(chǎn)L-氨基酸—DL氨基酸拆分第六十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日

工業(yè)上化學(xué)合成氨基酸都是無光學(xué)活性的DL型外消旋混合物。須將它進(jìn)行光學(xué)拆分以獲得L型氨基酸。外消旋氨基酸拆分方法:物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，其中以酶法最有效，能夠生產(chǎn)純度較高的L-氨基酸