Cre-loxp基因敲除參考教學課件

Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)12022/12/22Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)12022/12/181.Cre重組酶1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼由343個氨基酸組成的38kDa單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。它是一種位點特異性重組酶，能介導兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。22022/12/221.Cre重組酶1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，Cre重組酶基2.LoxP序列是由兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5'32022/12/222.LoxP序列是由兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8b3.Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組過程如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位。42022/12/223.Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組過程如果兩個Lo如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。52022/12/22如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA或染色體上，Cr4.Cre-loxP系統(tǒng)的特點loxP位點是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用；Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理條件下產(chǎn)生，進而發(fā)揮作用，這一點也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過程中最為重要的一點。Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片斷形成復合物后，可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過程，因此該系統(tǒng)不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子；62022/12/224.Cre-loxP系統(tǒng)的特點62022/12/18傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)的缺點knockout小鼠的所有細胞基因組上都存在基因的缺失／突變，往往引起嚴重的發(fā)育缺陷或胎兒死亡，不利于在發(fā)育后期階段基因功能的分析。即使發(fā)育完整的突變體小鼠，對于knockout表型的解釋常遇到兩個困難問題：一是所有體細胞基因的剔除，很難將異常的表型歸于哪一類細胞或組織；二是很難排除在成熟動物上由于發(fā)育缺陷所引起的異常表型。新霉素抗性基因(neo)和單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)為正負選擇(positiveandnegativeselection)系統(tǒng)，是篩選和富集同源重組細胞廣泛應(yīng)用的方法；該方法雖然使基因打靶技術(shù)可適用于任何外源目的基因，但也有一個嚴重的缺陷，即發(fā)生同源重組的細胞基因組中總留有外源的選擇標記(neo)基因；該基因可能影響相鄰基因的表達，不利于對突變表型的精確分析。以Cre／LoxP系統(tǒng)與基因打靶技術(shù)相結(jié)合的條件性基因敲除技術(shù)可克服上述的局限性。72022/12/22傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)的缺點knockout小鼠的所有細胞基因組5.借助Cre-loxP系統(tǒng)的條件性基因敲除一般情況下，利用Cre-loxP系統(tǒng)進行基因操作時，會采用兩種轉(zhuǎn)基因動物進行雜交，即一種帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物和一種帶loxP序列的轉(zhuǎn)基因動物進行交配，使得后代既帶Cre又帶loxP基因，然后Cre重組酶會識別loxP位點，導致基因重組。啟動子的時空特異性就決定了基因重組的時空特異性。82022/12/225.借助Cre-loxP系統(tǒng)的條件性基因敲除一般情況下，利轉(zhuǎn)基因動物依賴的Cre-loxp系統(tǒng)在應(yīng)用中遇到的問題轉(zhuǎn)基因動物的難以獲得：有很多Cre/Loxp轉(zhuǎn)基因動物沒有被制作出來，自己制作轉(zhuǎn)基因動物耗時且成本高。動物交配很耗時間：轉(zhuǎn)基因動物達到實驗室后，首先需要將轉(zhuǎn)基因動物的數(shù)量擴大，然后經(jīng)過至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2個月時間，所以至少需要半年時間才能拿到基因敲除的小鼠。區(qū)域或者組織特異性不高：因為轉(zhuǎn)基因小鼠依賴的基因敲除的特異性只能依賴于啟動子的調(diào)控，而有些啟動子并不能完全符合科研工作者對于區(qū)域或者組織特異性的要求，這樣就會使實驗結(jié)果不精確。92022/12/22轉(zhuǎn)基因動物依賴的Cre-loxp系統(tǒng)在應(yīng)用中遇到的問題轉(zhuǎn)基因6.改良的Cre-loxp系統(tǒng)：病毒依賴的基因重組通過病毒引入Cre或loxP元件，結(jié)合一種轉(zhuǎn)基因小鼠是比較常用的方式。102022/12/226.改良的Cre-loxp系統(tǒng)：病毒依賴的基因重組通過病毒引病毒依賴的Cre-loxp系統(tǒng)的優(yōu)點更強的區(qū)域特異性：由于病毒可以通過局部注射的方式保證區(qū)域特異性感染，再加上驅(qū)動Cre基因的特異性啟動子，能夠?qū)崿F(xiàn)更強的區(qū)域和細胞特異性的基因重組。更少的花費：購買轉(zhuǎn)基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉(zhuǎn)基因動物的飼養(yǎng)、基因型鑒定都需要不少的人力、物力，而病毒的制備、保存和注射所花的費用相對來說是比較少的。更短的實驗周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而轉(zhuǎn)基因小鼠的交配過程特別耗時間，因此采用注射病毒到轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的方式，可以大量縮短實驗周期。112022/12/22病毒依賴的Cre-loxp系統(tǒng)的優(yōu)點更強的區(qū)域特異性：由于病7.借助Cre-loxp系統(tǒng)的誘導性基因敲除目前應(yīng)用于時間特異性基因敲除動物模型的誘導劑大都通過與四環(huán)素操縱子（teto）的相互作用來完成誘導過程在沒有四環(huán)素類藥物誘導時，四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白（tTA）與tet操縱子（teto）結(jié)合，下游基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。有四環(huán)素時，這種結(jié)合消失，下游基因不能轉(zhuǎn)錄。而逆向四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活蛋白（rtTA）則功能相反，在有四環(huán)素時，rtTA與tet操縱子（teto）結(jié)合，下游基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。122022/12/227.借助Cre-loxp系統(tǒng)的誘導性基因敲除目前應(yīng)用于時間特圖注：四環(huán)素（Tet）作為誘導劑與逆向四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA結(jié)合，使得下游Cre基因表達，產(chǎn)生的Cre重組酶介導靶基因兩側(cè)的loxp序列發(fā)生切除效應(yīng)，從而達到時間特異性基因敲除的目的。132022/12/22圖注：四環(huán)素（Tet）作為誘導劑與逆向四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子rt謝謝

大家@YOURNAME142022/12/22謝謝

大家@YOURNAME142022/12/18Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)152022/12/22Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)12022/12/181.Cre重組酶1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼由343個氨基酸組成的38kDa單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。它是一種位點特異性重組酶，能介導兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。162022/12/221.Cre重組酶1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，Cre重組酶基2.LoxP序列是由兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5'172022/12/222.LoxP序列是由兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8b3.Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組過程如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位。182022/12/223.Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組過程如果兩個Lo如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。192022/12/22如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA或染色體上，Cr4.Cre-loxP系統(tǒng)的特點loxP位點是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用；Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理條件下產(chǎn)生，進而發(fā)揮作用，這一點也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過程中最為重要的一點。Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片斷形成復合物后，可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過程，因此該系統(tǒng)不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子；202022/12/224.Cre-loxP系統(tǒng)的特點62022/12/18傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)的缺點knockout小鼠的所有細胞基因組上都存在基因的缺失／突變，往往引起嚴重的發(fā)育缺陷或胎兒死亡，不利于在發(fā)育后期階段基因功能的分析。即使發(fā)育完整的突變體小鼠，對于knockout表型的解釋常遇到兩個困難問題：一是所有體細胞基因的剔除，很難將異常的表型歸于哪一類細胞或組織；二是很難排除在成熟動物上由于發(fā)育缺陷所引起的異常表型。新霉素抗性基因(neo)和單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)為正負選擇(positiveandnegativeselection)系統(tǒng)，是篩選和富集同源重組細胞廣泛應(yīng)用的方法；該方法雖然使基因打靶技術(shù)可適用于任何外源目的基因，但也有一個嚴重的缺陷，即發(fā)生同源重組的細胞基因組中總留有外源的選擇標記(neo)基因；該基因可能影響相鄰基因的表達，不利于對突變表型的精確分析。以Cre／LoxP系統(tǒng)與基因打靶技術(shù)相結(jié)合的條件性基因敲除技術(shù)可克服上述的局限性。212022/12/22傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)的缺點knockout小鼠的所有細胞基因組5.借助Cre-loxP系統(tǒng)的條件性基因敲除一般情況下，利用Cre-loxP系統(tǒng)進行基因操作時，會采用兩種轉(zhuǎn)基因動物進行雜交，即一種帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物和一種帶loxP序列的轉(zhuǎn)基因動物進行交配，使得后代既帶Cre又帶loxP基因，然后Cre重組酶會識別loxP位點，導致基因重組。啟動子的時空特異性就決定了基因重組的時空特異性。222022/12/225.借助Cre-loxP系統(tǒng)的條件性基因敲除一般情況下，利轉(zhuǎn)基因動物依賴的Cre-loxp系統(tǒng)在應(yīng)用中遇到的問題轉(zhuǎn)基因動物的難以獲得：有很多Cre/Loxp轉(zhuǎn)基因動物沒有被制作出來，自己制作轉(zhuǎn)基因動物耗時且成本高。動物交配很耗時間：轉(zhuǎn)基因動物達到實驗室后，首先需要將轉(zhuǎn)基因動物的數(shù)量擴大，然后經(jīng)過至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2個月時間，所以至少需要半年時間才能拿到基因敲除的小鼠。區(qū)域或者組織特異性不高：因為轉(zhuǎn)基因小鼠依賴的基因敲除的特異性只能依賴于啟動子的調(diào)控，而有些啟動子并不能完全符合科研工作者對于區(qū)域或者組織特異性的要求，這樣就會使實驗結(jié)果不精確。232022/12/22轉(zhuǎn)基因動物依賴的Cre-loxp系統(tǒng)在應(yīng)用中遇到的問題轉(zhuǎn)基因6.改良的Cre-loxp系統(tǒng)：病毒依賴的基因重組通過病毒引入Cre或loxP元件，結(jié)合一種轉(zhuǎn)基因小鼠是比較常用的方式。242022/12/226.改良的Cre-loxp系統(tǒng)：病毒依賴的基因重組通過病毒引病毒依賴的Cre-loxp系統(tǒng)的優(yōu)點更強的區(qū)域特異性：由于病毒可以通過局部注射的方式保證區(qū)域特異性感染，再加上驅(qū)動Cre基因的特異性啟動子，能夠?qū)崿F(xiàn)更強的區(qū)域和細胞特異性的基因重組。更少的花費：購買轉(zhuǎn)基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉(zhuǎn)基因動物的飼養(yǎng)、基因型鑒定都需要不少的人力、物力，而病毒的制備、保