蔗糖酶的分離提純及酶促2021完整版課件

蔗糖酶的分離提純及酶促12/22/20221蔗糖酶的分離提純及酶促12/20/20221內(nèi)容提示

本實驗含如下內(nèi)容（1、2、3是酶分離提純及比活力測定部分的內(nèi)容；4、5是酶促反應(yīng)動力學(xué)部分的內(nèi)容）：1、3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（酶活力）；2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（蛋白質(zhì)含量）；3、蔗糖酶的分離提純（細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、透析和離子交換柱層析—裝柱、上樣、洗柱、洗脫、收集酶活力峰、保存）；4、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（用雙倒數(shù)法）；5、用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響（含實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理的相關(guān)知識）。12/22/20222內(nèi)容提示

一、目的要求

1.熟悉工作曲線的制作方法及使用注意事項；2.學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；3.學(xué)習(xí)掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4.學(xué)習(xí)酶蛋白分離提純的原理；5.學(xué)習(xí)掌握細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、透析和離子交換柱層析技術(shù)；

6.學(xué)習(xí)掌握酶的比活力測定及其計算方法；7.學(xué)習(xí)掌握酶促反應(yīng)動力學(xué)中用雙倒數(shù)法測定Km的方法、選擇確定酶促反應(yīng)最適條件（溫度、pH值、離子濃度等）的方法；8.學(xué)習(xí)《正交試驗法》中最簡單的入門知識：用正交表設(shè)計試驗方案、用極差分析處理試驗數(shù)據(jù)并分析試驗結(jié)果。12/22/20223一、目的要求

二、實驗原理前言酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測定方法。酶分離提純的總目標是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進行分離;胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分離、純化、測活、保存；用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。酶促反應(yīng)的動力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）:1）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響3）pH值對酶促反應(yīng)速度的影響4）溫度對酶促反應(yīng)速度的影響5）激活劑、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響.12/22/20224二、實驗原理12/22/2022512/20/2022512/22/2022612/20/2022612/22/2022712/20/202274、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理：1）凡含有兩個及兩個以上肽鍵（—CO—NH—）的化合物（如雙縮脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在堿性溶液中（如Folin-甲試劑）都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；2）蛋白質(zhì)是由多個氨基酸通過肽鍵連接起來的，故所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)，形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；3）銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin-乙試劑）還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺（在一定范圍內(nèi)）與蛋白質(zhì)的含量成正比；在測定液體蛋白質(zhì)樣品含量的常用方法中（雙縮脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），F(xiàn)olin-酚法的靈敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比雙縮脲法高100倍），所以我們選用本方法。12/22/202284、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理：12/20/2025、有機溶劑分級沉淀的原理：有機溶劑分級是利用不同Pr在不同濃度的有機溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。其原理是：1）有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加Pr分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)的溶解度下降；2）有機溶劑與水作用，能破壞Pr的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。6、離子交換柱層析的原理：是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。在分離過程中，以離子交換作用為主導(dǎo)；在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點是：12/22/202295、有機溶劑分級沉淀的原理：12/20/202291）有開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對Pr的吸附容量大；2）纖維素上離子基團的數(shù)量不多且排列疏散，對Pr的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達到分離的目的，不致引起Pr的變性；3）用其裝好的層析柱在較廣的pH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會發(fā)生體積的改變，所以有利于Pr的層析。本實驗中使用的DEAE-c11是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團為二乙基氨乙基。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。12/22/2022101）有開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對Pr12/20/

三、實驗流程

周三晚上6：00開始周四下午1：00開始1、制備蔗糖酶粗品E1

2、制作DNS比色定糖的工作曲線（當(dāng)天畫出工作曲線）①自溶3、制作Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的工作曲線（當(dāng)天畫出工作曲線）②抽提

（過夜）12/22/202211三、實驗流程

12/20/204、乙醇分級和透析（制E2）

①離心得E1（無細胞抽提液）

取樣、測定酶E1活力及蛋白質(zhì)濃度②第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度）

③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）

④透析（過夜）

12/22/2022124、乙醇分級和透析（制E2）12/20/2022125、柱層析的準備工作①組裝層析裝置②裝柱、柱平衡（過夜）

12/22/2022135、柱層析的準備工作②裝柱、柱平衡（過夜）12/20/206、柱層析（制E3）周五下1：00開始①離心（得E2

）

取樣、

測酶E2活力及蛋白質(zhì)濃度

②上樣

③洗柱（用目測酶活力的方法檢測目的酶是否掛上）

④洗脫⑤合并酶活力峰,得E3

⑥保存成品E3測酶E3活力及蛋白質(zhì)濃度

12/22/2022146、柱層析（制E3）周五下1：00開始12/20成品E3

計算出E3濃度

周六（全天）上午8：00開始

(1).蔗糖酶米氏常數(shù)的測定

(2).用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響

12/22/20221512/20/202215四、操作步驟及注意事項

1、

DNS比色定糖法工作曲線的制作①取11支血糖管編號1—11，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標準溶液（0.2%）、蒸餾水、3，5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時放入沸水浴中準確反應(yīng)5分鐘（注意：①一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴鍋；②用秒表記時），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的A值。②以葡萄糖(mg)含量為橫坐標、A540值為縱坐標，畫出工作曲線。12/22/202216四、操作步驟及注意事項1、DNS比色定糖法工作曲線3，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號含糖量葡萄糖標準液去離子水3，5-二硝基水楊酸試劑A540（mg）（ml）（ml）（ml）1002.03

20.40.21.8330.80.41.6341.20.61.4351.60.81.2362.01.01.0372.41.20.8382.81.40.6393.21.60.43103.61.80.23114.02.003

12/22/2022173，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號

2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作

①取7支試管（干燥）按下表中順序加入各種試劑并進行反應(yīng)和測定

②以1號管為參比調(diào)零，記錄光密度值A(chǔ)650，以標準液的濃度為橫坐標，A650值為縱坐標，畫出工作曲線。

12/22/20221812/20/202218（二）、目測酶活力的方法：學(xué)習(xí)《正交試驗法》中最簡單的入門知識：用正交表設(shè)計是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。為：-1/Km。學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；通?？梢酝ㄟ^以下幾種方法求七、思考題5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（酶活力）；21.5ml，搖勻，再加入0.②用秒表記時），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的A值。該表中有3個同名數(shù)對，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)63數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算**

Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的方法1.樣品的測定：取兩支試管（平行）各加入樣品液（稀釋成一定濃度的）1ml，其他操作（反應(yīng)和比色測定）同工作曲線的制作（前頁）2.蛋白質(zhì)濃度的計算：

A650值對應(yīng)的μg數(shù)(Pr)×10-3

Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)

Pr溶液的ml數(shù)12/22/202219（二）、目測酶活力的方法：**Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含**制作工作曲線的注意事項1.分光光度計的使用：

1）測樣時,光吸收值A(chǔ)應(yīng)在0.100—0.700之間，并小于標準曲線的最大值，否則，縮小or加大樣品的稀釋倍數(shù)，重測！2）其他，見（523室）操作規(guī)程；2.比色杯的使用：1).洗凈（洗凈的標準是：透明、無痕跡、不掛水珠）后，置小燒杯內(nèi)用蒸餾水浸沒；2).用蒸餾水orbuffer校正（方法在儀器室講），然后在杯底標上記號（0、1、2、3）；3).向杯中加樣液時，按濃度從低到高的順序加，注意加樣到比色杯的2/3處；4).如樣液有外溢，先用濾紙條吸干（不許檫）；再用鏡頭紙向一個方向檫至透明；5).將裝有參比、樣品溶液的比色杯放入比色杯架上時，要擺放在一條直線上；12/22/202220**制作工作曲線的注意事項12/20/206).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置在濾紙上吸干；7).任何情況下都不許把比色杯放在儀器蓋上；8).自備廢液杯（盛廢液及廢紙塊用）；9).各臺分光光度計的比色杯是配套的，不許隨意調(diào)換使用。3.工作曲線的制作（以Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的工作曲線為例）1）反應(yīng)：①取液量準確：移液管洗凈、標號、潤洗，最好同一人取樣；②溫度準確：（恒溫水浴中放有溫度計），記時準確（用秒表）；③所用的標準液、buffer、反應(yīng)液應(yīng)是同一批配制的；

④加入Folin-乙試劑時要特別小心！因為Folin-乙試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，而反應(yīng)是在堿性溶液中進行，所以加入Folin-乙試劑后，一定要迅速搖勻（加一管搖一管）；12/22/2022216).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置2）測量：①由同一個人讀數(shù)；②制作標準曲線及測量樣品使用同一臺儀器；3）記錄：①實驗記錄本記錄要清晰（不許用紙片），實驗結(jié)束后要請教師簽字；②記錄儀器使用情況。4）制圖：①標明：曲線名稱、縱橫坐標的單位、儀器號、使用時間；②注意實驗點的分布、大?。ㄒ罁?jù)誤差）、直線的角度（最好在45度左右）；③不許延長工作曲線（比耳定律適用于稀溶液中的反應(yīng)）。附：標準液的配制：①濃度必須準確，要注意烘干、稱量、定容等操作；②分裝or取液時防止被稀釋！12/22/2022222）測量：①由同一個人讀數(shù)；12/20/2022223、蔗糖酶粗品（E1）的制備①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中、少量多次地加入50ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.5g乙酸鈉、25ml乙酸乙酯，攪勻，再于35℃恒溫水浴中攪拌30分鐘，觀察菌體自溶現(xiàn)象；②抽提：補加蒸餾水30ml，攪勻，蓋好，于35℃恒溫過夜，8000r/min離心10min，棄沉淀及脂層，得E1（無細胞提取液）；量體積V1=（）ml（取出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度）。

4、乙醇分級和透析（制E2）①測E1pH、用稀HAC調(diào)pH至4.5（注意少量、慢加、攪勻，防止調(diào)過）；②第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度）：計算出使E1的乙醇濃度達32%時，所需95%乙醇的體積X1，將E1和乙醇X1，放入冰鹽浴中預(yù)冷，在不斷攪拌下，緩慢滴加乙醇，3000r/min，離心5min，棄沉淀，留上清；

12/22/2022233、蔗糖酶粗品（E1）的制備12/20/202223③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）：同上法加入X2（為達47.5%乙醇飽和度時需要補加的95%乙醇的體積），離心3min，棄上清，沉淀立刻用10ml0.005mol/LpH6.0的磷酸buffer溶解，并裝入透析帶（截止分子量一萬的），對上述buffer透析過夜；次日，3000r/min離心3min，得E2，量體積V2=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其他酶液準備上樣。5.柱層析（制E3）①裝柱：本實驗使用的層析柱是自加工的，用泡沫海綿為篩板。裝入纖維素前，先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿,趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將纖維素用起始緩沖液調(diào)稀、攪允后加入，柱內(nèi)的纖維素應(yīng)非常均勻地分布，防止出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，床面要平整，床高距柱頂2－3cm為宜；用起始緩沖液洗柱,控制好流速（防止流干），于4℃平衡過夜。12/22/202224③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）：12/20

②上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當(dāng)頂部液面達到近于柱床表面時，開始用細長的玻管沿柱壁繞環(huán)加入酶樣E2，待樣液達2cm后再在柱中間小心加樣，注意控制流速，使流出液的流出速度為1ml/min左右。

③洗柱：樣品全部進入床面后，用5倍柱體積的起始緩沖液流過層析柱，洗出未吸附的物質(zhì)，此時應(yīng)目測酶活力，檢查流出液中是否有酶活力存在（即目的酶是否掛在纖維素上）。

④洗脫：因梯度洗脫裝置不齊，本實驗用階段洗脫進行。用含0.15mol/LNaCl的0.005mol/LpH6.0的磷酸緩沖液100ml，控制流速為1ml/min,用小試管收集，3ml/每管。

⑤收集酶活力峰：每隔一管目測酶活力，確定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得進一步提純的E3，量出E3的體積V3=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其它酶液封好、記名，于4℃保存，留反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗使用。

12/22/202225②上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當(dāng)頂部液面達

6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定

（一）、蔗糖酶活力的測定：1.蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。2．操作：取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋

過的酶液2ml，一支中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對照），另一支做測定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中預(yù)熱恒溫；分別取2ml5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準確計算時間，3分鐘后于測定管中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)3.從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。4.在葡萄糖標準曲線上找到所測定光密度值對應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計算酶活力：蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)×9×酶的稀釋倍數(shù)12/22/202226

6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定（二）、目測酶活力的方法：1.洗柱時用的目測酶活力方法：取兩支試管，各加入1ml5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始緩沖液，另一支中加1ml洗柱流出液，同時于35℃恒溫水浴中進行水解反應(yīng)3min，然后各加DNS試劑1ml，于沸水浴中反應(yīng)5min，比較兩支試管顏色的深淺；2.收集酶活力峰時用的目測酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml5%蔗糖液，于35℃水解反應(yīng)3min后，加0.2ml1mol/LNaOH終止反應(yīng)，然后加DNS試劑1ml，于沸水浴中準確反應(yīng)5min，比較各管顏色的深淺，再加密實驗點，重復(fù)測定，確定酶活力峰的位置。（三）、三種蔗糖酶（E1、、E2、E3）蛋白質(zhì)濃度的測定：用Folin-酚法測定。

12/22/202227（二）、目測酶活力的方法：12/20/202227

五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

1.洗脫曲線

蛋白酶質(zhì)活含力量管號2.原始數(shù)據(jù)

12/22/202228五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理12/20/20222

3.數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算

1）[E]=葡萄糖mg數(shù)×（4.5/0.5）×E的的稀釋倍數(shù)/2ml=（）u/ml2）總活力：[E]×V3）[Pr]：查標準曲線4）總Pr量：[Pr]×V5）比活力：[E]/[Pr]or總活力/總Pr量6）階段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力7）總收率：E3總活力/E1總活力8）提純倍數(shù)：比活力n/比活力n-1n=1，2，3

將計算出的數(shù)據(jù)添入下表中：12/22/2022293.數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算4.實驗結(jié)果表蔗糖酶酶樣品E１E２E３酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比活力提純倍數(shù)階段收率總收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg）（%）（%）樣品體積12/22/2022304.實驗結(jié)果表蔗糖酶酶樣品E１酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比

六、主要參考資料

1、李建武主編.生物化學(xué)實驗原理和方法.北京大學(xué)出版社.1994該書中的：p36-46（離子交換層析法）2、沈同王鏡巖主編.生物化學(xué)第二版上冊高等教育出版社.1993該書中的：p209、210、215、216、220中有關(guān)論述3、張樹政主編.酶制劑工業(yè)上冊.科學(xué)出版社.199812/22/202231

六、主要參考

七、思考題

1）指出有機溶劑分級沉淀法的原理及操作中的注意事項。2）

說明離子交換柱層析的原理及裝好層析柱的具體要求。3）

比較線性梯度洗脫與階段洗脫的區(qū)別。4）分別指出判斷酶損失程度和酶提純方法優(yōu)劣的標志。12/22/202232七、思考題1）其它1）這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都較多，用的時間也很長，要求同學(xué)們一定做好預(yù)習(xí)，寫好預(yù)習(xí)報告（方式不限，但一定要寫在本子上，并留出記錄實驗數(shù)據(jù)和實驗現(xiàn)象的位置），否則將嚴重影響實驗進度！2）你們年級的理論課還沒講到酶學(xué)部分，預(yù)習(xí)時可以看實驗課教材（我在編寫時已經(jīng)進行了整理和補充）,但教材中有印刷錯誤,應(yīng)以該課件為準.3）本實驗從一開始，就要縱觀全局，在各個環(huán)節(jié)都要注意防止酶失活；只要時間允許，一定要用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向；4）實驗制品E3要保留！酶促反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗用。12/22/202233其它1）這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都蔗糖酶米氏常數(shù)的測定

一、目的要求：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，學(xué)習(xí)蔗糖酶米氏常數(shù)的測定方法。二、實驗原理：米氏常數(shù)Km等于酶反應(yīng)速度達最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。對于某一種特定的酶，在特定的反應(yīng)條件下，對應(yīng)任何一種底物（如果它具有多個底物），它的米氏常數(shù)Km是一個定值。在一個反應(yīng)中，底物的濃度（S）是可以控制的，反應(yīng)的速度（V）可以測出，這樣就可根據(jù)底物的濃度和反應(yīng)的速度求出該酶在本實驗條件下的米氏常數(shù)。通?？梢酝ㄟ^以下幾種方法求出Km值：1）直接將數(shù)據(jù)代入米氏方程。2）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法（本實驗采用該法），橫軸的截距為：-1/Km。3）Hanes-Woolf作圖法，橫軸的截距為：-Km。4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作圖法，斜率為：-Km。5）Eadie-Scatchard作圖法，斜率為-1/Km。12/22/202234蔗糖酶米氏常數(shù)的測定一、目的要求：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度三、操作方法：1.取試管8支，按0、1--7編號，0為空白。2.按表1將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35℃水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。3.取約20ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。4.于各管中依次按同樣時間間隔加入已保溫過的酶液2ml，記時，立即搖勻。在35℃水浴中準確反應(yīng)3min。5.按同樣次序和時間間隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，搖勻，終止反應(yīng)。6.吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有1.5mlDNS試劑和1.5ml去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測定A540值。12/22/202235三、操作方法：12/20/202235表1Km值的測定

12/22/202236表1Km值的測定

12/20/202236四數(shù)據(jù)處理：以A值作為相對反應(yīng)速度，以1/S為橫坐標，1/A為縱坐標作圖，由圖求出Km值。五、思考題：1.

說明米氏常數(shù)的物理意義及單位？2.

用雙倒數(shù)法測定Km值時，應(yīng)注意的主要問題是什么？

12/22/202237四數(shù)據(jù)處理：12/20/202237用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響一、目的要求1.初步掌握正交實驗設(shè)計方法的使用；2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。二、實驗原理1.酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應(yīng)的速度。通常是在其他因素恒定的條件下，通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡單比較法。本實驗使用正交實驗設(shè)計法測定溫度、pH值、和離子濃度三種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實驗方法。12/22/202238用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響一、目的要求12/20

正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統(tǒng)計數(shù)學(xué)原理進行數(shù)據(jù)分析的一種科學(xué)方法，它符合“以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信息”的實驗設(shè)計原則。2.本實驗以自制的蔗糖酶（E3）為測定對象。蔗糖酶是一種水解酶，可使蔗糖水解為D-果糖和D-葡萄糖。

酶活性的測定，是利用DNS試劑與D-葡萄糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，葡萄糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，利用比色法可測得酶促反應(yīng)后生成的還原糖量。12/22/202239正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統(tǒng)計數(shù)學(xué)原理進三、操作方法

1.實驗設(shè)計：1）確定指標：即實驗的結(jié)果。本實驗的指標是酶活力。這里，用A540值表示，能落在葡萄糖工作曲線范圍內(nèi)的A540值越高，指標越好。2）制定因素水平表：考察三個因素（溫度、pH值和離子濃度），每個因素取三個水平。水平是因素變化的范圍（通常是根據(jù)專業(yè)知識確定。如無資料可借鑒，應(yīng)先加寬范圍再逐步縮小）內(nèi)要進行實驗的具體條件，如表1。

12/22/202240三、操作方法1.實驗設(shè)計：12/20/202240

表1因素水平表

12/22/202241表1因素水平表12/20/2022413）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本實驗不考察各因素間的交互作用，也沒設(shè)計混合水平，只有水平數(shù)均為3的的三個因素，故選用L9（34）表，見表2。按一般的實驗方法：①簡單比較法（最常用），因?qū)嶒烖c分配不均衡，易把好條件漏掉，又因數(shù)據(jù)無規(guī)律而對結(jié)果無法進行分析和判斷。②全面實驗法：（即對三個因素三個水平的各種搭配都考察）要進行33=27次實驗。而用正交表L9（34），只做九次實驗，就可以找到好的實驗條件。12/22/2022423）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（3而且，還可以進行如下分析：A.判斷各因素的水平范圍是否選偏；B.判斷各因素顯著性大小的順序；C.判斷實驗結(jié)果的置信度。由表2可見，正交表L9（34）有任何正交表都具有的如下特點：A.任何一列各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等，該表均為3次。12/22/202243而且，還可以進行如下分析：12/20/202243

表2正交表L9（34）

12/22/202244表2正交表L9（34）12/20/202244B.任何兩列橫行組成的數(shù)字對出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表有9個數(shù)字對，即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3）都出現(xiàn)一次。C.任何兩列同名數(shù)對出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表中有3個同名數(shù)對，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。以上特點，保證了用正交表安排的實驗計劃是均衡搭配的，因此可以進行綜合比較和方差分析。4）安排實驗：將本實驗的三個因素分別放在L9（34）表的第1、2、3列中，再將各列的水平數(shù)用該因素相應(yīng)的水平寫出來，即得到實驗安排表，見表4的上半部分。12/22/202245B.任何兩列橫行組成的數(shù)字對出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表有2.具體操作步驟：

1）將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于9支試管中按表3進一步稀釋至一定濃度。表3三種不同pHbuffer的稀釋表12/22/2022462.具體操作步驟：1）將已配制好的三種不同pH的0.22）另取18支試管，編號1—9及1`--9`（平行組），按表4中2、3列的要求，分別加入上述不同pH不同濃度的緩沖液2ml及蔗糖酶液（濃度15U/ml左右）1ml，混勻。3）按表4中第一列的要求，將1—9及1`--9`試管分別放入相應(yīng)溫度的恒溫水浴中保溫10min。4）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分別置于20℃、35℃、50℃水浴中保溫5min。5）向1—9及1`--9`試管中，依次間隔1min（或2min）加入相同溫度下保溫過的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即記時，搖勻，放回原來溫度的水浴中，準確反應(yīng)3min。6）按上述次序和時間間隔，加入1mol/LNaOH液0.5ml，搖勻。7）空白管：另取一支“0”號試管，加入15U/ml酶液1ml，1mol/LNaOH液0.5ml，搖勻，再加入0.2mol/L蔗糖液1ml及去離子水2ml。8）分別于各管中吸取反應(yīng)物0.5ml，加入對應(yīng)編號的盛有3mlDNS試劑的血糖管中，放入沸水浴中加熱（要用銅水浴鍋，一定保持沸騰），準確反應(yīng)5min，急速水冷后，稀釋至25ml，搖勻。以空白管為參比，測出A540值。12/22/2022472）另取18支試管，編號1—9及1`--9`（平行組四.數(shù)據(jù)處理

表4實驗安排、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理表

12/22/202248四.數(shù)據(jù)處理12/20/202248

1）數(shù)據(jù)記錄：將上述兩組平行實驗的結(jié)果取平均值后的9個數(shù)據(jù)，填入表4中的Yi項內(nèi)。

2）數(shù)據(jù)整理及分析：對于一般的實驗，可用極差分析，該分析方法簡單、直觀。對要求精細的實驗，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計，但有一定的計算量。對于有混合水平的正交實驗，只能用方差分析。本實驗，因課時有限，只使用極差分析：A.按表8-4上計算出各水平實驗結(jié)果總和，即第1、2、3列上的K1、K2、K3并求出k1、k2、k3和k的R值（極差）。B.選出優(yōu)水平組合：據(jù)R值的大小，排出因素顯著性的順序，比較k值選出優(yōu)水平組合（即好的實驗條件）。**在綜合比較，設(shè)計較好方案時，顯著因素一定要取最優(yōu)水平，非顯著因素水平的選取，可根據(jù)實際情況作具體分析后選定。12/22/2022491）數(shù)據(jù)記錄：將上述兩組平行實驗的結(jié)果取平均值后的9

3）結(jié)果及討論：

A.根據(jù)上述的計算結(jié)果，畫出各因素的趨勢圖以判斷各因素的水平范圍是否選偏；B.對從9次實驗結(jié)果中選出的較好實驗條件、根據(jù)計算比較選出的優(yōu)水平組合和綜合比較后設(shè)計的較好方案，進行驗證實驗。由上述數(shù)據(jù)分析及驗證實驗，討論在本實驗條件下，溫度、pH值和緩沖液濃度對蔗糖酶活性的影響；求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。12/22/202250

3）結(jié)果及討論：

A.根據(jù)上述的計算結(jié)果，畫出各因五、注意事項

1.本實驗中未考察到的其它因素（如：移液管、操作人員、反應(yīng)時間、測試儀器等）一定要嚴格控制，保持固定不變。2.重復(fù)實驗時，注意條件的嚴格一致性。3.在實驗過程中，必須認真對待每一個測定的點，任何一個數(shù)據(jù)的丟失，都將直接影響整個實驗數(shù)據(jù)的分析。12/22/202251五、注意事項1.本實驗中未考察到的其它因素（如：移六、思考題

1.正交試驗設(shè)計法與簡單比較法及全面試驗法相比較，有何優(yōu)缺點？2.試用正交試驗設(shè)計法設(shè)計一實驗方案？3.設(shè)計實驗方案時應(yīng)遵循什么原則？12/22/202252六、思考題1.正交試驗設(shè)計法與簡單比較法及全面試七、參考書

郭純孝主編，《計算化學(xué)》（21世紀化學(xué)叢書），化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2004年4月,p315-383.

欲學(xué)習(xí)正交試驗法者,請參考本書(p315-383)第11章正交試驗法（由郭慧云編寫）.12/22/202253七、參考書郭純孝主編，《計算化學(xué)》（21世紀說明

1、本課件是根據(jù)實驗中心對酶學(xué)實驗課的安排為剛上大二還沒學(xué)習(xí)到酶學(xué)理論知識的同學(xué)們制作的。2、其中的部分內(nèi)容（注意事項）并非是酶學(xué)實驗中的內(nèi)容，而是根據(jù)我們學(xué)院歷屆學(xué)生實驗課中存在的突出問題插入的。3、因本人的水平有限，課件還待進一步改進。12/22/202254說明1、本課件是根據(jù)蔗糖酶的分離提純及酶促2021完整版課件蔗糖酶的分離提純及酶促12/22/202256蔗糖酶的分離提純及酶促12/20/20221內(nèi)容提示

本實驗含如下內(nèi)容（1、2、3是酶分離提純及比活力測定部分的內(nèi)容；4、5是酶促反應(yīng)動力學(xué)部分的內(nèi)容）：1、3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（酶活力）；2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（蛋白質(zhì)含量）；3、蔗糖酶的分離提純（細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、透析和離子交換柱層析—裝柱、上樣、洗柱、洗脫、收集酶活力峰、保存）；4、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（用雙倒數(shù)法）；5、用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響（含實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理的相關(guān)知識）。12/22/202257內(nèi)容提示

一、目的要求

1.熟悉工作曲線的制作方法及使用注意事項；2.學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；3.學(xué)習(xí)掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4.學(xué)習(xí)酶蛋白分離提純的原理；5.學(xué)習(xí)掌握細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、透析和離子交換柱層析技術(shù)；

6.學(xué)習(xí)掌握酶的比活力測定及其計算方法；7.學(xué)習(xí)掌握酶促反應(yīng)動力學(xué)中用雙倒數(shù)法測定Km的方法、選擇確定酶促反應(yīng)最適條件（溫度、pH值、離子濃度等）的方法；8.學(xué)習(xí)《正交試驗法》中最簡單的入門知識：用正交表設(shè)計試驗方案、用極差分析處理試驗數(shù)據(jù)并分析試驗結(jié)果。12/22/202258一、目的要求

二、實驗原理前言酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測定方法。酶分離提純的總目標是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進行分離;胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分離、純化、測活、保存；用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。酶促反應(yīng)的動力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）:1）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響3）pH值對酶促反應(yīng)速度的影響4）溫度對酶促反應(yīng)速度的影響5）激活劑、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響.12/22/202259二、實驗原理12/22/20226012/20/2022512/22/20226112/20/2022612/22/20226212/20/202274、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理：1）凡含有兩個及兩個以上肽鍵（—CO—NH—）的化合物（如雙縮脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在堿性溶液中（如Folin-甲試劑）都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；2）蛋白質(zhì)是由多個氨基酸通過肽鍵連接起來的，故所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)，形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；3）銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin-乙試劑）還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺（在一定范圍內(nèi)）與蛋白質(zhì)的含量成正比；在測定液體蛋白質(zhì)樣品含量的常用方法中（雙縮脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），F(xiàn)olin-酚法的靈敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比雙縮脲法高100倍），所以我們選用本方法。12/22/2022634、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理：12/20/2025、有機溶劑分級沉淀的原理：有機溶劑分級是利用不同Pr在不同濃度的有機溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。其原理是：1）有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加Pr分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)的溶解度下降；2）有機溶劑與水作用，能破壞Pr的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。6、離子交換柱層析的原理：是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。在分離過程中，以離子交換作用為主導(dǎo)；在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點是：12/22/2022645、有機溶劑分級沉淀的原理：12/20/202291）有開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對Pr的吸附容量大；2）纖維素上離子基團的數(shù)量不多且排列疏散，對Pr的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達到分離的目的，不致引起Pr的變性；3）用其裝好的層析柱在較廣的pH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會發(fā)生體積的改變，所以有利于Pr的層析。本實驗中使用的DEAE-c11是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團為二乙基氨乙基。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。12/22/2022651）有開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對Pr12/20/

三、實驗流程

周三晚上6：00開始周四下午1：00開始1、制備蔗糖酶粗品E1

2、制作DNS比色定糖的工作曲線（當(dāng)天畫出工作曲線）①自溶3、制作Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的工作曲線（當(dāng)天畫出工作曲線）②抽提

（過夜）12/22/202266三、實驗流程

12/20/204、乙醇分級和透析（制E2）

①離心得E1（無細胞抽提液）

取樣、測定酶E1活力及蛋白質(zhì)濃度②第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度）

③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）

④透析（過夜）

12/22/2022674、乙醇分級和透析（制E2）12/20/2022125、柱層析的準備工作①組裝層析裝置②裝柱、柱平衡（過夜）

12/22/2022685、柱層析的準備工作②裝柱、柱平衡（過夜）12/20/206、柱層析（制E3）周五下1：00開始①離心（得E2

）

取樣、

測酶E2活力及蛋白質(zhì)濃度

②上樣

③洗柱（用目測酶活力的方法檢測目的酶是否掛上）

④洗脫⑤合并酶活力峰,得E3

⑥保存成品E3測酶E3活力及蛋白質(zhì)濃度

12/22/2022696、柱層析（制E3）周五下1：00開始12/20成品E3

計算出E3濃度

周六（全天）上午8：00開始

(1).蔗糖酶米氏常數(shù)的測定

(2).用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響

12/22/20227012/20/202215四、操作步驟及注意事項

1、

DNS比色定糖法工作曲線的制作①取11支血糖管編號1—11，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標準溶液（0.2%）、蒸餾水、3，5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時放入沸水浴中準確反應(yīng)5分鐘（注意：①一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴鍋；②用秒表記時），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的A值。②以葡萄糖(mg)含量為橫坐標、A540值為縱坐標，畫出工作曲線。12/22/202271四、操作步驟及注意事項1、DNS比色定糖法工作曲線3，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號含糖量葡萄糖標準液去離子水3，5-二硝基水楊酸試劑A540（mg）（ml）（ml）（ml）1002.03

20.40.21.8330.80.41.6341.20.61.4351.60.81.2362.01.01.0372.41.20.8382.81.40.6393.21.60.43103.61.80.23114.02.003

12/22/2022723，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號

2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作

①取7支試管（干燥）按下表中順序加入各種試劑并進行反應(yīng)和測定

②以1號管為參比調(diào)零，記錄光密度值A(chǔ)650，以標準液的濃度為橫坐標，A650值為縱坐標，畫出工作曲線。

12/22/20227312/20/202218（二）、目測酶活力的方法：學(xué)習(xí)《正交試驗法》中最簡單的入門知識：用正交表設(shè)計是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。為：-1/Km。學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；通?？梢酝ㄟ^以下幾種方法求七、思考題5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測定（酶活力）；21.5ml，搖勻，再加入0.②用秒表記時），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的A值。該表中有3個同名數(shù)對，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)63數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算**

Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的方法1.樣品的測定：取兩支試管（平行）各加入樣品液（稀釋成一定濃度的）1ml，其他操作（反應(yīng)和比色測定）同工作曲線的制作（前頁）2.蛋白質(zhì)濃度的計算：

A650值對應(yīng)的μg數(shù)(Pr)×10-3

Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)

Pr溶液的ml數(shù)12/22/202274（二）、目測酶活力的方法：**Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含**制作工作曲線的注意事項1.分光光度計的使用：

1）測樣時,光吸收值A(chǔ)應(yīng)在0.100—0.700之間，并小于標準曲線的最大值，否則，縮小or加大樣品的稀釋倍數(shù)，重測！2）其他，見（523室）操作規(guī)程；2.比色杯的使用：1).洗凈（洗凈的標準是：透明、無痕跡、不掛水珠）后，置小燒杯內(nèi)用蒸餾水浸沒；2).用蒸餾水orbuffer校正（方法在儀器室講），然后在杯底標上記號（0、1、2、3）；3).向杯中加樣液時，按濃度從低到高的順序加，注意加樣到比色杯的2/3處；4).如樣液有外溢，先用濾紙條吸干（不許檫）；再用鏡頭紙向一個方向檫至透明；5).將裝有參比、樣品溶液的比色杯放入比色杯架上時，要擺放在一條直線上；12/22/202275**制作工作曲線的注意事項12/20/206).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置在濾紙上吸干；7).任何情況下都不許把比色杯放在儀器蓋上；8).自備廢液杯（盛廢液及廢紙塊用）；9).各臺分光光度計的比色杯是配套的，不許隨意調(diào)換使用。3.工作曲線的制作（以Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的工作曲線為例）1）反應(yīng)：①取液量準確：移液管洗凈、標號、潤洗，最好同一人取樣；②溫度準確：（恒溫水浴中放有溫度計），記時準確（用秒表）；③所用的標準液、buffer、反應(yīng)液應(yīng)是同一批配制的；

④加入Folin-乙試劑時要特別小心！因為Folin-乙試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，而反應(yīng)是在堿性溶液中進行，所以加入Folin-乙試劑后，一定要迅速搖勻（加一管搖一管）；12/22/2022766).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置2）測量：①由同一個人讀數(shù)；②制作標準曲線及測量樣品使用同一臺儀器；3）記錄：①實驗記錄本記錄要清晰（不許用紙片），實驗結(jié)束后要請教師簽字；②記錄儀器使用情況。4）制圖：①標明：曲線名稱、縱橫坐標的單位、儀器號、使用時間；②注意實驗點的分布、大?。ㄒ罁?jù)誤差）、直線的角度（最好在45度左右）；③不許延長工作曲線（比耳定律適用于稀溶液中的反應(yīng)）。附：標準液的配制：①濃度必須準確，要注意烘干、稱量、定容等操作；②分裝or取液時防止被稀釋！12/22/2022772）測量：①由同一個人讀數(shù)；12/20/2022223、蔗糖酶粗品（E1）的制備①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中、少量多次地加入50ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.5g乙酸鈉、25ml乙酸乙酯，攪勻，再于35℃恒溫水浴中攪拌30分鐘，觀察菌體自溶現(xiàn)象；②抽提：補加蒸餾水30ml，攪勻，蓋好，于35℃恒溫過夜，8000r/min離心10min，棄沉淀及脂層，得E1（無細胞提取液）；量體積V1=（）ml（取出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度）。

4、乙醇分級和透析（制E2）①測E1pH、用稀HAC調(diào)pH至4.5（注意少量、慢加、攪勻，防止調(diào)過）；②第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度）：計算出使E1的乙醇濃度達32%時，所需95%乙醇的體積X1，將E1和乙醇X1，放入冰鹽浴中預(yù)冷，在不斷攪拌下，緩慢滴加乙醇，3000r/min，離心5min，棄沉淀，留上清；

12/22/2022783、蔗糖酶粗品（E1）的制備12/20/202223③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）：同上法加入X2（為達47.5%乙醇飽和度時需要補加的95%乙醇的體積），離心3min，棄上清，沉淀立刻用10ml0.005mol/LpH6.0的磷酸buffer溶解，并裝入透析帶（截止分子量一萬的），對上述buffer透析過夜；次日，3000r/min離心3min，得E2，量體積V2=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其他酶液準備上樣。5.柱層析（制E3）①裝柱：本實驗使用的層析柱是自加工的，用泡沫海綿為篩板。裝入纖維素前，先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿,趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將纖維素用起始緩沖液調(diào)稀、攪允后加入，柱內(nèi)的纖維素應(yīng)非常均勻地分布，防止出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，床面要平整，床高距柱頂2－3cm為宜；用起始緩沖液洗柱,控制好流速（防止流干），于4℃平衡過夜。12/22/202279③第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）：12/20

②上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當(dāng)頂部液面達到近于柱床表面時，開始用細長的玻管沿柱壁繞環(huán)加入酶樣E2，待樣液達2cm后再在柱中間小心加樣，注意控制流速，使流出液的流出速度為1ml/min左右。

③洗柱：樣品全部進入床面后，用5倍柱體積的起始緩沖液流過層析柱，洗出未吸附的物質(zhì)，此時應(yīng)目測酶活力，檢查流出液中是否有酶活力存在（即目的酶是否掛在纖維素上）。

④洗脫：因梯度洗脫裝置不齊，本實驗用階段洗脫進行。用含0.15mol/LNaCl的0.005mol/LpH6.0的磷酸緩沖液100ml，控制流速為1ml/min,用小試管收集，3ml/每管。

⑤收集酶活力峰：每隔一管目測酶活力，確定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得進一步提純的E3，量出E3的體積V3=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其它酶液封好、記名，于4℃保存，留反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗使用。

12/22/202280②上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當(dāng)頂部液面達

6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定

（一）、蔗糖酶活力的測定：1.蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。2．操作：取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋

過的酶液2ml，一支中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對照），另一支做測定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中預(yù)熱恒溫；分別取2ml5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準確計算時間，3分鐘后于測定管中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)3.從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。4.在葡萄糖標準曲線上找到所測定光密度值對應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計算酶活力：蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)×9×酶的稀釋倍數(shù)12/22/202281

6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定（二）、目測酶活力的方法：1.洗柱時用的目測酶活力方法：取兩支試管，各加入1ml5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始緩沖液，另一支中加1ml洗柱流出液，同時于35℃恒溫水浴中進行水解反應(yīng)3min，然后各加DNS試劑1ml，于沸水浴中反應(yīng)5min，比較兩支試管顏色的深淺；2.收集酶活力峰時用的目測酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml5%蔗糖液，于35℃水解反應(yīng)3min后，加0.2ml1mol/LNaOH終止反應(yīng)，然后加DNS試劑1ml，于沸水浴中準確反應(yīng)5min，比較各管顏色的深淺，再加密實驗點，重復(fù)測定，確定酶活力峰的位置。（三）、三種蔗糖酶（E1、、E2、E3）蛋白質(zhì)濃度的測定：用Folin-酚法測定。

12/22/202282（二）、目測酶活力的方法：12/20/202227

五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

1.洗脫曲線

蛋白酶質(zhì)活含力量管號2.原始數(shù)據(jù)

12/22/202283五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理12/20/20222

3.數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算

1）[E]=葡萄糖mg數(shù)×（4.5/0.5）×E的的稀釋倍數(shù)/2ml=（）u/ml2）總活力：[E]×V3）[Pr]：查標準曲線4）總Pr量：[Pr]×V5）比活力：[E]/[Pr]or總活力/總Pr量6）階段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力7）總收率：E3總活力/E1總活力8）提純倍數(shù)：比活力n/比活力n-1n=1，2，3

將計算出的數(shù)據(jù)添入下表中：12/22/2022843.數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計算4.實驗結(jié)果表蔗糖酶酶樣品E１E２E３酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比活力提純倍數(shù)階段收率總收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg）（%）（%）樣品體積12/22/2022854.實驗結(jié)果表蔗糖酶酶樣品E１酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比

六、主要參考資料

1、李建武主編.生物化學(xué)實驗原理和方法.北京大學(xué)出版社.1994該書中的：p36-46（離子交換層析法）2、沈同王鏡巖主編.生物化學(xué)第二版上冊高等教育出版社.1993該書中的：p209、210、215、216、220中有關(guān)論述3、張樹政主編.酶制劑工業(yè)上冊.科學(xué)出版社.199812/22/202286

六、主要參考

七、思考題

1）指出有機溶劑分級沉淀法的原理及操作中的注意事項。2）

說明離子交換柱層析的原理及裝好層析柱的具體要求。3）

比較線性梯度洗脫與階段洗脫的區(qū)別。4）分別指出判斷酶損失程度和酶提純方法優(yōu)劣的標志。12/22/202287七、思考題1）其它1）這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都較多，用的時間也很長，要求同學(xué)們一定做好預(yù)習(xí)，寫好預(yù)習(xí)報告（方式不限，但一定要寫在本子上，并留出記錄實驗數(shù)據(jù)和實驗現(xiàn)象的位置），否則將嚴重影響實驗進度！2）你們年級的理論課還沒講到酶學(xué)部分，預(yù)習(xí)時可以看實驗課教材（我在編寫時已經(jīng)進行了整理和補充）,但教材中有印刷錯誤,應(yīng)以該課件為準.3）本實驗從一開始，就要縱觀全局，在各個環(huán)節(jié)都要注意防止酶失活；只要時間允許，一定要用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向；4）實驗制品E3要保留！酶促反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗用。12/22/202288其它1）這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都蔗糖酶米氏常數(shù)的測定

一、目的要求：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，學(xué)習(xí)蔗糖酶米氏常數(shù)的測定方法。二、實驗原理：米氏常數(shù)Km等于酶反應(yīng)速度達最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。對于某一種特定的酶，在特定的反應(yīng)條件下，對應(yīng)任何一種底物（如果它具有多個底物），它的米氏常數(shù)Km是一個定值。在一個反應(yīng)中，底物的濃度（S）是可以控制的，反應(yīng)的速度（V）可以測出，這樣就可根據(jù)底物的濃度和反應(yīng)的速度求出該酶在本實驗條件下的米氏常數(shù)。通常可以通過以下幾種方法求出Km值：1）直接將數(shù)據(jù)代入米氏方程。2）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法（本實驗采用該法），橫軸的截距為：-1/Km。3）Hanes-Woolf作圖法，橫軸的截距為：-Km。4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作圖法，斜率為：-Km。5）Eadie-Scatchard作圖法，