新型黑麥酮酸D衍生物D69抗乳腺癌活性研究

新型黑麥酮酸D衍生物D69抗乳腺癌活性研究袁潔,何振健,朱勛,吳玨珩【內(nèi)容摘要】目的研究一種來(lái)源于海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)品的新型黑麥酮酸d衍生物d69對(duì)人乳腺癌的體內(nèi)外抑制活性，并初步討論其分子機(jī)理。方法通過(guò)鏡下觀察以及mtt比色法檢測(cè)d69的細(xì)胞毒作用，構(gòu)建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型研究d69體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30的生長(zhǎng)具有顯著的抑制造用，且呈劑量依靠性加強(qiáng)。其對(duì)mda-mb-435和zr-75-30細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(ic50)分別為0.031μmol/l和0.036μmol/l，而對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制造用較低，ic50為0.686μmol/l。人乳腺癌裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證d69能顯著抑制在體腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)論d69可能是一種潛在的乳腺癌化療藥物的先導(dǎo)化合物?！颈疚年P(guān)鍵詞語(yǔ)】海洋微生物;黑麥酮酸d衍生物;抗腫瘤;人乳腺癌;人乳腺癌裸鼠移植瘤模型abstract:objectivetoinvestigatetheinvitroandinvivoanti-breastcanceractivityofd69,anovelmemberofsecalonicacidfamily,whichwasderivedfrommarinecommensalstheinhibitoryeffectsofd69ongrowthofbreastcancercelllinesandthehumanmammaryepithelialcelllineweredeterminedbymttaddition,theinvivoantineoplasticeffectofd69onbalb/c-nudemicebearinghumanbreastcancercelllinemda-mb-435wasstheic50valuesofd69onmda-mb-435andzr-75-30celllinesafter48htreatmentwere0.031μmol/land0.036μmol/l,contrast,inhibitionofthegrowthoftheimmortalizedbreastepithelialcells,hmecbyd69,withanic50of0.686μmol/l,wasfarmilderthanthatoftheinhibitiononhumanbreastcancerentwithd69markedlysuppressedthegrowthofsarcomaxenograftinsyngeneicbalb/c-nudemiceinatime-dependentmanner,andthereductionintumorgrowthratewassignificantinxenograftstreatedwith200μg/kgsionthesedatasuggestedthatd69mightbeusedasapromisingchemotherapeuticalagentfortreatmentofbreastcancerandothersolidcancers.keywords:marinemicroorganisms;secalonicaciddanalog;antitumor;humanbreastcancer;nudemicebearinghumancancercell據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(americancancersociety)的統(tǒng)計(jì)，2007年全新增癌癥病例約1200萬(wàn)，死于癌癥的人數(shù)約760萬(wàn)，也就是說(shuō),平均天天約有2萬(wàn)人死于癌癥[1]。其中乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在北美、澳大利亞、北歐和西歐等西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率非常高[2]。傳統(tǒng)的天然抗癌藥物一般來(lái)源于陸上植物以及陸棲微生物的提取，但是隨著幾十年長(zhǎng)時(shí)間的開(kāi)發(fā)，陸上被開(kāi)發(fā)出的新活性物質(zhì)的概率越來(lái)越小，難度也越來(lái)越大。于是，人們希望從海洋生物中分離得到新的活性物質(zhì)[3]。自2050年代始，隨著光譜學(xué)、高通量挑選以及構(gòu)造分析技術(shù)等的發(fā)展，已從海洋生物中分離挑選到如ecteinascidin-743、aplidine、bryostatin1、黑麥酮酸d素等多種具有構(gòu)造多樣且效果較好的抗腫瘤活性物質(zhì)[4-8]。d69是從海洋源性的一株鏈霉菌菌株的次生代謝產(chǎn)品中分離得到的一種化合物，含有環(huán)狀的五肽內(nèi)酯環(huán)和發(fā)色基團(tuán)，屬于新型的黑麥酮酸d衍生物。通過(guò)對(duì)其體內(nèi)外具有潛在的抗腫瘤活性的研究，從細(xì)胞和分子水平上初步討論d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制造用和誘導(dǎo)凋亡作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30、人永生化乳腺上皮細(xì)胞系hmec(humanmammaryepithelialcell)均為本實(shí)驗(yàn)室保存，并已在本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的其他研究項(xiàng)目中使用[9]。1.1.2化合物d69由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院林永成教授提供。其構(gòu)造運(yùn)用核磁共振(h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc)、高分辨質(zhì)譜(esi-ms)等進(jìn)行初步鑒定[10]。各種化合物由二甲基亞砜(dmso)(sigma公司)制備保存母液。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雌性balb/c裸鼠，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)自廣州藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，答應(yīng)證號(hào)：scxk(粵)2008-0020，粵監(jiān)證字：2008a004。在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部以spf條件飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物答應(yīng)證號(hào)：syxk(粵)2007-0081。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30培養(yǎng)于含5%(φ)胎牛血清、2mmol/ll-谷氨酰胺、0.1mmol/l非必須氨基酸、10mmol/lhepes、100iu/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%(φ)co2孵箱中孵育培養(yǎng);傳代時(shí)先用1×pbs清洗細(xì)胞，再用含0.02%edta的0.05%胰酶消化，以dmem完全培養(yǎng)基終止消化。人乳腺上皮細(xì)胞hmec培養(yǎng)于無(wú)血清ksfm培養(yǎng)基中，置于37℃、5%co2孵箱中孵育培養(yǎng);傳代時(shí)用上述胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。以上細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均為invitrogen/gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自hyclone公司。1.2.2四甲基偶氮唑藍(lán)(mtt)法檢測(cè)細(xì)胞增殖將mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞消化后重懸并計(jì)數(shù)，按每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞分別接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%co2孵箱中孵育培養(yǎng)。24h后去除培養(yǎng)基，更換為含濃度依次為0、0001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4μmol/ld69的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的變化。隨后每孔參加5mg/mlmtt(genview公司，用1×磷酸鹽緩沖液溶解，終質(zhì)量濃度5mg/ml，過(guò)濾除菌，分裝后-20℃避光保存)溶液20μl，37℃作用4h，離心后棄上清液，參加dmso150μl,振蕩器振蕩10min充足溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm下的吸光度a值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組平均a值-實(shí)驗(yàn)組平均a值)/對(duì)照組平均a值×100%。對(duì)照組即d69濃度為0的培養(yǎng)孔。使用半數(shù)抑制濃度(ic50)計(jì)算軟件bliss’ssoftware計(jì)算ic50，應(yīng)用spss軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。1.2.3d69抑制人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435生長(zhǎng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)每只balb/c裸鼠右側(cè)乳腺接種數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435細(xì)胞5×106(100μl)。接種腫瘤后第6天，將14只裸鼠隨機(jī)等分為2組。待瘤直徑在30~50mm后，以30μg/kg劑量的d69，每2天腹腔打針給藥1次，連續(xù)30d，觀察并記錄d69的體內(nèi)抑瘤作用。腫瘤體積計(jì)算公式：體積(mm3)=長(zhǎng)徑×短徑2×π/6。根據(jù)各組皮下移植瘤體積，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積的均數(shù)值并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。d69打針29d后，處死，迅速取下腫瘤標(biāo)本，稱重。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵照〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例〕(中國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)令第2號(hào)，1988)。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果以(±s)表示，組間比較采取單因素方差分析，p0.05為差別具有顯著性。2結(jié)果2.1d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435、zr-75-30生長(zhǎng)和形態(tài)的影響在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察d69處理后細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)d69對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435、zr-75-30的生長(zhǎng)具有顯著的抑制造用(見(jiàn)圖1、2)。隨著d69濃度的增長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞死亡現(xiàn)象越來(lái)越明顯，出現(xiàn)大面積的脫落，細(xì)胞及細(xì)胞碎片漂浮液面。這種細(xì)胞形態(tài)的改變與細(xì)胞凋亡所發(fā)生的形態(tài)改變特別的類似[11]。[psa6681;s*2〗圖1人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435經(jīng)不同濃度d69處理后的形態(tài)變化(200×,48h)figure1morphologicalchangesofhumanbreastcancercellsmda-mb-435treatedwithindicatedconcentrationsofd69(200×,48h)2.2d69對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec生長(zhǎng)和形態(tài)的影響為檢測(cè)d69對(duì)非腫瘤細(xì)胞的毒性，以人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec為模型，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察d69處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，d69對(duì)hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制造用較人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435和zr-75-30要小得多(見(jiàn)圖3)。2.3d69對(duì)mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞分別以不同濃度的d69處理48h，mtt結(jié)果顯示，d69以劑量依靠型的方式抑制人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435和zr-75-30的增殖。其中對(duì)mda-mb-435細(xì)胞的抑制率最高，其作用48h后的ic50為0.031μmol/l。其次是zr-75-30細(xì)胞，ic50為0.036μmol/l，而d69對(duì)于人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制率最低，ic50為0.686μmol/l，見(jiàn)圖4。[psa6682;s*3〗圖2人乳腺癌細(xì)胞zr-75-30經(jīng)不同濃度d69處理后的形態(tài)變化(200×,48h)figure2morphologicalchangesofhumanbreastcancercellszr-75-30treatedwithindicatedconcentrationsofd69(200×,48h)[psa6683;s*2〗圖3人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec經(jīng)d69處理后的形態(tài)變化(200×，48h)figure3morphologicalchangesofhmectreatedwithindicatedconcentrationsofd69(200×,48h)2.4裸鼠異體移植瘤模型中d69的體內(nèi)抗腫瘤作用體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，給藥組能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其腫瘤抑制率為81.11%，差別具有顯著性，對(duì)腫瘤的抑制效果更為明顯。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中，小鼠的體質(zhì)量并沒(méi)有明顯的改變。見(jiàn)圖5、表1。[psa6684;s*2〗圖4d69對(duì)mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線3討論能夠產(chǎn)生黑麥酮酸系列化合物的真菌廣泛分布于各種陸地和海洋[12-14]。到當(dāng)前為止，已經(jīng)有6種(a、b、c、d、e、f、g)不同的黑麥酮酸被發(fā)現(xiàn)。研究表示清楚，黑麥酮酸d比其他5個(gè)同系物具有更強(qiáng)的藥理活性，同時(shí)具有更小的毒性[15]。本文所牽涉的活性化合物d69是從南海海洋微生物的次生代謝產(chǎn)品中挑選得到的，具有黑麥酮酸基本骨架的一種構(gòu)造新穎的黑麥酮酸d衍生物。本文研究了黑麥酮酸d衍生物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。mtt體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，d69對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435和zr-75-30的增殖具有明顯的抑制造用，ic50分別為0.031μmol/l和0.035μmol/l;而對(duì)于人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制率最低，這說(shuō)明對(duì)于乳腺癌細(xì)胞來(lái)講，d69對(duì)于腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性較強(qiáng)，而對(duì)于非腫瘤的永生化乳腺細(xì)胞毒性較弱。為了進(jìn)一步確認(rèn)d69的抗腫瘤活性以及其對(duì)正常細(xì)胞、組織的低毒副作用，本文建立了穩(wěn)定的人mda-mb-435乳腺癌移植瘤裸鼠模型，結(jié)果表示清楚，d69對(duì)于裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)亦具有顯著抑制造用，且小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有明顯的改變。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示d69是一個(gè)非常有希望的具有抗腫瘤活性的小分子化合物，但其抗腫瘤的分子機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)分子靶點(diǎn)還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)討論。【以下為參考文獻(xiàn)】[1]garciam,jemala,wardem,etcancerfactsfigures2007[r].atlantaga:americancancersociety,2007:1-50.[2]jemala,siegelr,warde,etstatistics[j].cacancerjclin,2008,58:71-96.[3]simmonstl,andrianasoloe,mcphailk,etnaturalproductsasanticancerdrugs[j].molcancerther,2005,4(2):333-342.[4]bergmannw,feeneyrbutionstothestudyofmarinenucleosidesofsponges[j].jorgchem,1951,16(6)：981–987.[5]sigelmfood-drugsfromthesea:proceedings[m]washington:marinetechnologysociety,1969:281-294.[6]rinehartkmorcompoundsfromtunicates[j].medresrev,2000,20(1):1-27.[7]molinskitf,dalisayds,lievenssl,etal.drugdevelopmentfrommarinenaturalproducts[j].natrevdrugdiscov,2009,8(1):69-85.[8]waksmansa,woodruffhsoilasasourceofmicroorganismsantagonistictodisease-producingbacteria[j].jbact,1940,40(4):581-600.[9]lijun,zhangnu,songli-bing,etal.astrocyteelevatedgene-1isanovelprognosticmarkerforbreastcancerprogressionandoverallpatientsurvival[j].clincancerres,2008,14(11):3319-3326.[10]guozhi-yong,shaochang-lun,shezhi-gang,etal.1hand13cnmrassignmentsfortwooxaphenalenonesbacillosporincanddfromthemangroveendophyticfungussbe-14[j].magnresonchem,2007,45(5):43