專科食品分析-蛋白質(zhì)與氨基酸的測定課件

食品分析與檢驗技術(shù)蛋白質(zhì)和氨基酸的測定1概述2凱氏定氮法3蛋白質(zhì)的快速測定法4氨基酸總量的測定5氨基酸的分離與測定主要內(nèi)容①蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。②人體的酸堿平衡、水平衡的維持；③遺傳信息的傳遞；④物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。⑤人及動物只能從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物，來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)⑥食品的重要營養(yǎng)指標(biāo)。（1）蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用(2)食品中的蛋白質(zhì)含量

在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說來動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%黃魚為17.0%，帶魚為18.0%，大豆為40%，稻米為8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。

測定食品中蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。（3）蛋白質(zhì)系數(shù)

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量很大，大部分高達(dá)數(shù)萬~數(shù)百萬，分子的長軸則長數(shù)nm~100nm,它們由20種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。

（5）蛋白質(zhì)測定方法

測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率測定蛋白質(zhì)含量；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。

凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法。微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。①樣品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性，將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫2H2SO4＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3＝(NH4)2SO4②蒸餾：在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

③吸收與滴定：加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3(2)適用范圍

此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定(3)儀器①500ml凱氏燒瓶；②定氮蒸餾裝置(4)試劑①硫酸銅

；

②硫酸鉀；③

硫酸；④

40g∕L硼酸溶液；⑤混合指示劑；⑥400g∕L氫氧化鈉；⑦0.1mol∕L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(5)操作步驟①

樣品消化：準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.5～3g,或半固體樣品2～5g,或吸取溶液樣品15～25ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45°角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化（若無通風(fēng)櫥可于瓶口倒插入一口徑適宜的干燥管，用膠管與水力真空管相連接，利用水力抽除消化過程所產(chǎn)生的煙氣）。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。②蒸餾、吸收

按圖裝好蒸餾裝置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶內(nèi)預(yù)先裝有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示劑5~6滴）。凱氏燒瓶內(nèi)，加入100ml蒸餾水、玻璃珠數(shù)粒，從安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氫氧化鈉，溶液應(yīng)呈藍(lán)褐色。不要搖動，將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min，將蒸餾裝置出口離開液面繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；V1—空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；V2—試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；m—樣品質(zhì)量，g；0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；F—蛋白質(zhì)系數(shù)。(6)結(jié)果計算2.2微量凱氏定氮法(1)原理

微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測定的定型儀器——微量凱氏定氮器。①100ml凱氏燒瓶。②微量凱氏定氮器。

(2)儀器①20g/L硼酸溶液。

②400g/L氫氧化鈉。③1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液，臨用時按1：5混合。④0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液⑤其他試劑同常量法。(3)試劑

①樣品消化：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。

(4)測定方法

吸取10.00ml樣品消化稀釋液，由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再從進(jìn)樣口加入400g/L氫氧化鈉10ml使溶液呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，蓋塞，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。冷凝管下端預(yù)先插入盛有10mL4%（或2%）硼酸吸收液,蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始記時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。

③滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。(5)結(jié)果計算

式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V2—蒸餾時吸取樣品稀釋液體積，mL；C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；F—蛋白質(zhì)系數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g。2.3樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4：提高溶液的沸點(diǎn)（2）催化劑CuSO4

氧化汞和汞良好的催化劑，但劇毒；硒粉（3）氧化劑過氧化氫硫酸鉀

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點(diǎn)在340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高，其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅

CuSO4

①催化劑2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)③下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)的指示劑。

作用（1）所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。（2）消化過程應(yīng)注意轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進(jìn)消化完全。（3）若樣品含脂肪或糖較多時，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（4）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入300g/L2~3ml過氧化氫后再加熱。2.4注意事項（5）若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化時間一般約4小時左右即可，消化時間過長會引起氨的損失。一般消化至透明后，繼續(xù)消化30min即可，但當(dāng)含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸或組氨酸時，消化時間需適當(dāng)延長，因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內(nèi)不易消化完全，往往導(dǎo)致總氮量偏低。有機(jī)物如分解完全，分解液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。（7）蒸餾過程應(yīng)注意接頭處無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。

半微量凱氏定氮4氨基酸態(tài)氮的測定

蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，雖然從各種天然源中分離得到的氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，而在構(gòu)成的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠食品供給，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極其重要的生理功能，常會因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。

隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對食品加工工藝的改革，對保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。氨基酸態(tài)氮的測定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測定方法、結(jié)果計算、說明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測定方法、結(jié)果計算4.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸的總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO(2)方法特點(diǎn)及應(yīng)用

此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。普氨酸與甲作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高;溶液中若有存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果高。(3)試劑①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性紅50%乙醇溶液④0.1%mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(4)操作方法移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅置試劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。式中c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

(5)結(jié)果計算氨基酸態(tài)氮（%）4.2電位滴定法(1)原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。(2)儀器酸度計（附磁力攪攔器）磁力攪拌器酚酞乙醇指示液：1%硼砂（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）緩沖液：PH9.22稱取3.8克Na2B4O7