基因編輯技術(shù)的概念和原理

關(guān)于基因編輯技術(shù)的概念和原理第一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日什么是基因編輯技術(shù)？基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過(guò)程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達(dá)成了“編輯基因”。第二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的研究背景傳統(tǒng)的動(dòng)物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長(zhǎng)的培育過(guò)程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。

第三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的研究背景現(xiàn)代動(dòng)物分子育種中，分子標(biāo)記技術(shù)能夠定位與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，鎖定基因與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而快捷可靠地對(duì)動(dòng)物后代進(jìn)行篩選。但是，利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選，改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。所以，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質(zhì)和直接。第四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的研究背景目前，獲得突變體的常見(jiàn)方法是利用T-DNA或轉(zhuǎn)座子構(gòu)建大規(guī)模的隨機(jī)插入突變體庫(kù)，但是構(gòu)建覆蓋全基因組的飽和突變體庫(kù)需要的工作量大且耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。而通過(guò)定點(diǎn)突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。第五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的研究背景近年來(lái)，隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點(diǎn)基因敲除、敲入變得更為簡(jiǎn)單且高效。第六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時(shí)間更短，成本更低。第七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯原理現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strandbreaksDSBs)激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)兩條途徑。第八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯原理非同源末端連接（NHEJ）是一種低保真度的修復(fù)過(guò)程，斷裂的DNA修復(fù)重連的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。第九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯原理同源重組修復(fù)（HR）

是一種相對(duì)高保真度的修復(fù)過(guò)程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過(guò)同源重組過(guò)程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)產(chǎn)生DSB，在一個(gè)同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。第十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯原理第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯技術(shù)的種類(lèi)目前主要有3種基因編輯技術(shù)，分別為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技術(shù)；RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas核酸酶技術(shù)(CRISPR-CasRGNs)。第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1.ZFN基因組編輯技術(shù)ZFN技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來(lái)的。1986年Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對(duì)由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN可識(shí)別24bp的特異性序列，由此揭開(kāi)了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日Z(yǔ)FN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識(shí)別域能識(shí)別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細(xì)胞可以通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)DNA。HR修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日Z(yǔ)FN誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個(gè)方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN對(duì)細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日2.TALEN基因組編輯技術(shù)2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識(shí)別DNA序列的特性被用來(lái)取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日TALENs包含兩個(gè)TALEN蛋白,每個(gè)TALEN都是由TALEarray與FokⅠ融合而成.其中一個(gè)TALEN靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn),另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn).然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細(xì)胞啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制.針對(duì)不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同,其長(zhǎng)度范圍一般為12~20bp.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TALENs在靶向DNA時(shí),第一個(gè)堿基為T(mén)時(shí)其結(jié)合效果更佳。第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日目前，TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但仍然有些問(wèn)題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)1987年，Ishino等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日在這個(gè)系統(tǒng)中，只憑借一段RNA便能識(shí)別外來(lái)基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012年，Jinek等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功問(wèn)世。3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成.轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體,指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn),在PAM序列上游處切割DNA造成雙鏈DNA斷裂,并啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制.從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng),其CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長(zhǎng)度不同,PAM序列也可能不同。第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日三種不同技術(shù)的比較第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日續(xù)表第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯新技術(shù)的用途基因功能研究基因治療構(gòu)建模式動(dòng)物改造和培育新品種第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1.基因功能研究基因敲除是在活體動(dòng)物上驗(yàn)證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)，但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體動(dòng)物模型選育等一系列步驟，成功率受到多方面因素的限制。第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1.基因功能研究即使對(duì)于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個(gè)基因一般也需要1年以上?；蚓庉嬓录夹g(shù)則不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1.基因功能研究ZFN技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、擬南芥、玉米、煙草等模式生物或經(jīng)濟(jì)物種的細(xì)胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變，其中在果蠅、斑馬魚(yú)、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1.基因功能研究2009年，威斯康辛醫(yī)學(xué)院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家機(jī)構(gòu)使用ZFN技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔?。第二十八?yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日2.基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細(xì)胞中替代有缺陷的基因，但這種方法難以精準(zhǔn)控制，可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位，在靶位點(diǎn)進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除，達(dá)到基因治療的目的。第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日2.基因治療Bacman等人利用TALEN技術(shù)清除了來(lái)自于病人線粒體內(nèi)的有病DNA。這是TALEN首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項(xiàng)研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日2.基因治療Li等人利用ZFN技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)“剪切”和“粘貼”基因，在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血友病治療，避免了傳統(tǒng)基因療法帶來(lái)的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)，首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。第三十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日3.構(gòu)建模式動(dòng)物根據(jù)人類(lèi)疾病所構(gòu)建的動(dòng)物模型，對(duì)研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義。基因打靶技術(shù)是在ES和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，模型構(gòu)建耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且模式動(dòng)物的選擇受到ES細(xì)胞的限制。第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯新技術(shù)不受ES細(xì)胞的限制，效率高，速度快，且定點(diǎn)編輯更加精確，可在多種細(xì)胞及生物體的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割和修飾。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠第一人Jaenisch與其同事最近利用CRISPR-Cas系統(tǒng)又構(gòu)建了攜帶特異性突變的小鼠模型。3.構(gòu)建模式動(dòng)物第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日4.改造和培育新品種傳統(tǒng)的改造動(dòng)植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類(lèi)需要的品種。基因編輯技術(shù)則可以進(jìn)行定點(diǎn)修飾，達(dá)到高效定向。第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日Shukla等對(duì)玉米進(jìn)行肌醇磷酸激酶1(inositolphosphatekinase1，IPK1)基因的修飾，使其對(duì)除草劑的耐性增強(qiáng)，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達(dá)譜也發(fā)生了與預(yù)期一樣的改變。Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactatesynthase)基因SuR

(SuRA和SuRB)位點(diǎn)為靶標(biāo)，育成了對(duì)咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對(duì)磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因編輯的不足基因編輯是一項(xiàng)新技術(shù)，還存在構(gòu)建復(fù)雜和價(jià)格的問(wèn)題，其脫靶效應(yīng)限制了其在基因治療等應(yīng)用上的發(fā)展。第三十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28