2013第3章污染物生物效應(yīng)檢測(cè)

第三章污染物的生物效第一 生物測(cè)試及方第二 一般毒性試第三 生物的分子和細(xì)胞水平檢第四 生物致突變、致畸 效應(yīng)檢第五 微宇宙一、生物測(cè)試生物測(cè)試（Bioassa）指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測(cè)定一種或多種污染物或環(huán)境、者只能測(cè)定污染物的濃度。如通過(guò)水污染的生物測(cè)試可獲得以下數(shù)據(jù)：1.各種環(huán)境因素水污染的生物測(cè)試：毒性試驗(yàn)（Toxicity大氣污染的生物測(cè)試：植物人工熏氣（ArtificialFumigationfor應(yīng)應(yīng)1生物測(cè)試的分短短短期中期長(zhǎng)期根據(jù)生物測(cè)試時(shí)間 于高濃度污染物下進(jìn)行。指標(biāo)為L(zhǎng)C50,IC50,EC50。多為靜止式，中期測(cè)試：介于短期和長(zhǎng)期之間，一般8-90d算做中期。（靜止和流動(dòng)式2、受試生物的選擇——有代表性、對(duì)毒物具有敏感性、試驗(yàn)的可D 3、生物測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn) 受眾多因素影響，為便于比較和分析，故必須把測(cè)試物試驗(yàn)魚(yú)種應(yīng)是斑馬擔(dān)尼魚(yú)(真骨魚(yú)總目，鯉科）試驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)30±5mm，體重0.3±0.1g新配制的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水pH為7.8±0.2，硬度為250mg／L左右(以CaCO3蒸餾水或去離子水由下面4種溶 A毒物（Toxicant）：能引起生物體功能或器質(zhì)性損產(chǎn)生暫時(shí)或永久性的P99，以引 的劑量大小來(lái)區(qū)別“毒物”與“非毒物”，根本因素——毒劑(一)按毒物的用途及分布范圍分工業(yè)化學(xué)品：如生產(chǎn)原料、輔料、等；農(nóng)用化學(xué)品：如化肥、殺蟲(chóng)劑等醫(yī)用化學(xué)品：如藥物、消殺劑等環(huán)境污染物：如廢水、廢生物毒素：如動(dòng)物毒素、植物毒素軍事毒物：如芥子氣 毒素放射性物質(zhì)：如放射性核素、天然放射性元素(二)按化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分芳香鹵代碳?xì)浠瘜W(xué)(三)按毒性級(jí)別分可分為劇毒、高毒、低毒(四)按毒作用的生理生化機(jī)制分

氣液粉塵可分為巰基抑制劑、高鐵蛋白形成劑….(五)按毒作用主要部可分為肝毒物、腎毒物、神經(jīng)毒物…(六)按毒物生物學(xué)效可分 物、致畸物、致突變物B 毒性作用或毒效應(yīng)（ToxicEffect）：無(wú)損害作用（Non-adverseEffect）：不引起機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育 遲發(fā)性遲發(fā)性毒作用(Delayedtoxiceffect)：是指機(jī)體接觸化學(xué)物質(zhì)癥狀失或雖 癥狀但似已恢復(fù)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間間隔才表現(xiàn)出來(lái)的毒性作用如CO和有機(jī)。遠(yuǎn)期毒作用(Remotetoxiceffect)：指化學(xué)物作用于機(jī)體或停止接觸后，經(jīng)若干年，而后發(fā)生不同病理改變的毒作急性急性毒作用(Acutetoxiceffect)：指短時(shí)間內(nèi)(24h)一次或多次接觸化學(xué)物后)指化學(xué)物質(zhì)引起受試所需要的最低劑量或濃最大耐受劑量或濃度altolerancedoseMTD,LD0MTC化學(xué)物質(zhì)不引起受試對(duì)象出 的最高劑量或濃度(區(qū)分急性和慢性,指化學(xué)物質(zhì)引起受試實(shí)驗(yàn)對(duì)象中的個(gè)別成員出的最高劑量或濃半數(shù)致死劑量/濃度(medianlethaldose,指化學(xué)物質(zhì)引起一半所需要的最低劑量或濃D.效應(yīng)（effect）:是量效應(yīng)，表示接觸一定劑量的環(huán)境污染物后，引起的機(jī) 劑量-效應(yīng)關(guān)系（Dose-effectRelationship）：不同劑量 或者群體中表現(xiàn)來(lái)的量大小之間的關(guān) 劑量-反應(yīng)關(guān)系（Dose-responseRelationship):不同劑量與質(zhì)效應(yīng)發(fā)生率之間的關(guān)是評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)毒性與確定安全接觸水平的基本即隨著外源化學(xué)物的劑量增加，對(duì)機(jī)體的毒效應(yīng)的程度增加，或出現(xiàn)某種效 線、直線或S-型曲線等多種形狀。是化學(xué)物質(zhì)安全評(píng)價(jià)的基本依據(jù)率率圖3劑量－反應(yīng)曲線（S形線型

率率率位率位圖4劑量－反應(yīng)曲線 性(Risk)：也稱 性或風(fēng)險(xiǎn)度，是指在特定的接觸條件下終生接觸某境因素引 或群體產(chǎn)生有害效應(yīng)(損傷、疾病 )的預(yù)期頻率危害性(Hazard)：指定性表示外源化學(xué)物對(duì)人群健康安全性(Safety)：是指 度，可為社會(huì)接受( 度可忽略)，即籠地指在通常條件下接觸化學(xué)物 和人群健康不會(huì)引起有害作用 最小有作用劑量(Minimaleffectivedose)或稱閾劑量或閾濃度：是指在一定時(shí)間內(nèi)，一 每日容許攝入量(acceptabledailyintake,ADI)：指允許正常成人攝入體內(nèi)的特定化學(xué)物質(zhì)而 不引起任何損害作用的劑量最高容許濃度 alallowableconcentration,MAC)：某一外源化學(xué)物可以在境中存在而不致 造成任何損害作用的最高濃度 EffectZone）：是一種根據(jù)毒性和毒性作用特點(diǎn)綜合評(píng)價(jià)外 急性毒作用帶=半數(shù)致死劑量/急性毒性最小有作用劑量（急性閾值 種外來(lái)化合物引 慢性毒作用帶=急性毒性最小有作用劑量/慢性毒性最小有作用劑=急性閾值/慢性閾比值越大，表明引起慢性毒 半數(shù)效應(yīng)濃度（MedianEffectConcentration,EC50指能引起50％受試生物的某種效應(yīng)（ 效應(yīng)）變化的濃度。（效應(yīng)化半數(shù)抑制濃度（MedianInhibitionConcentrationIC50指能引起50％受試生物的某種效應(yīng)（ 效應(yīng)）抑制的濃度。（效應(yīng)制半數(shù)致死時(shí)間（MedianLethalTime,LT50指在特定溫度和劑量下，受試生 一半所需要的時(shí)間半數(shù)效應(yīng)時(shí)間（MedianEffectiveTime,ET50指在特定溫度和劑量1、毒性的計(jì)量單我國(guó)工業(yè)毒物急性毒

高毒低毒

≤

≤外來(lái)化合物急性毒性分級(jí)

對(duì)人可能致死的估計(jì) 劇毒高毒3中低毒微毒 6、膜自由基損傷：①膜脂質(zhì)過(guò)氧化損害。②蛋白質(zhì)的氧化損害。③DNA的氧化損害 8、選擇性細(xì)胞。這種毒性作用是相當(dāng)特異的。(例如，高劑量錳可引起腦部基底神經(jīng)節(jié)多巴胺能細(xì)胞損傷，產(chǎn)生的神經(jīng)癥狀幾乎與帕金森氏病難以區(qū)分。在發(fā)育的某一階段給時(shí)嬰兒缺肢畸形。)9、體細(xì)胞非致死性遺傳改變。毒物和DNA的共價(jià)結(jié)合也可以通 表達(dá)的結(jié)果，受細(xì)胞內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，如果這一調(diào)控 性主要是經(jīng)口、經(jīng)皮膚及經(jīng)呼吸道吸入三種染毒途1、經(jīng)口染②喂飼喂飼方法染毒是將化學(xué)物溶于無(wú)害的溶液中拌入飼料或飲用水中，使動(dòng)物2、經(jīng)呼吸道染3、經(jīng)皮膚染 4、其它途徑染急性毒性：是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸某一化學(xué)物所引起 ●評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)機(jī)體的急性毒性的大小、毒效應(yīng)的特征、劑量-反應(yīng)（效應(yīng)關(guān)系，并根據(jù)LD50值進(jìn)行急性●為亞慢性、慢性毒性研究及其他毒理試驗(yàn)接觸劑量的設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)的擇提供依●為毒作用機(jī)制研究提供線哺乳動(dòng)物急性毒性 2.水生生物急性毒性試性 魚(yú)類急性毒性試 水蚤類（枝角類）急性毒性試 藻類急性毒性試驗(yàn)3.蚯蚓急性毒性試1、試驗(yàn)動(dòng) 生物級(jí)別分類與選擇2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記和隨機(jī)分3、劑量選 4、動(dòng)物染5、急性毒性反應(yīng)的觀察與記

一般用灌胃法和人工熏氣受試物的配制：配制試驗(yàn)所需的最高劑濃度溶液，然后依次稀釋到所需濃度 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與半數(shù)致死劑量的計(jì)算（寇氏法、幾率單位法數(shù)(Y)、動(dòng) 百分比(P，以小數(shù)表示)以及統(tǒng)計(jì)公式中要求的其他計(jì)算數(shù)據(jù)項(xiàng)目 時(shí)間短，一般1-4天，不更換試驗(yàn)適用于：性質(zhì)穩(wěn)定、不易揮發(fā)、耗氧量少的物魚(yú)類急性毒性試試驗(yàn)魚(yú)選要求：有區(qū)域代表性，易于飼養(yǎng)，對(duì)毒物敏感 健常用的有：青、草、鰱、鳙魚(yú)， 、鯉魚(yú)、鯽劑量選擇與染毒：先做預(yù)試驗(yàn)確定LD0和LD100，在LD0和LD100之間需要按等比級(jí)數(shù)插入5-7個(gè)濃度組，染毒48-96h。另加一空魚(yú)類急性毒性判定的急性毒性反應(yīng)的觀察與記統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算【寇氏法、直線內(nèi)插法、對(duì)數(shù)-概率模式法水蚤類（枝角類）急性毒性試 50%的毒物濃度來(lái)表（1）試驗(yàn)指（2）常用的藻類生長(zhǎng)測(cè)試

葉綠素含 混合液萃取法、熱乙醇檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)土壤 對(duì)動(dòng)物的急 濾紙接觸毒性試驗(yàn)和檢測(cè)指標(biāo)試驗(yàn)周期

（一）、亞慢性毒性試1、概念 物體在約1/30～1/20生命期間少量反復(fù)接觸某種外來(lái)物質(zhì)引起的損害作用的毒2、目的●進(jìn)一步確定其毒作●研究亞慢性毒性●估計(jì)最小有作用劑量和最大無(wú)作用劑●為慢性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)及觀察指標(biāo)提供依3、受試物劑量：一般用LC50(LD50)的1/80～1/50作為亞慢性實(shí)驗(yàn)劑（二）慢性毒性試閾劑量和最大無(wú)作用劑量，為進(jìn)行該化合物的性評(píng)價(jià)與制定人接觸該化合物的安全45、劑量的選擇與分受試動(dòng)物要 以亞慢性閾劑量或其1/5~1/2劑量為慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，以這一閾劑量的以LD50的1/10劑量為慢性試驗(yàn)的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計(jì)慢性閾劑量，以LD506 7

蓄積毒性：是指低于一 產(chǎn)生原因：V進(jìn)入﹥V消謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時(shí)，化學(xué)物就有可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留的現(xiàn)象蓄積作用是發(fā)生慢 的物質(zhì)基一種外源化學(xué)物有無(wú)蓄積作用是評(píng)定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)安全系數(shù)的一種重要依物質(zhì)蓄積——實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠測(cè)得機(jī)內(nèi)存在該化學(xué)物或其功能蓄積可能由 體內(nèi)的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢出物質(zhì)的蓄積或者是由于每次機(jī)體接觸化學(xué)物之后所引起的損害累積蓄積系數(shù)法 生物半減期法 20天蓄積試驗(yàn)A積系數(shù)應(yīng)的總有效劑量LD50（n）

<1量

之比值，即使K＝

/

1 積毒性系數(shù)。當(dāng)染毒劑量累計(jì)達(dá)到相當(dāng)5倍LD50以上時(shí)，若受試動(dòng)物中出現(xiàn)某種毒性效應(yīng)或 每天0.15×LD50，第三期為每只每天0.225×LD50,依次類推……），直至該動(dòng)物 B生物半減期轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化作用過(guò)程而被消除一半所需要的時(shí)間 生物半減期T1/2=（t2－t1）log2/（logy1－logC20天蓄積試驗(yàn)組總劑量分別為1，2，4，10LD50。觀察停藥7天后 如1/20LD50組有 如1/20LD50組 ，各劑量 也劑量-反應(yīng)關(guān)系，可認(rèn)為無(wú)明顯蓄積毒性 一、加合物的測(cè)是化學(xué)物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的親電活性產(chǎn)物與DNA鏈特異位點(diǎn)上的共價(jià)結(jié)合DNA加合物出現(xiàn)在疾病發(fā)病之前,甚而出現(xiàn)在接 - 免疫法：抗原－抗體反應(yīng)。1個(gè)加合物/107－108個(gè)核苷熒光法：某些DNA-加合物具有熒光特性，故而可被檢測(cè)到。熒光法不破壞DNA鏈，并可區(qū)分加合物的不同立體異構(gòu)體及DNA鏈上的不同位點(diǎn)上的加合32P-后標(biāo)記法：目前最常用 法，靈敏度高過(guò)程：DNA－酶水解－分離（單核苷酸或加合物）－32PATP標(biāo)記加合二、蛋白加合物的測(cè)最常見(jiàn)的為Hb（血紅蛋白）-加合物因?yàn)镠b-加合物的生存期為120d左右，因而它可作為中長(zhǎng) 的指標(biāo)最常用的方法為（GC-MS法）和免疫法檢測(cè)。（原理同DNA-加合物的測(cè)定法三、一般代謝酶的活性測(cè)定（底物的消耗或產(chǎn)物的增加 2、腺三磷酶（ATPase）。鉬藍(lán)法四、解毒系統(tǒng)酶類誘

1、混合功能氧化酶活性測(cè)定（直接法和間接法2、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST,non-Se-GSH-Px）活性測(cè)定（間接法，測(cè)產(chǎn)物生成量五、抗氧化防御系統(tǒng)1、過(guò)氧化氫酶（Ct催化H2O2）：衰老的原

2、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GPx清除脂類過(guò)氧化物，有機(jī)氫過(guò)氧化物直接法：提純GPx，GPx在255nm處呈最大吸收峰。此法靈敏度 突變分堿基對(duì)的改變； 體細(xì)胞突變的不●致其他不顯性致死突顯性存活突變（顯性非致死性突變）：如抗維生素D佝僂隱性突變遺傳：如血友癌變致畸衰老癌變致畸衰老死胎 突變(gene堿基置換(base—pair指某一堿基配對(duì)性能改變或脫落所致的突轉(zhuǎn)換顛換損點(diǎn)開(kāi)始?jí)A基序列完全改變，形成錯(cuò)誤的，并轉(zhuǎn)譯成為不正3、致突變?cè)嚕ㄒ唬w 突變?cè)嚕ǘ┘?xì)胞遺傳學(xué)試畸變?cè)囼?yàn)微核試（三）體 突變?cè)囷@性致死突變?cè)嚬壈樾噪[性致死試（四）DNA損傷試 （1）鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(SaloellaTpiriumeere Asa)：利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株（突變型）測(cè)定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型（i）回變到野生型（his+）的試驗(yàn)方法突變型（營(yíng)養(yǎng)缺陷型 野生常用菌株：組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（突變型培養(yǎng)基上，多數(shù)不能存活。假致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變生型

株。(his

受試

培養(yǎng)基（不含組氨酸（2）

中國(guó)地 CHO細(xì)胞株（突變型小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞株（突變型次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤硫酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT 利用光學(xué)顯微鏡直接觀察生物體細(xì)胞在受致突變物作用 的數(shù)目和態(tài)的改變情體內(nèi)：骨髓細(xì)胞或其他組織（胸腺、脾 細(xì)胞等） 畸變微核的形成：微核的產(chǎn)生與 ，在細(xì)胞后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中， 有 毒物的作用使個(gè) 試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)細(xì)胞：常用嚙齒類動(dòng)物骨髓多染紅細(xì)胞（PCE）（三）體 突變?cè)?顯性致死突變?cè)囼?yàn)（檢測(cè)外來(lái)化合物對(duì)動(dòng)物生殖細(xì) 2果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)（致突變物可能在雄性果蠅配子 （四）DNA損傷試1姐妹染色單體交換試驗(yàn)（SisterChromatideExchangeTest 原理：5-Brdu（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷（T）的類似物，摻入DNA，經(jīng)過(guò)二 2DNA3單細(xì)胞凝膠電泳（彗星試驗(yàn)電泳檢測(cè)，根據(jù)“彗星”頭部和尾部的大小和比例確定DNA損傷程度 2、畸胎3、致畸物（原4、致畸作用（Teraogenesis）——致畸物通 一般 12 （一）基本概1、化 作用和化 2、

1775年——英國(guó) 陰囊1895年——德國(guó)Rehn職業(yè) 1915年— 1922年——英國(guó)Kennway1945年——英國(guó)Case職業(yè) 3、腫瘤抑 （tumorsuppressor又稱抗 ，或抑 （anti-oncogene）、隱性 oncogene）。在正常細(xì)胞中第四 1 的階段學(xué) 過(guò)程有多