植物細(xì)胞工程制藥

第五章植物細(xì)胞工程制藥1.在無菌和人工控制的條件下，采用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)植物的細(xì)胞，組織，器官以獲得有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。2.采用植物的遺傳操作技術(shù)改變植物或植物細(xì)胞的原有性狀和功能，獲得具有優(yōu)良性狀的植株或植物細(xì)胞，生產(chǎn)有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。第一節(jié)概述利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分植物組織及細(xì)胞培養(yǎng)過程中，所產(chǎn)生的次生代謝物常存在于細(xì)胞內(nèi)，可以收獲細(xì)胞進(jìn)行提取，因所含色素等雜質(zhì)較少，所以提取過程相對(duì)于從原植物中提取要簡(jiǎn)單一些。植物培養(yǎng)細(xì)胞中有效成分含量高于原植物中的含量培養(yǎng)周期短，有利于節(jié)約成本大規(guī)模生產(chǎn)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)相比，植物表達(dá)系統(tǒng)具有耗費(fèi)極低而生產(chǎn)蛋白復(fù)合物量大的潛力，而且植物表達(dá)系統(tǒng)不存在來自動(dòng)物、細(xì)菌或者病毒病原體的污染問題。植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的次生代謝產(chǎn)物見表5-1一、植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史1902年，德國Haberlandt提出了細(xì)胞全能性學(xué)說，并進(jìn)行了植物葉肉細(xì)胞、髓細(xì)胞、腺細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞、表皮細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn),奠定了細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。之后至30年代，建立了基本的植物組織培養(yǎng)技術(shù)50年代期間，組織培養(yǎng)進(jìn)入新的階段培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)等用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控研究80年代后，高速發(fā)展時(shí)期分子生物學(xué)技術(shù)改變植物遺傳特性植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行有藥用價(jià)值的天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)和直接生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物成為主流目前，我國處于此方面的領(lǐng)先二、植物細(xì)胞的藥用成分市售中成藥的25%來源于植物提取藥物或半合成藥物一類為植物后含物，為細(xì)胞儲(chǔ)液或廢棄物，包括生物堿、揮發(fā)油和有機(jī)酸。一類為生理活性物質(zhì)，如酶、維生素、植物激素、植物殺菌素等三、植物細(xì)胞的生物學(xué)特性細(xì)胞的全能性:

一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的固有能力。植物干細(xì)胞：植物胚性細(xì)胞（embryogeniccells）即合子。分化的根莖葉中仍保留少數(shù)未分化或分化程度不高的細(xì)胞（遺留的胚性細(xì)胞）細(xì)胞的脫分化（dedifferentiation):特定條件下，分化細(xì)胞被誘導(dǎo)，基因活動(dòng)模式發(fā)生變化，改變?cè)械陌l(fā)育途徑，失去原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫叻稚芰Φ呐咝约?xì)胞。已分化的細(xì)胞要表現(xiàn)全能性，首先要脫分化形成分生細(xì)胞，然后再分化形成胚胎發(fā)育成植株脫分化條件：創(chuàng)傷和外源激素。外植體(explant)：植物體上上取出的用用于培養(yǎng)和和分離細(xì)胞胞的組織或或器官愈傷組織：植物的傷傷口或外植植體的傷口口長(zhǎng)出的細(xì)細(xì)胞團(tuán)，既既是組織，，又是脫分分化細(xì)胞Callus毛狀根(hairyroot)：受到發(fā)根根農(nóng)桿菌感感染后形成成的根組織織，易于培培養(yǎng)，改變變了植物的的次生代謝謝。次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物：保持植物物的抗逆性性，抗病性性和抗蟲性性，及擔(dān)當(dāng)當(dāng)信號(hào)分子子。合成途途徑見表5-2毛狀根第二節(jié)植植物細(xì)胞胞的培養(yǎng)植物細(xì)胞培培養(yǎng)從植物物組織培養(yǎng)養(yǎng)而來，植植物組織培培養(yǎng)主要用用于形成組組織和再生生成植株細(xì)胞培養(yǎng)主主要生成次次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物基本技術(shù)：：植物材料的的準(zhǔn)備培養(yǎng)基制備備培養(yǎng)方法的的選擇一、植物細(xì)細(xì)胞的培養(yǎng)養(yǎng)特點(diǎn)植物培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞四個(gè)生生長(zhǎng)時(shí)期特特性延遲期：細(xì)胞數(shù)恒定定，高RNA含量，高蛋蛋白質(zhì)合成成能力；加速期：細(xì)胞快速生生長(zhǎng)期。干干重恒定，，細(xì)胞數(shù)、、DNA和蛋白質(zhì)濃濃度增加，，有絲分裂裂活性、RNA含量和蛋白白質(zhì)合成能能力減少；；對(duì)數(shù)期：介于最大生生長(zhǎng)率和蛋蛋白質(zhì)合成成完全停止止期之間。。增加細(xì)胞胞鮮重、干干重及RNA酶活性，蛋蛋白質(zhì)合成成能力完全全減退；穩(wěn)定期：細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定定。細(xì)胞高高液泡化，，極度脆弱弱，高度分分化及有機(jī)機(jī)化合物的的高濃度。。（1）植物細(xì)胞胞有獨(dú)特的的培養(yǎng)時(shí)間間及特征：：重量的增增加在對(duì)數(shù)數(shù)期，次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物在穩(wěn)定定期積累（2）植物細(xì)胞胞很少單一一細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生生長(zhǎng)后期分分泌量蛋白白和粘多糖糖，以非均相集集合的細(xì)胞胞團(tuán)懸浮生生長(zhǎng)。（3）植物細(xì)胞胞好氣，培培養(yǎng)過程中中需供供氣氣及及攪攪拌拌，但但細(xì)細(xì)胞胞壁壁脆脆弱弱，，抗抗剪剪切切能能力力小小，，傳傳統(tǒng)統(tǒng)的的攪攪拌拌式式反反應(yīng)應(yīng)器器極極易易損損傷傷細(xì)細(xì)胞胞壁壁二、、植植物物細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)基基植物物細(xì)細(xì)胞胞生生長(zhǎng)長(zhǎng)代代謝謝特特點(diǎn)點(diǎn)：：（1）需需大大量量無無機(jī)機(jī)鹽鹽（2）需需多多種種維維生生素素和和植植物物生生長(zhǎng)長(zhǎng)激激素素（3）無無機(jī)機(jī)氮氮源源，，硝硝酸酸鹽鹽，，銨銨鹽鹽為為主主。。（4）以以蔗蔗糖糖為為碳碳源源培養(yǎng)養(yǎng)基基配配方方見見表表5-3常用用培培養(yǎng)養(yǎng)基基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米米勒勒、、改改良良懷懷特特、、尼尼許許等等。。MS培養(yǎng)養(yǎng)基基是目目前前應(yīng)應(yīng)用用最最多多最最普普遍遍的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基。。無機(jī)機(jī)鹽鹽的的濃濃度度較較高高，能保保證組組織培培養(yǎng)生生長(zhǎng)所所需的的礦物物營養(yǎng)養(yǎng)。并并且因因?yàn)殡x離子濃濃度高高，在在配制制、貯貯存、、消毒毒過程程中，，即使使有些些成分分略有有出入入，也也不致致影響響培養(yǎng)養(yǎng)基中中的離離子平平衡。B5含有較較低的的鹽離子，這個(gè)成成分可可能對(duì)對(duì)很多多培養(yǎng)養(yǎng)物的的生長(zhǎng)長(zhǎng)有抑抑制作作用。White的無機(jī)機(jī)鹽含含量較較低，適于生根培培養(yǎng)。KM-8p主要用用于原原生質(zhì)質(zhì)體培培養(yǎng)，其特點(diǎn)點(diǎn)是有有機(jī)成成分較較復(fù)雜雜，它包括括了幾幾乎所所有的的單糖糖和維維生素素、呼呼吸代代謝中中的主主要有有機(jī)酸酸。凡是花藥培培養(yǎng)中常用用的培養(yǎng)基基，其成分較簡(jiǎn)簡(jiǎn)單，且KN03和(NH)2N04含高。（一）無機(jī)機(jī)鹽大量元素：：氮、磷、鉀鉀、鈣、鎂鎂、硫等微量元素：：硼、錳、鋅鋅、鉬、銅銅、鈷、氯氯等（二）生長(zhǎng)長(zhǎng)因素植物生長(zhǎng)調(diào)調(diào)節(jié)劑植物生長(zhǎng)激激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素素，赤霉素，脫脫落酸，乙烯。借生長(zhǎng)激素素調(diào)控生長(zhǎng)長(zhǎng)分化，以以及細(xì)胞培培養(yǎng)時(shí)，獲獲得最大量量的次生代代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)素（用來誘導(dǎo)導(dǎo)細(xì)胞的分分裂、愈傷傷組織形成成和根的分分化）：組組織培養(yǎng)中中常用的有有：吲哚乙酸(IAA)：第一個(gè)被被發(fā)現(xiàn)和人人工合成的的的激素二氯本氧乙乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸酸(NOA)；對(duì)氯苯氧氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根根，2,4-D有利于愈傷傷組織的誘誘導(dǎo)和生長(zhǎng)長(zhǎng)細(xì)胞分裂素素主要促進(jìn)細(xì)細(xì)胞分裂和和由愈傷組組織上或器器官上分化化不定芽。。常用的有有：6-芐基嘌呤(BAP)6-芐基腺嘌呤呤(6-BA)激動(dòng)素（呋呋喃氨基嘌嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)異戊烯氨基基嘌呤(2-ip)植物培養(yǎng)物物的生長(zhǎng)取取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例：高濃度生長(zhǎng)長(zhǎng)素和低濃濃度分裂素素——刺激細(xì)胞分裂低濃度生長(zhǎng)長(zhǎng)素和高濃濃度分裂素素——刺激細(xì)胞生長(zhǎng)（三）誘導(dǎo)導(dǎo)子(elicitor)：刺激植物細(xì)細(xì)胞合成防御性次生生代謝產(chǎn)物物的物質(zhì),可以通過改改變次生代代謝途徑中中催化酶的的酶活力,引起代謝通通量和反應(yīng)應(yīng)速率的改改變,提高次生代代謝產(chǎn)物的的產(chǎn)量。非生物誘導(dǎo)導(dǎo)子：水楊酸，茉茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類生物誘導(dǎo)子：微生物類，，如真菌孢子子，菌絲體真菌培養(yǎng)物濾濾液等（四）碳源細(xì)胞培養(yǎng)過程程中不進(jìn)行光光合作用，需需提供糖做碳碳源。（五）維生生素：煙酸，，B1，B6（六）有機(jī)物物：甘氨酸或或水解絡(luò)蛋白白，酵母提取取液液等。三、植物細(xì)胞胞生物反應(yīng)器器植物細(xì)胞易聚聚集化，比較較脆弱，代謝謝途徑和代謝謝產(chǎn)物累積與與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)關(guān)系的復(fù)雜性性，，選擇合合適的培養(yǎng)方方法和反應(yīng)器器影像產(chǎn)物產(chǎn)產(chǎn)量細(xì)胞培養(yǎng)周期期長(zhǎng)，次生代代謝產(chǎn)物含量量相對(duì)較低，，提取困難，，生物反應(yīng)器器技術(shù)還有待待深入各種生物反應(yīng)應(yīng)器性能比較較不同類型的生生物反應(yīng)器各各有其優(yōu)缺點(diǎn)點(diǎn)，而改進(jìn)的的攪拌式生物物反應(yīng)器和氣氣升式反應(yīng)器器可能更適合合植物細(xì)胞的的培養(yǎng)。一般來說，懸懸浮培養(yǎng)的細(xì)細(xì)胞在干重不不大于20g/L時(shí)，以氣升式式反應(yīng)器為宜宜，而當(dāng)干重重超過20g/L時(shí)，則改進(jìn)的的攪拌式生物物反應(yīng)器優(yōu)于于其它類型的的反應(yīng)器我國發(fā)明的“氣升內(nèi)錯(cuò)流”式植物細(xì)胞培培養(yǎng)反應(yīng)器，，能夠適應(yīng)植植物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)周期長(zhǎng)，培培養(yǎng)液隨培養(yǎng)養(yǎng)進(jìn)程而蒸發(fā)發(fā)減少的生物物反應(yīng)過程；；可抑制氣泡泡的聚合，減減弱氣泡在液液面破裂時(shí)產(chǎn)產(chǎn)生的沖擊力力對(duì)細(xì)胞的損損傷；可提高高降液區(qū)氣含含率，消除降降液區(qū)缺氧現(xiàn)現(xiàn)象，并強(qiáng)化化混合與氧傳傳遞，大大降降低反應(yīng)器高高度。使用這種反應(yīng)應(yīng)器培養(yǎng)新疆疆紫草細(xì)胞，，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)時(shí)細(xì)胞量達(dá)到到12gdw／L，紫草寧含量量達(dá)到了細(xì)胞胞干重的10％，是天然植植株含量的2～8倍四、植物細(xì)胞胞的獲得和擴(kuò)擴(kuò)大培養(yǎng)（一）植物細(xì)細(xì)胞的獲得1.外植體直接分分離法:機(jī)械切割、組組織破碎直接接從植物外植植體中分離2.愈傷組織分離離法：從愈傷組組織制備小細(xì)細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)細(xì)胞懸液3.原生質(zhì)體再生生法：纖維素和果膠膠酶混合處理外植植體或愈傷組組織，分離原原生質(zhì)體，再再生培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，原生生質(zhì)體細(xì)胞壁壁再生獲得植植物細(xì)胞（二）植物細(xì)細(xì)胞的培養(yǎng)方方法1.單細(xì)胞的培養(yǎng)養(yǎng)（1）看護(hù)培養(yǎng)法（nurseculture）：在單細(xì)胞的的生長(zhǎng)環(huán)境里里加入愈傷組組織同時(shí)培養(yǎng)養(yǎng)。愈傷組織織提供促細(xì)胞胞分裂的物質(zhì)質(zhì)等，傳遞生生物信息，使使持續(xù)分裂增增值等。即愈傷組織看看護(hù)單細(xì)胞（2）微室培養(yǎng)法：?jiǎn)渭?xì)胞接種種到小室里，，密封培養(yǎng)，，觀測(cè)單細(xì)胞胞的生長(zhǎng)發(fā)育育情況（3）平板培養(yǎng)法：?jiǎn)渭?xì)胞接種種于固體培養(yǎng)養(yǎng)基上，獲得得單細(xì)胞形成成的細(xì)胞系（4）條件培養(yǎng)法：接種于條件件培養(yǎng)基上形形成的細(xì)胞系系。條件培養(yǎng)養(yǎng)基指培養(yǎng)過過細(xì)胞的培養(yǎng)養(yǎng)基上清，有有植物生長(zhǎng)激激素等殘留，，用于制備成成固體培養(yǎng)基基。2.單倍體細(xì)胞的的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)））：指將植物物單倍體細(xì)胞胞培養(yǎng)成單倍倍體植株或純純和二倍體植植株一般采取花藥藥作為單倍體體細(xì)胞的培養(yǎng)養(yǎng)對(duì)象用花粉在固體體培養(yǎng)基上培培養(yǎng)3.愈傷組織培養(yǎng)養(yǎng)愈傷組織既是是組織又是細(xì)細(xì)胞，為脫分分化細(xì)胞，具具再分化的能能力，可用于于次生代謝物物的生產(chǎn)，也也可再生為植植株。4.毛狀根誘導(dǎo)和和培養(yǎng)一些次生代謝謝產(chǎn)物只有在在根里生長(zhǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌感感染雙子夜植植物，RI質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生生毛狀根。形態(tài)方面：Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)快速速生長(zhǎng)的、非非定向性、高高分支的毛狀狀根的形成代謝方面：Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根能能合成與原植植物相同或相相似的次生代代謝物，并且且發(fā)根合成次次生代謝物具具有遺傳穩(wěn)定定性。毛狀根生長(zhǎng)快快速和次級(jí)代代謝產(chǎn)物含量量高，特別適適用于從木本本植物和難于于培養(yǎng)的植物物中得到較高高含量的次級(jí)級(jí)代謝產(chǎn)物。。毛狀根根具有有如下下特點(diǎn)點(diǎn)：激素自自養(yǎng)，不必必加外外源激激素；；次級(jí)代代謝產(chǎn)產(chǎn)物含含量高且穩(wěn)定；增殖速速度快。用發(fā)根農(nóng)農(nóng)桿菌菌經(jīng)直接注注射法法，外外植體體接種種感染染，原原生質(zhì)質(zhì)體共共培養(yǎng)養(yǎng)法誘誘導(dǎo)毛毛狀根根發(fā)根農(nóng)農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化化后，，經(jīng)篩篩選鑒鑒定低鹽濃濃度下下生長(zhǎng)長(zhǎng)，培培養(yǎng)植物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)工工業(yè)化化存在在的問問題生長(zhǎng)緩緩慢,通常完完成一一次生生產(chǎn)周周期需需4-5周次級(jí)代代謝物物含量量低培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞不不穩(wěn)定定等多數(shù)產(chǎn)產(chǎn)物積積累于于胞內(nèi)內(nèi)不耐受受剪切切力一般的的說，，只有有當(dāng)次次級(jí)代代謝產(chǎn)產(chǎn)物的的價(jià)格格高于于1000美元/kg時(shí)，才才考慮慮采用用植物物細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)方法法。第三節(jié)節(jié)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因植植物一、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植物物的產(chǎn)產(chǎn)生和和發(fā)展展（一））轉(zhuǎn)基基因植植物的的基本本概念念轉(zhuǎn)基因因植物物：遺傳修修飾體體(geneticallymodifiedorganisms,GMOs)近年發(fā)發(fā)展迅迅速應(yīng)用廣廣泛世界第第一例例轉(zhuǎn)基基因植植物-煙草1983年在美美國問問世。。1986年,首批轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植物物-抗蟲和和抗除除草劑劑棉花花進(jìn)入入田間間試驗(yàn)驗(yàn)。1992年中國國成為為世界界上第第一個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)基基因植植物商商品化化種植植的國國家，，開創(chuàng)創(chuàng)了轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植物物商品品化應(yīng)應(yīng)用的的先河河；當(dāng)當(dāng)時(shí)種種植的的是一一種抗抗黃瓜瓜花葉葉病毒毒和煙煙草花花葉病病毒雙雙價(jià)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因煙草草。（二））轉(zhuǎn)基基因植植物的的幾大大類型型1.抗除草草劑:除草作作用的的酶和和蛋白白質(zhì)基基因;以除草草劑為為底物物的酶酶的基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移2.抗蟲:從細(xì)菌菌中、、植物物組織織中和和動(dòng)物物體內(nèi)內(nèi)分離離出相相關(guān)抗抗性基基因,轉(zhuǎn)入植植物中中3.抗病4.抗逆境境:抗旱、、抗寒寒、抗抗熱和和抗鹽鹽5.品質(zhì)改改良6.代謝修修飾7.生產(chǎn)藥藥物二、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因植物物技術(shù)術(shù)原理理和方方法（一））基因因獲得得（1）氨氨基基酸酸序序列列反反推推核核酸酸序序列列，，合合成成探探針針，，從從基基因因組組或或cDNA文庫庫中中篩篩選選利用用這這種種方方法法人人類類首首次次人人工工合合成成了了胰胰島島素素基基因因。。雖然然在在早早期期采采用用這這種種方方式式已已經(jīng)經(jīng)成成功功地地克克隆隆了了許許多多基基因因。。局限限性性：：兼兼并并密密碼碼子子;效率率低低;未知知基基因因及及產(chǎn)產(chǎn)物物分離離蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)明確確氨氨基基酸酸序序列列推導(dǎo)導(dǎo)核核苷苷酸酸序序列列人工工合合成成（2）分分離離蛋蛋白白，，制制備備抗抗體體，，用用抗抗體體從從cDNA表達(dá)達(dá)文文庫庫中中篩篩選選（3）根根據(jù)據(jù)數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)庫庫信信息息，，利利用用保保守守區(qū)區(qū)域域制制備備PCR引物物，，進(jìn)進(jìn)行行擴(kuò)擴(kuò)增增（4）以以其其他他物物種種的的類類似似基基因因?yàn)闉樘教结樶?，，雜雜交交分分離離相相應(yīng)應(yīng)基基因因（二二））外外源源基基因因?qū)?dǎo)入入1.載體體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化系系統(tǒng)統(tǒng)是目目前前植植物物基基因因工工程程中中使使用用最最多多、、機(jī)機(jī)理理最最清清楚楚、、技技術(shù)術(shù)最最成成熟熟的的、、最最重重要要的的一一種種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化系系統(tǒng)統(tǒng)TumorinducedbyA.tumefaciens冠癭癭瘤瘤過程程：：先先將將帶帶有有目目的的基基因因的的質(zhì)質(zhì)粒粒整整合合到到農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌基基因因組組中中，，再再將將此此農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌與與植植物物細(xì)細(xì)(1)根癌農(nóng)農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化系系統(tǒng)。。含有Ti質(zhì)粒，，感染染雙子葉葉植物物時(shí)，質(zhì)質(zhì)粒中中DNA整合到到植物物的染染色體體上，，并隨隨染色色體一一起復(fù)復(fù)制。。隨后后T-DNA攜帶的的基因因在植植物中中表達(dá)達(dá)出相相應(yīng)的的蛋白白質(zhì)。。Ti質(zhì)粒是是約160-240kb的環(huán)狀狀DNA分子。。Ti質(zhì)粒具具有兩兩個(gè)區(qū)區(qū)域，，T-DNA和毒性區(qū)區(qū)域(vir)還具有有冠癭癭堿代代謝(opinecatabolism)、復(fù)制制原點(diǎn)點(diǎn)(ori)。T-DNA區(qū)包括括：章魚堿堿合成成酶基基因nos植物生生長(zhǎng)素素生物物合成成酶基基因Tm1,Tm2植物分分裂素素生物物合成成酶基基因tmrT-DNA區(qū)編碼碼的基基因第一類類是編編碼冠冠癭堿堿合成成酶及及分解解代謝謝基因因。第二類類是致致瘤基基因生長(zhǎng)素素基因因（Aux）。即即腫瘤瘤細(xì)胞胞莖芽芽產(chǎn)生生Tms基因（（tumourmorphologyshoot）Aux-l（Tm-1），編編碼色色氨酸酸單加加氧酶酶,將色氨氨酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成成吲哚哚乙酰酰胺IAMAux-2（Tm-2），編碼吲哚哚乙酰胺水解解酶，將IAM轉(zhuǎn)變成乙酸吲吲哚IAA。細(xì)胞分裂素基基因（cyt），突變將引引起易生根特特性。故稱為為Tmr（tumourmorphologyroot）基因由于Tms和Tmr基因的表達(dá)，，使轉(zhuǎn)化植物物細(xì)胞內(nèi)激素素平衡紊亂，，冠癭瘤細(xì)胞胞無限生長(zhǎng)，，形成激素自自主性特性，，引起癌變。。T-DNA:農(nóng)桿菌侵染植植物細(xì)胞時(shí)，，從Ti質(zhì)粒上切割下下來轉(zhuǎn)移到植植物細(xì)胞的一一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因因與腫瘤的形形成有關(guān)直接參與轉(zhuǎn)移移并整合的，，僅是T-DNA兩端與其它序序列交界處的的25bp不完全直接重重復(fù)，為右界界(rightborder,RB)和左界(leftborder,LB)。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有有基因與轉(zhuǎn)移移無關(guān)，將致致瘤基因全部部缺失即卸甲甲(disarmed)后，將其它序序列插入到這這個(gè)區(qū)域，形形成的T-DNA仍可將將RB至LB內(nèi)的序序列轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移并并整合合到植植物基基因組組。Vir基因:區(qū)段上上的基基因能能激活活T-DNA轉(zhuǎn)移，，使農(nóng)農(nóng)桿菌菌表現(xiàn)現(xiàn)出毒毒性根據(jù)其其誘導(dǎo)導(dǎo)的植植物冠冠癭瘤瘤中所所合成成的冠冠癭堿堿種類類不同同，Ti質(zhì)?？煽梢员槐环殖沙伤姆N種類型型：章魚堿堿型(octopine)胭脂堿堿型(nopaline)農(nóng)桿堿堿型（（agropine）農(nóng)桿菌菌素堿堿型（（agrocinopine）或稱稱琥珀珀堿型型(succinamopine)為了使使Ti質(zhì)粒成成為有有效的的外源源基因因?qū)肴胼d體體，必必須對(duì)對(duì)野生生型Ti質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行改改造去除致致瘤基基因，，及冠冠癭堿堿合成成基因因，保保留左左右邊邊界，，及毒毒性區(qū)區(qū)域增加選選擇標(biāo)標(biāo)記（（如：：大觀觀霉素素）和和報(bào)告告基因因增加大大腸桿桿菌復(fù)復(fù)制起起始子子，構(gòu)構(gòu)建植植物細(xì)細(xì)胞-大腸桿桿菌穿穿梭質(zhì)質(zhì)粒目前有有共整合合載體體系統(tǒng)統(tǒng)和雙元載載體系系統(tǒng)共整合合載體體：載體體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖鎖，又又稱之之為順順式載載體（（cis-vector）。特點(diǎn)：：①由由兩個(gè)個(gè)質(zhì)粒粒（E.coli質(zhì)粒和和Ti質(zhì)粒））重組組而成成，分分子量量較大大；②共合合體的的形成成頻率率與兩兩個(gè)質(zhì)質(zhì)粒的的重組組頻率率有關(guān)關(guān),相對(duì)較低；；③必須用Southern雜交或PCR對(duì)大的共整整合體質(zhì)粒粒進(jìn)行檢測(cè)測(cè)；④構(gòu)建時(shí)比比較困難。。共整合載體體和農(nóng)桿菌菌質(zhì)粒重組過過程土壤農(nóng)桿菌菌-植物DNA轉(zhuǎn)移體系步步驟植物敏感細(xì)細(xì)胞和土壤壤農(nóng)桿菌相相互作用土壤農(nóng)桿菌菌的毒性區(qū)區(qū)基因被激激活T-DNA的切割和T復(fù)合物生成成T復(fù)合物由土土壤農(nóng)桿菌菌經(jīng)植物細(xì)細(xì)胞膜進(jìn)入入植物細(xì)胞胞T-DNA整合到植物物染色體上上雙元載體系系統(tǒng)：由兩個(gè)分分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的的雙質(zhì)粒系系統(tǒng),又因?yàn)槠銽-DNA與Vir基因在兩個(gè)個(gè)獨(dú)立的質(zhì)質(zhì)粒上，通通過反式激激活T-DNA轉(zhuǎn)移,故稱之為反反式載體（（transvecter）.包括兩個(gè)Ti質(zhì)粒，即微微型Ti質(zhì)粒和輔助助Ti質(zhì)粒。（2）發(fā)根農(nóng)桿桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化Ri質(zhì)粒為根誘誘導(dǎo)質(zhì)粒。。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)構(gòu)與Ti質(zhì)粒很相似似，分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)等。T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：：①T區(qū)的左右邊邊界序列，，含有25bp的重復(fù)序列列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中中含有與毛毛狀根形成成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中中含有與農(nóng)農(nóng)桿堿合成成有關(guān)的基基因（ags）和生長(zhǎng)素素合成有關(guān)關(guān)的基因（（tms1、tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化化的初期起起著重要的的作用，是是不定根產(chǎn)產(chǎn)生的關(guān)鍵鍵和Ti質(zhì)粒相比，，Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化有有許多優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：①Ri質(zhì)粒可以不不經(jīng)“解除武裝”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，，并且轉(zhuǎn)化化產(chǎn)生的發(fā)發(fā)根能夠再再生植株；；②發(fā)狀根是是一個(gè)單細(xì)細(xì)胞克隆，，可以避免免嵌合體；；③Ri質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒可以以配合使使用，建建立雙元元載體系系統(tǒng)，拓拓展了兩兩種質(zhì)粒粒應(yīng)用范范圍；④發(fā)根適適用于進(jìn)進(jìn)行離體體培養(yǎng)，，很多植植物的發(fā)發(fā)根在離離體培養(yǎng)養(yǎng)條件下下都有原原植物次次生代謝謝產(chǎn)物合合成能力力。(3)植物病毒毒載體病毒載體體只要與與植物細(xì)細(xì)胞共培培養(yǎng)就可可以較高高地感染染植物細(xì)細(xì)胞；且且外源基基因能在在植物細(xì)細(xì)胞中快快速復(fù)制制和高水水平表達(dá)達(dá)。但病毒載體的的容量有限,不能包裝大片片段,寄主范圍窄,復(fù)制穩(wěn)定性差差,轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機(jī)機(jī)理復(fù)雜。目前,用的較多的是是花椰菜花斑病病病毒(CaMV)和煙草花葉病病毒(TMV)。需要注意的是是其他病毒侵侵染植株后可可能會(huì)跟所用用的載體病毒毒之間發(fā)生信信息交換,進(jìn)而導(dǎo)致載體體病毒重新獲獲得其致病能能力Promotersusedforexpressionintransgenicplants35S,cauliflowermosaicvirus35SpromoterCaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.CaMVisacirculardsDNAgenomevirus2.基因直接接導(dǎo)入農(nóng)桿菌載載體轉(zhuǎn)化化系統(tǒng)對(duì)對(duì)單子葉葉植物的的局限性性（1）DNA直接吸收收到植物物細(xì)胞制備原生生質(zhì)體，，電穿孔法法PEG等介導(dǎo)基基因轉(zhuǎn)化化（2）顯微注注射法顯微注射射，是利利用顯微微注射儀儀將外源源DNA直接注入入受體細(xì)細(xì)胞質(zhì)或或細(xì)胞核核中。顯顯微注射射的一個(gè)個(gè)重要問問題是必必須把受受體細(xì)胞胞進(jìn)行固固定。不需要去去除細(xì)胞胞壁成本高細(xì)胞存活活率低（3）脂質(zhì)體體介導(dǎo)基基因轉(zhuǎn)化化脂質(zhì)體法法是用脂脂類化學(xué)學(xué)包裹DNA成球體，，通過植植物原生生質(zhì)體的的吞噬或或融合作作用把內(nèi)內(nèi)含物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體體細(xì)胞。。優(yōu)點(diǎn),包括可保保護(hù)DNA在導(dǎo)入細(xì)細(xì)胞之前前免受核核酸酶的的降解作作用,降低了對(duì)對(duì)細(xì)胞的的毒性效效應(yīng),適用的植植物種類類廣泛,重復(fù)性高高,包裝在脂脂質(zhì)體內(nèi)內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地地貯藏等等。（4）粒子介介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移基因槍法法（genegun）是依賴賴高速的的金屬微微粒將外外源基因因?qū)牖罨罴?xì)胞的的一種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化技術(shù)術(shù)。其基本原原理是將將外源DNA包被在微微小的金金?；蜴u鎢粒表面面，然后后在高壓壓的作用用下微粒粒被高速速射入受受體細(xì)胞胞或組織織。微粒粒上的DNA進(jìn)入細(xì)胞胞后整合合到植物物染色體體上得到到表達(dá)，，從而實(shí)實(shí)現(xiàn)基因因轉(zhuǎn)化。。是繼農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)法之之后的第二二大基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法。在禾本科作作物上應(yīng)用用較廣泛基因槍法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)有：無宿主限制制：農(nóng)桿菌介介導(dǎo)法只對(duì)對(duì)雙子葉植植物敏感，，限制了它它的應(yīng)用范范圍。而基基因槍沒有有物種限制制。靶受體類型型廣泛：可以是原原生質(zhì)體，，葉片，懸懸浮細(xì)胞，，莖或根切切段，種子子胚，愈傷傷組織，花花粉等。操作簡(jiǎn)單快快速但該方法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率低，，外源DNA整合機(jī)理不不清楚。應(yīng)應(yīng)該說該技技術(shù)只處在在研究階段段，尚未成成熟。3.種質(zhì)轉(zhuǎn)化系系統(tǒng)法種質(zhì)轉(zhuǎn)化系系統(tǒng)是以植物自自身的生殖殖系統(tǒng)種質(zhì)質(zhì)細(xì)胞為受受體進(jìn)行的的轉(zhuǎn)化，如如花粉浸泡泡外源DNA、DNA注射受粉后后的子房等等；花粉管通道道法：利用植物物在受精和和胚發(fā)育初初期接受外外源DNA的敏感性1.外源DNA轉(zhuǎn)化花粉2.自花授粉后后，下柱頭頭，外源DNA滴在柱頭，，沿花粉管管道進(jìn)入胚胚囊，轉(zhuǎn)化化受精前后后的卵細(xì)胞胞常用植物基基因轉(zhuǎn)化方方法特點(diǎn)比比較轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法花粉管通道法受體材料完整細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體完整細(xì)胞卵細(xì)胞宿主范圍

有無無無無有性繁殖植物組培條件簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單無嵌合體比例有無無無多無操作復(fù)雜性簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單設(shè)備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴便宜工作效率高低低低高低單子葉植物應(yīng)用少可行可行可行廣泛廣泛（三）受體體系統(tǒng)1.原生質(zhì)體受受體系統(tǒng):嵌合體少少，易變異異，再生頻頻率低原生質(zhì)體恢恢復(fù)細(xì)胞壁壁具有分化化再生能力力，是應(yīng)用用最早的再再生受體系系統(tǒng)之一。。優(yōu)點(diǎn)：高效效、廣泛地地?cái)z取外源源DNA或遺傳物質(zhì)質(zhì)，獲得基基因型一致致的克隆細(xì)細(xì)胞，所獲獲轉(zhuǎn)基因植植株嵌合體體少，適用用于多種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；；缺點(diǎn)：不易易制備、再再生困難和和變異程度度高。2.愈傷組織受受體系統(tǒng)：植體材料經(jīng)經(jīng)過脫分化化培養(yǎng)誘導(dǎo)導(dǎo)形成愈傷傷組織，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化（帶有有目的基因因質(zhì)粒的農(nóng)農(nóng)桿菌侵染染），分化化培養(yǎng)獲得得再生植株株。愈傷組織易易接受外源源DNA，轉(zhuǎn)化效率率高,適用性廣，，變異大優(yōu)點(diǎn)：外植植體來源廣廣，繁殖快快，易接受受外源基因因，轉(zhuǎn)化化效率高。。缺點(diǎn)：遺傳傳穩(wěn)定性差差、嵌合體體。因此需需要連續(xù)的的再生系統(tǒng)統(tǒng)3.種質(zhì)系統(tǒng)：生殖細(xì)胞胞接受外源源DNA能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的基因因無顯隱性性的影響,與育育種種結(jié)結(jié)合合緊緊密密，，受受季季節(jié)節(jié)限限制制以生生殖殖細(xì)細(xì)胞胞如如花花粉粉粒粒、、卵卵細(xì)細(xì)胞胞等等受受體體細(xì)細(xì)胞胞進(jìn)進(jìn)行行外外源源基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化的的系系統(tǒng)統(tǒng)。。一是是利利用用組組織織培培養(yǎng)養(yǎng)技技術(shù)術(shù)進(jìn)進(jìn)行行小小孢孢子子和和卵卵細(xì)細(xì)胞胞的的單單倍倍體體培培養(yǎng)養(yǎng)、、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化受受體體系系統(tǒng)統(tǒng)；；二是是直直接接利利用用花花粉粉和和卵卵細(xì)細(xì)胞胞受受精精過過程程進(jìn)進(jìn)行行基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化，，如如花花粉粉管管導(dǎo)導(dǎo)入入法法，，花花粉粉粒粒浸浸泡泡法法，，子子房房微微針針注注射射法法等等。。4.胚狀狀體體再再生生系系統(tǒng)統(tǒng)：最最理理想想的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化受受體體系系統(tǒng)統(tǒng)體細(xì)細(xì)胞胞胚胚使使具具卵卵細(xì)細(xì)胞胞特特性性的的胚胚性性細(xì)細(xì)胞胞發(fā)發(fā)育育而而來來，，接接受受外外源源DNA能力力強(qiáng)強(qiáng)體細(xì)細(xì)胞胞單單細(xì)細(xì)胞胞起起源源，，嵌嵌合合體體少少；；體體胚胚具具兩兩極極性性，，可可同同時(shí)時(shí)分分化化根根和和芽芽；；個(gè)個(gè)體體遺遺傳傳背背景景一一致致，，可可通通過過反反應(yīng)應(yīng)器器大大規(guī)規(guī)模模生生產(chǎn)產(chǎn)。。5.直接接分分化化芽芽受受體體系系統(tǒng)統(tǒng)：由由未未分分化化的的細(xì)細(xì)胞胞直直接接分分化化形形成成，，體體細(xì)細(xì)胞胞元元件件系系變變異異小小，，導(dǎo)導(dǎo)入入的的外外源源基基因因可可穩(wěn)穩(wěn)定定遺遺傳傳。。但易易形形成成嵌嵌合合體體，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化頻頻率率低低。。（四四））表表達(dá)達(dá)和和分分析析基因因水水平平的的檢檢測(cè)測(cè)：：RE分析析，，DNA序列列分分析析，，PCR，SouthernBlot，RFLP，RAPD等。翻譯水平的檢檢測(cè)：ELISA，Western選擇標(biāo)記基因因檢測(cè)法：抗生素抗性基基因除草劑抗性基基因報(bào)告基因檢測(cè)測(cè)法：冠癭堿基因Gus基因(β-葡糖苷酸酶酶基因)Cat(氯霉素乙酰酰轉(zhuǎn)移酶基基因)(GFP)綠色熒光蛋蛋白基因Gus基因（β-葡糖苷酸酶酶基因）在植物細(xì)胞胞中所產(chǎn)生生的葡糖苷苷酸酶在檢檢測(cè)上具有有以下特點(diǎn)點(diǎn)：①在一定條條件下與X-G1ucuionicacid底物發(fā)生作作用，產(chǎn)生生藍(lán)色沉淀淀，既可以以用分光光光度法測(cè)定定，又可以以直接觀察察到植物組組織中形成成的藍(lán)色斑斑點(diǎn)。②當(dāng)加入4-甲基傘形酮酮基和葡萄萄糖苷酸時(shí)時(shí)生成4-甲基傘形酮酮，發(fā)熒光光（λ=465nm）。因而可可以用熒光光光譜法測(cè)測(cè)定。由于于熒光強(qiáng)度度高，本底底低，故熒熒光檢測(cè)極極為靈敏。。三、轉(zhuǎn)基因因植物生產(chǎn)產(chǎn)藥用植物物的安全性性問題1.安全性問題題轉(zhuǎn)基因植物物存在的用用于選擇性性標(biāo)記的抗抗生素，以以及導(dǎo)入植植物的DNA序列在加工工過程中可可能出現(xiàn)的的改變。2.環(huán)境及生態(tài)態(tài)問題導(dǎo)入植物的的目的基因因是否轉(zhuǎn)入入其他植物物，是否會(huì)會(huì)破壞生態(tài)態(tài)平衡。第四節(jié)在在制藥工工業(yè)上的應(yīng)應(yīng)用一、生產(chǎn)天天然藥物(1)人參細(xì)胞培培養(yǎng)MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)初期低低糖，生長(zhǎng)長(zhǎng)后期補(bǔ)糖糖控制磷酸鹽鹽濃度和PH添加生長(zhǎng)素素和激動(dòng)素素離心葉輪式式反應(yīng)器進(jìn)進(jìn)行高密度培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞干重最最多達(dá)30g/L人參皂苷達(dá)達(dá)2g/L(2)紅豆杉細(xì)胞胞培養(yǎng)紫杉醇(Paclitaxel):二萜類化合合物,抗癌藥，是是有絲分裂裂抑制劑，，可阻止微微管正常生生理聚集，，抑制癌細(xì)細(xì)胞的有絲絲分裂和紡紡錘體的形形成，從而而使癌細(xì)胞胞的復(fù)制受受到阻斷而而凋亡。1967年美國化學(xué)學(xué)家Wall和Wani首先從太平平洋紫杉杉（短葉紅紅豆杉）樹樹皮中提取取出來。該該藥1992年底獲美國國FDA批準(zhǔn)上市。。紫杉醇存在在于紅豆杉杉屬植物的的樹皮、葉葉及莖中，，其中樹樹皮中的含含量最高。。12000株成年紫杉杉樹中才能能提取1KG的紫杉醇，，而且紫杉杉的生長(zhǎng)周周期很長(zhǎng)，，在世界分分布很少。。紫杉醇的國國際市場(chǎng)價(jià)價(jià)格為450美元/gB5培養(yǎng)基，補(bǔ)補(bǔ)糖，暗培培養(yǎng)低濃度的生生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)子培養(yǎng)基中加加甲基戊酸酸，苯丙氨氨酸等前體體加甲瓦龍酸酸等中間產(chǎn)產(chǎn)物加單萜合成成抑制劑篩選細(xì)胞株株最高產(chǎn)量達(dá)達(dá)0.15g/L(3)丹參發(fā)根生生物反應(yīng)器器大規(guī)模培培養(yǎng)技術(shù)丹參(Salviamiltiorrhiza)：活血化淤淤,通經(jīng)止痛.丹參中含有有二類活性性成分:脂溶性二萜萜醌類化合合物和水溶溶性酚酸類類化合物.具有抑制血血小板聚集集、耐缺氧氧、改善冠冠狀動(dòng)脈供供血等藥理理作用,是治療心血血管系統(tǒng)疾疾病的重要要藥物。丹參有效成成分在原植植物根中含含量低、生生長(zhǎng)周期長(zhǎng)長(zhǎng),加之之近近年年產(chǎn)產(chǎn)地地環(huán)環(huán)境境污污染染和和為為防防病病蟲蟲噴噴施施農(nóng)農(nóng)藥藥等等原原因因,便得得原原料料藥藥的的供供應(yīng)應(yīng)在在數(shù)數(shù)量量和和質(zhì)質(zhì)量量上上都都不不能能滿滿足足臨臨床床應(yīng)應(yīng)用用的的需需要要。。用植植物物組組織織培培養(yǎng)養(yǎng)反反應(yīng)應(yīng)器器(10L規(guī)模模)進(jìn)行行了了丹丹參參發(fā)發(fā)根根培培養(yǎng)養(yǎng)的的研研究究,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)丹丹參參發(fā)發(fā)根根在在50天內(nèi)內(nèi)鮮鮮重重增增殖殖倍倍數(shù)數(shù)可可高高達(dá)達(dá)240倍左左右右,丹參參酮酮、、丹丹酚酚酸酸A的含含量量也也相相當(dāng)當(dāng)高高，，非非常常適適合合于于丹丹參參發(fā)發(fā)根根的的生生長(zhǎng)長(zhǎng)及及丹丹參參酮酮的的積積累累,而且且利利用用此此系系統(tǒng)統(tǒng)生生產(chǎn)產(chǎn)出出的的丹丹參參及及其其有有效效成成分分由由于于不不受受農(nóng)農(nóng)藥藥等等污污染染物物的的影影響響,具有有廣廣闊闊的的市市場(chǎng)場(chǎng)前前景景。。丹參參發(fā)發(fā)根根生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器培培養(yǎng)養(yǎng)的的中中試試已已達(dá)達(dá)100L規(guī)模。(4)紫草細(xì)胞胞培養(yǎng)化學(xué)成分分:含乙酰紫紫草素、、β-羥基異戊戊酰紫草草素、紫紫草素、、β，β’-二甲基丙丙烯酰紫紫草素等等。性味性寒寒，味甘甘、咸。。功能主治治涼血血，活血血，解毒毒透疹。。用于血血熱毒盛盛、斑疹疹紫黑、、麻疹不不透、瘡瘡瘍、濕濕疹、水水火燙傷傷。紫草寧產(chǎn)產(chǎn)生于亞亞洲的多多年生植植物紫紫草的根根部。。但紫草草資源嚴(yán)嚴(yán)重不足足，在日日本，紫紫草已瀕瀕臨滅絕絕，在我我國，紫紫草列入入了國際際二級(jí)保保護(hù)植物物紫草寧可可用作創(chuàng)創(chuàng)傷、燒燒傷以及及痔瘡的的治療藥藥物，同同時(shí)又作作為高級(jí)級(jí)色素使使用。紫草的人人工栽培培成活率率低，而而且直接接提取紫紫草寧的的無法滿滿足市場(chǎng)場(chǎng)需求。?；瘜W(xué)合成成紫草寧寧的工藝藝非常復(fù)復(fù)雜，且最終產(chǎn)產(chǎn)率只有有0.7％，生產(chǎn)產(chǎn)成本昂昂貴。紫草寧在在國際市市場(chǎng)上售售價(jià)高達(dá)達(dá)7000美元/kg1974年Tabata等就研究究了用于于培養(yǎng)紫紫草細(xì)胞胞的培養(yǎng)養(yǎng)基。1981年Tabata和Fujita等又用大大的培養(yǎng)養(yǎng)容器進(jìn)進(jìn)行細(xì)胞胞懸浮培培養(yǎng)并獲獲得了紫紫草寧衍衍生物。。日本在1983年進(jìn)行紫紫草細(xì)胞胞大規(guī)模模培養(yǎng)來來生產(chǎn)紫紫草寧。。我國南京京大學(xué)等等從1986年開始對(duì)對(duì)該項(xiàng)目目進(jìn)行研研究，在在進(jìn)行大大量的研研究之后后得出，，在適當(dāng)當(dāng)?shù)臈l件件下，培培養(yǎng)的紫紫草細(xì)胞胞懸浮物物中紫草草寧含量量占干重重的14%，比紫草草根中的的含量高高10倍。B5,N6,MG5,LS培養(yǎng)基PH5.3-5.8生物誘導(dǎo)導(dǎo)子生長(zhǎng)素與與激動(dòng)素素25度暗培養(yǎng)兩步培養(yǎng)養(yǎng)法使用兩個(gè)個(gè)生物反反應(yīng)器，，第一個(gè)個(gè)用于細(xì)細(xì)胞生物物量的累累積(適合細(xì)胞胞生長(zhǎng)的的培養(yǎng)基基，營養(yǎng)養(yǎng)豐富)，第二個(gè)個(gè)用于次次級(jí)代謝謝產(chǎn)物的的生產(chǎn)(較低含量量的硝酸酸鹽和磷磷酸鹽，，并含有有較低的的糖分或或少量的的碳源)日本科學(xué)學(xué)家用此此方法開開發(fā)了第第一個(gè)植物細(xì)胞工程產(chǎn)產(chǎn)品——紫草寧通過提高高第二個(gè)個(gè)反應(yīng)器器中的Ca2+濃度，大大幅度增加了培培養(yǎng)液中中的紫草草素含量量二、生產(chǎn)產(chǎn)抗體、、重組疫疫苗、多多肽類藥藥物上游游生生產(chǎn)產(chǎn)成成本本低低獲取取的的遺遺傳傳性性質(zhì)質(zhì)穩(wěn)穩(wěn)定定自然然條條件件下下易易于于生生長(zhǎng)長(zhǎng)，，管管理理植物物作作為為生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器，，可可省省去去下下游游提提取取，，廉廉價(jià)價(jià)生生產(chǎn)產(chǎn)蛋白白在在植植物物中中多多數(shù)數(shù)正正確確折折疊疊，，保保證證生生物物活活性性的的穩(wěn)穩(wěn)定定利用用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因植植物物生生產(chǎn)產(chǎn)抗抗體體表達(dá)達(dá)抗抗體體的的關(guān)關(guān)鍵鍵是是抗抗體體片片段段正確確組組裝裝和和糖糖基基化化等后后修修飾飾。。在在植物物和和動(dòng)動(dòng)物物的的內(nèi)內(nèi)膜膜系系統(tǒng)統(tǒng)中中蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)折折疊疊機(jī)機(jī)制制相相當(dāng)當(dāng)類類似似，植植物物能能夠夠表表達(dá)達(dá)全全長(zhǎng)長(zhǎng)的的抗抗體體重重鏈鏈、、輕輕鏈鏈并并能能高高效效組組裝裝構(gòu)構(gòu)成成完完整整的的抗抗體體。。植物中的的糖基化化同時(shí)包包括N及O糖基化，，和動(dòng)物物稍有不不同，植物的糖糖基化更更具有異異質(zhì)性，不同植植物產(chǎn)生生的糖基基化末端端不相同同，即使使是同一一株植物物不同時(shí)時(shí)期產(chǎn)生生的糖基基末端仍仍有不同同。糖基基化不會(huì)會(huì)對(duì)抗體體與抗原原的結(jié)合合能力及及特異性性產(chǎn)生影影響，，但可能能會(huì)影響響抗體構(gòu)構(gòu)型或體體內(nèi)的清清除。目前研究究發(fā)現(xiàn)苜苜蓿可產(chǎn)產(chǎn)生單一一糖型的的抗體，，它有望望成為更更為合適適的表達(dá)達(dá)系統(tǒng)。。許多IgG單抗已能能在植物物中表達(dá)達(dá)，且在在治療中中有應(yīng)用用價(jià)值。。第一個(gè)個(gè)在植物物中表達(dá)達(dá)的抗體體是IgG1，通過雜雜交繁殖殖的煙草草表達(dá)其其重鏈及及輕鏈構(gòu)構(gòu)成完整整的抗體體，圖5-13。目前，表表達(dá)的類類型有分分泌抗體體和抗體體片段。