器官移植配型課件

器官移植配型器官移植配型1基本概念廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置換病變或功能缺失的器官、組織或細胞，以維持和重建機體的生理功能。影響移植成功的關(guān)鍵因素是可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)；基本概念廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置2一.基本概念人人豬相關(guān)概念同種異體移植異種移植同系移植移植自體移植一.基本概念人人豬相關(guān)概念同種異體移植異種移植同系移植移3引起排斥反應(yīng)的抗原ABO血型抗原；組織特異性抗原；主要組織相容性抗原(MHA,majorhistocompatibilityantigen)，又稱人類白細胞抗原（HLA）;次要組織相容性抗原（mHA,minorhistocompatibilityantigen）H-Y抗原;引起排斥反應(yīng)的抗原ABO血型抗原；4HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點由第6號染色體短臂21.31區(qū)編碼，按功能分為HLA-I,Ⅱ,Ⅲ三個區(qū)域，其中I,Ⅱ區(qū)編碼抗原與移植關(guān)系密切。HLA-I類抗原主要由A、B、C位點編碼；HLA-Ⅱ類抗原由DR、DP、DQ位點編碼；HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點由第6號染色體短臂21.315HLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的α鏈與第15號染色體編碼的β2微球蛋白非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在有核細胞表面；HLA-Ⅱ類抗原由第6號染色體相應(yīng)Ⅱ類基因編碼的α鏈和β鏈非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在抗原遞呈細胞，胸腺上皮細胞表面；HLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的α鏈與第16HLA抗原的生物學(xué)功能1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈；2.調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；3.參與T細胞分化過程；4.介導(dǎo)同種免疫應(yīng)答；HLA抗原的生物學(xué)功能1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈；7HLA基因的遺傳特點1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點復(fù)等位的特點；2.共顯性遺傳：每對等位基因同時表達；3.單倍型遺傳：位于同一條染色體上的HLA各位點的基因組合；4.連鎖不平衡：單倍型基因非隨機分布的現(xiàn)象；HLA基因的遺傳特點1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點復(fù)等82.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù)血清學(xué)分型:補體依賴的細胞毒實驗;待測淋巴細胞與已知抗體孵育，再加入補體，若該抗體與淋巴細胞膜上HLA分子相匹配，則激活補體系統(tǒng)導(dǎo)致待測細胞膜的破壞，否則細胞膜完整不受影響。局限性：需要活的淋巴細胞；存在交叉反應(yīng)；隱蔽抗原無法識別；人為影響因素多質(zhì)控難做；2.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù)血清學(xué)分型:補體依賴的細胞毒實驗;9細胞學(xué)分型：混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)；受者淋巴細胞與已知類型的淋巴細胞或者供者淋巴細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞HLA分子表型如果相同則不能刺激淋巴細胞增殖，反之則刺激淋巴細胞增殖，分為單雙向兩種類型。局限性：需要活的純合子表型的淋巴細胞；增殖檢測方法要用到同位素；細胞學(xué)分型：混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)；10分子生物學(xué)技術(shù)分型HLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基因的多態(tài)性；RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP;PCR-SSCP;PCR-Sequencing；PCR-SSO/基因芯片技術(shù)；流式細胞儀技術(shù)；氨基酸殘基配型標準分析技術(shù)；分子生物學(xué)技術(shù)分型HLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基11聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

在多聚合酶，引物，底物和模板的參與下通過變性，退火，延伸三個循環(huán)步驟在短時間內(nèi)達到對目的片斷的大量擴增，是基因分型的基礎(chǔ)。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）12RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/

基因組DNA提取酶切電泳分析（RFLP）

DNA擴增（共性引物/特異性引物）

(限制性內(nèi)切酶酶切)

電泳檢測(PCR-RFLP/PCR-SSP)

器官移植配型課件13PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）提取基因組DNAPCR擴增（特異引物）變性(雙鏈單鏈)聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)帶型可檢出基因的多態(tài)性又可檢出點突變，有利于發(fā)現(xiàn)新的等位基因PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）提取基因組DNA14PCR-sequencing提取基因組DNAPCR擴增（非特異/特異引物）DNA測序最可靠、直接、準確的HLA分型方法；臨床上應(yīng)用限制了供體的來源；在確定等位基因的多態(tài)性、發(fā)現(xiàn)新位點、基因定位等研究領(lǐng)域應(yīng)用較多；PCR-sequencing提取基因組DNAPC15PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù)正向雜交：提取基因組DNAPCR擴增（共性引物）將PCR產(chǎn)物固定在固相支持載體上并進行變性處理與標記的特異性寡核苷酸探針變性雜交根據(jù)雜交信號判斷HLA類型；反向雜交：將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上與標記的PCR產(chǎn)物（已經(jīng)變性處理）雜交根據(jù)雜交信號判斷HLA類型；基因芯片技術(shù)是一種反向PCR-SSO方法，具有高通量、縮微化、自動化程度高、準確性高等優(yōu)勢；PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù)正16流式細胞儀技術(shù)提取基因組DNA非特異性PCR擴增變性處理與包被了特異性HLA探針的微球結(jié)合洗脫處理通過流式細胞儀檢測利用流式細胞儀技術(shù)將反向的固相PCR－SSO技術(shù)變?yōu)橐合鄼z測分析技術(shù)；每種包被了不同類型HLA－DNA探針的微球?qū)?yīng)一種熒光染色能夠被流式細胞儀識別；具有高通量、準確快速的優(yōu)勢；流式細胞儀技術(shù)提取基因組DNA非特異性PCR擴增17氨基酸殘基配型標準分型技術(shù)根據(jù)HLA分子346個氨基酸殘基中對移植物排斥與存活率具有重要影響的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)供受者的關(guān)鍵氨基酸殘基相同，盡管接受HLA抗原部分錯配的供體，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性仍然是低反應(yīng)性或無免疫反應(yīng)性，從而使移植物得以長期存活。氨基酸殘基配型標準分型技術(shù)根據(jù)HLA分子346個氨基酸殘基中18HLA分型技術(shù)臨床應(yīng)用評價1.在器官移植中具有重要臨床意義；

六位點配型原則：HLA-A/B/DR2.合理選擇HLA基因分型技術(shù)；

各種方法相互補充，難以相互替代，根據(jù)不同需求選擇不同方法HLA分型技術(shù)臨床應(yīng)用評價1.在器官移植中具有重要臨床意義；19方法血清學(xué)分型/細胞分型基因分型(SSP/SSOP/SB)識別位點HLA分子抗原特異性，某些氨基酸殘基位點DNA序列差異分辨率低（抗原特異性）HLA-A01低（抗原特異性）/中等（集團特異性）/高（等位基因特異性）HLA-A*01；HLA-A*0101/0102/0103；HLA-A*01010203抗原法/基因法方法血清學(xué)分型/細胞分型基因分型(SSP/SSOP/SB)識20字母HLA代表染色體上一段特殊的遺傳區(qū)域（人類白細胞表面抗原區(qū)域）；A/B/DR代表該區(qū)域某一具體的基因座位；數(shù)字代表該基因座位編碼的特異性抗原（血清型）。括號內(nèi)的數(shù)字表示前一抗原是該抗原的“剪切產(chǎn)物”(存在抗原決定簇交叉現(xiàn)象)。

抗原名（antigennames）HLATyping的命名字母HLA代表染色體上一段特殊的遺傳區(qū)域（人類白細胞表面抗原212.等位基因名(allelenames)2.等位基因名(allelenames)22器官移植配型器官移植配型23基本概念廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置換病變或功能缺失的器官、組織或細胞，以維持和重建機體的生理功能。影響移植成功的關(guān)鍵因素是可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)；基本概念廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置24一.基本概念人人豬相關(guān)概念同種異體移植異種移植同系移植移植自體移植一.基本概念人人豬相關(guān)概念同種異體移植異種移植同系移植移25引起排斥反應(yīng)的抗原ABO血型抗原；組織特異性抗原；主要組織相容性抗原(MHA,majorhistocompatibilityantigen)，又稱人類白細胞抗原（HLA）;次要組織相容性抗原（mHA,minorhistocompatibilityantigen）H-Y抗原;引起排斥反應(yīng)的抗原ABO血型抗原；26HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點由第6號染色體短臂21.31區(qū)編碼，按功能分為HLA-I,Ⅱ,Ⅲ三個區(qū)域，其中I,Ⅱ區(qū)編碼抗原與移植關(guān)系密切。HLA-I類抗原主要由A、B、C位點編碼；HLA-Ⅱ類抗原由DR、DP、DQ位點編碼；HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點由第6號染色體短臂21.3127HLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的α鏈與第15號染色體編碼的β2微球蛋白非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在有核細胞表面；HLA-Ⅱ類抗原由第6號染色體相應(yīng)Ⅱ類基因編碼的α鏈和β鏈非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達在抗原遞呈細胞，胸腺上皮細胞表面；HLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的α鏈與第128HLA抗原的生物學(xué)功能1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈；2.調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；3.參與T細胞分化過程；4.介導(dǎo)同種免疫應(yīng)答；HLA抗原的生物學(xué)功能1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈；29HLA基因的遺傳特點1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點復(fù)等位的特點；2.共顯性遺傳：每對等位基因同時表達；3.單倍型遺傳：位于同一條染色體上的HLA各位點的基因組合；4.連鎖不平衡：單倍型基因非隨機分布的現(xiàn)象；HLA基因的遺傳特點1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點復(fù)等302.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù)血清學(xué)分型:補體依賴的細胞毒實驗;待測淋巴細胞與已知抗體孵育，再加入補體，若該抗體與淋巴細胞膜上HLA分子相匹配，則激活補體系統(tǒng)導(dǎo)致待測細胞膜的破壞，否則細胞膜完整不受影響。局限性：需要活的淋巴細胞；存在交叉反應(yīng)；隱蔽抗原無法識別；人為影響因素多質(zhì)控難做；2.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù)血清學(xué)分型:補體依賴的細胞毒實驗;31細胞學(xué)分型：混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)；受者淋巴細胞與已知類型的淋巴細胞或者供者淋巴細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞HLA分子表型如果相同則不能刺激淋巴細胞增殖，反之則刺激淋巴細胞增殖，分為單雙向兩種類型。局限性：需要活的純合子表型的淋巴細胞；增殖檢測方法要用到同位素；細胞學(xué)分型：混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)；32分子生物學(xué)技術(shù)分型HLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基因的多態(tài)性；RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP;PCR-SSCP;PCR-Sequencing；PCR-SSO/基因芯片技術(shù)；流式細胞儀技術(shù)；氨基酸殘基配型標準分析技術(shù)；分子生物學(xué)技術(shù)分型HLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基33聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

在多聚合酶，引物，底物和模板的參與下通過變性，退火，延伸三個循環(huán)步驟在短時間內(nèi)達到對目的片斷的大量擴增，是基因分型的基礎(chǔ)。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）34RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/

基因組DNA提取酶切電泳分析（RFLP）

DNA擴增（共性引物/特異性引物）

(限制性內(nèi)切酶酶切)

電泳檢測(PCR-RFLP/PCR-SSP)

器官移植配型課件35PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）提取基因組DNAPCR擴增（特異引物）變性(雙鏈單鏈)聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)帶型可檢出基因的多態(tài)性又可檢出點突變，有利于發(fā)現(xiàn)新的等位基因PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）提取基因組DNA36PCR-sequencing提取基因組DNAPCR擴增（非特異/特異引物）DNA測序最可靠、直接、準確的HLA分型方法；臨床上應(yīng)用限制了供體的來源；在確定等位基因的多態(tài)性、發(fā)現(xiàn)新位點、基因定位等研究領(lǐng)域應(yīng)用較多；PCR-sequencing提取基因組DNAPC37PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù)正向雜交：提取基因組DNAPCR擴增（共性引物）將PCR產(chǎn)物固定在固相支持載體上并進行變性處理與標記的特異性寡核苷酸探針變性雜交根據(jù)雜交信號判斷HLA類型；反向雜交：將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上與標記的PCR產(chǎn)物（已經(jīng)變性處理）雜交根據(jù)雜交信號判斷HLA類型；基因芯片技術(shù)是一種反向PCR-SSO方法，具有高通量、縮微化、自動化程度高、準確性高等優(yōu)勢；PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù)正38流式細胞儀技術(shù)提取基因組DNA非特異性PCR擴增變性處理與包被了特異性HLA探針的微球結(jié)合洗脫處理通過流式細胞儀檢測利用流式細胞儀技術(shù)將反向的固相PCR－SSO技術(shù)變?yōu)橐合鄼z測分析技術(shù)；每種包被了不同類型HLA－DNA探針的微球?qū)?yīng)一種熒光染色能夠被流式細胞儀識別；具有高通量、準確快速的優(yōu)勢；流式細胞儀技術(shù)提取基因組DNA非特異性PCR擴增39氨基酸殘基配型標準分型技術(shù)根據(jù)HLA分子346個氨基酸殘基中對移植物排斥與存活率具有重要影響的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)供受者的關(guān)鍵氨基酸殘基相同，盡管接受HLA抗原部分錯配的供體，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性仍然是低