血紅蛋白與核黃素的凝膠層析分離課件

血紅蛋白與核黃素的

凝膠層析分離實驗目的（1）掌握凝膠層析的原理（2）掌握柱層析的基本裝置（3）熟悉凝膠層析的操作過程實驗原理

凝膠層析又叫分子篩層析，是利用凝膠將分子大小不同的物質進行分離的方法。當分子大小不同的物質通過凝膠時,由于凝膠顆粒內部的網狀結構具有分子篩作用,分子大小不同的溶質就會受到不同的阻滯作用。本實驗用葡聚糖凝膠作支持物，用核黃素（黃色，相對分子質量為267）和血紅蛋白（紅色，相對分子質量為67000）混合物作樣品，在層析時，血紅蛋白相對分子質量大，不能進入凝膠顆粒內部，而從凝膠顆粒間隙流下，所受阻力小，移動速度快，先流出層析柱；核黃素相對分子質量小，可進入凝膠顆粒內部，洗脫流程長，因而所受阻力大，移動速度慢，后流出層析柱。這樣就可分離核黃素和血紅蛋白。實驗操作1、凝膠處理；將SephadexG-25凝膠干粉放入過量水中浸泡24小時或沸水浴2小時。浸泡后攪動凝膠再靜置，待凝膠沉積后，傾去上層細粒懸浮，如此反復多次。2、層析柱的預備用清洗劑將層析柱仔細清洗干凈。清洗過程中不能使用毛刷，以免擦傷層析柱內壁，影響層析分離效果。固定好層析柱各處的接口，用水檢察層析柱各處的接口密封性。將清洗后的層析柱垂直固定在鐵架臺上。自柱底端出口的聚乙烯管內注入溶液以除去柱管內和尼龍網底部的氣泡，待氣泡排除后，是溶液在底部留至3-5cm高即關閉出水口。3、裝柱：將處理好的凝膠在燒杯內用1倍體積的洗脫液攪拌成懸浮液，自柱頂部沿管內壁緩緩加入柱中。待底部凝膠沉積至5cm左右時，緩緩打開底端出口管，隨之繼續(xù)緩慢添加凝膠懸浮液直至凝膠體積沉淀至25cm高度為止。操作中注意防止氣泡與節(jié)痕產生。注意：操作要溫和。凝膠床要整體均勻連續(xù),不得有氣泡、斷紋與節(jié)痕。如凝膠床表面不平整，可用細玻璃棒輕輕將凝膠床上部顆粒攪起，待其自然下沉。4、平衡：柱裝好后，使色譜床穩(wěn)定5-10分鐘，然后接上高位貯液瓶，打開出口活塞，調節(jié)高位貯液瓶的高度，控制流速為1mL/min。用2倍于床體積的洗脫液進行平衡，是層析床穩(wěn)定。

注意：在洗脫時，要將恒流泵至色譜桂的連接管內氣泡全部排除，以免影響流速。另外務必防止流速過大以及過小，造成色譜床液體流干。5、加樣與洗脫：打開平衡好的色譜柱底端出口，使柱內溶液流至床表面相切時時關閉出口。將吸有0.5ml樣品的加樣滴管在床表面lmm處沿管內壁輕輕轉動加樣，加完后，打開底端出口使樣品流至床表面，關閉出口，用少量洗脫液同樣小心清洗管內壁表面l-2次，使樣品流至床表面，然后將洗脫液在柱內約加至2-3cm高，接上高位貯液瓶并調好流速即開始洗脫（注意：在加樣和洗脫過程中應緩慢加入液體，防止沖壞床表面，影響分辨率）。常用的層析方法（1）凝膠層析（2）離子交換層析（3）親和層析（4）吸附層析（5）分配層析凝膠層析的應用范圍：凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。凝膠層析的優(yōu)點凝膠層析具有設備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學活性等優(yōu)點。目前已被廣泛應用于各種生化產品的分離和純化。－、凝膠層析的基本原理

凝膠層析的原理l分子大小不同混合物上柱；2洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內，大分子被排阻于顆粒之外；3大小分子分開：4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可自由地進出凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。凝膠過濾層析經常遇見的問題1．流速慢（1）有氣泡、出水管阻塞（2）沒打開夾子（3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣）2．拄內產生氣泡（1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流（2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊3．條帶扭曲（1）膠面不平（2）樣品或洗脫液中有顆粒（3）裝拄不均勻4．分辯率不高（1）裝拄不均勻（2）樣品量過大（3）流速太快（4）拄不垂直或拄不合適葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠能被微生物（如細菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物還是能在此凝膠液中和凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol／L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。凝膠層析的特點1．凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。2．分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100％。3．分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。

常用凝膠的結構和性質

凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）。1．葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學穩(wěn)定性，是目前生化產品制備中最常用的凝膠。G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l，3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷（見右式）Cl－CH2－CH－CH2為交聯劑將O鏈壯結構連接為三維空間的網狀結構的高分子化合物（下圖）葡聚糖凝膠網孔大小可通過調節(jié)交聯劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯度越大，網孔越小，吸水膨脹就越小。交聯度越小，網孔越大，吸水膨脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數字既代表交聯度，也代表特水量。X數字越小，交聯度越大，網孔越小，適用于分離低分子質量生化產品。X數字越大，交聯度越小，網孔越大，適用于分離高分子生化產品。X數字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。2．親脂性葡聚糖凝膠3．葡聚糖凝膠離子交換劑4．聚丙烯酰胺凝膠5．瓊脂糖凝膠（Sepharose）凝膠層析技術（一）凝膠的選擇與處理

選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質。

凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細和超細四類。顆粒越細，分離效果越好，因為它容易達到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平變寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應在150μm左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達到平衡，通常需要較長時間。較快的做法是將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結塊，然后放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個小時就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內部氣泡和殺菌作用。（二）裝柱一般選用細長的柱作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。

一般是在柱內先裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內，使其自然沉降。如此連續(xù)操作，可以得到一個均勻的柱床。柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)帶加寬，甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊。如裝柱時的操作壓力太大，會使凝膠床壓得太實，從而降低流速。層析柱

（a）自制簡易層祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龍網）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒溫水進口；5．恒溫水出口；6．可調節(jié)的塞子）

層析系統(tǒng)連接示意圖1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調蜾旋夾；6.自動收集器；7.核酸一蛋白質檢測儀

BS－100自動部分收集器安裝圈

1．反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10．收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺釘；13．自動開關；14、指示燈；15.電源開關；16．換向開關（逆、順）；17．手動開關新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。

新裝好的柱要檢驗其均勻性－可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。

（三）加樣

由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導致粘度增大，而使層析分辨率下降（下圖）。一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100mL床體積加樣品20～30mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。

樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使終濃度為1%.為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復性下降。整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜過快且要穩(wěn)定。冼脫液的成分也不應改變，以防凝膠顆粒的漲縮引起柱床體積變化或流速改變。在許多情況下可以用水作洗脫劑，但為了防止非特異吸附，避免一些蛋白質在純水中難以溶解（析出沉淀），以及蛋白質穩(wěn)定性等問題的發(fā)生，常采用緩沖鹽溶液進行洗脫。離子濃度至少0.02mol/L方可獲得較好的結果，因為凝膠含有少量羧基，會吸附少量陽離子而排斥少量陰離子。洗脫用鹽等介質應比較容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸銨等易發(fā)揮的物質用得較多。對一些吸附較強的物質也可采用水和有機溶劑（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物進行洗脫。（四）洗脫洗脫劑的流速對分離效果也有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線?？梢娸^快的流速下得到的冼脫峰也寬。流速低洗脫峰窄而高。也就是說，流速較低，分辨率較高，樣品稀釋較輕。

流速對洗脫曲線的影響

（五）凝膠的再生和保養(yǎng)在洗脫過程中，所有組分一般都可被洗脫下來，所以裝好柱后，可反復使用，無需特殊的再生處理。但多次使用后，凝膠顆粒可能逐漸沉積壓緊，流速變慢。這時只需將凝膠自柱內倒出，重新填裝?；蚴褂梅礇_法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床，這樣流速會有所改善。葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被微生物（如細菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物還是能在此凝膠液中和凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在